NAD⁺和NADH参与的多酶氧化还原体系是生物体细胞呼吸链中电子传递过程的主要生物氧化体系，糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分也都是通过这一体系完成的。NAD(H)是细胞能量代谢所必需的辅酶，其水平直接影响细胞节律、衰老、癌变和死亡等生命过程。

转录因子Rex可响应胞内氧化还原势能同时调节能量代谢和发酵。转录调控因子Rex在许多菌群内具有高度的保守性，首次在S. coelicolor中发现其为调节呼吸作用的相关因素，随后又发现其存在于耗氧、厌氧和兼性厌氧异生型革兰氏阳性菌中^[1-2]。在Streptomyces coelicolor (S. coelicolor)和Bacillus subtilis(B. subtilis)中，Rex是呼吸链中细胞色素bd末端氧化酶操纵子(cydABCD)表达及NADH脱氢酶基因表达的阻遏子^{[6, 12, 22]}。Staphylococcus aureus中的Rex可介导厌氧呼吸代谢和发酵过程中相关基因的转录，同时在Streptococcus mutans (S.mutans)，Enterococcus faecalis和Clostridium acetobutylicum(clostridia)中Rex参与胞内的氧化应激^[3-6]。

Rex作为转录调节因子，可结合到一段含反向重复的回文序列上。体外研究表明，NAD(H)、Rex与DNA三者之间具有相互作用的关系。更多结果显示NAD⁺/NADH竞争性与Rex结合，从而影响Rex与DNA结合活性，氧化态的NAD⁺不影响或者提高Rex-DNA结合活性，还原态的NADH与Rex亲和力较强且强抑制Rex与DNA结合，因此Rex对靶基因的阻遏活性可用于实时监测反应胞内NADH/NAD⁺的平衡。此外，DNA对Rex/NAD⁺的结合力具有一定程度的影响，例如，在Streptococcus中DNA存在时NAD⁺/Rex亲和力有一定提高^[4]。研究发现在所有菌株中NADH与Rex结合时均抑制Rex与DNA结合。

目前，需氧菌Thermus、Bacillus、Streptococcus和厌氧菌Thermo anaerobacter ethanolicus(T. ethanolicus)中Rex蛋白(T-Rex, B-Rex, S-Rex，RSP)结构已有较详细的研究，包括apo-form晶体，与辅因子、DNA结合的复合晶体^[7-10]。Rex是二聚体蛋白，每个单体存在两个核心域：C-端含一个Rossmann折叠结构的氧化还原感应区域的NAD[H]结构域；N-端是一个具翼螺旋的DNA结合区域。Rex蛋白C-端Rossmann折叠，与NAD⁺、NADH结合分别形成开式和闭合式构象。Rex与NAD⁺结合形成的开式构象提高或不影响Rex N-端与启动子区域的结合能力，而Rex/NADH闭合式构象阻止二者的结合^[9]。Apo-form和复合晶体的结构的解析为进一步在转录水平揭示Rex的调节机制提供了基础。本文以厌氧菌T. ethanolicus、兼性需氧菌B.subtilis和需氧菌Thermophilus、S. coelicolor中Rex的单体和复合体蛋白结构为例，总结了厌氧和需氧菌中蛋白结构的差异，并对其调控机制、功能及应用进行了详细的介绍。

1 Rex蛋白结构

Rex是一个保守家族蛋白，据进化统计发现，T-Rex和30多个Rex家族成员之间具有大于30%的序列相似性。据序列和Rex/NADH复合物结构比对分析发现T. aquaticus与T.termophilus中Rex具有一致性^[10-11]。然而，B-Rex与T-Rex结构有一定差距，氨基酸序列相似性为34%的同源性序列^[8-9]。本文以需氧菌T-Rex、B-Rex和厌氧菌RSP为例介绍说明其单体和复合体结构。

1.1 apo-form Rex蛋白结构

需氧菌株中，T-Rex及S-Rex中Rex晶体及辅因子共晶体结构已有详细研究。以T-Rex为例，Rex以同型二聚体的形式存在并发挥作用，每个单体由两个典型的结构域组成：N末端(N-terimal domain，NTD)结构域，含一个带双翼结构域的螺旋-扭转-螺旋类折叠结构(helix-turn-helix，WH)由α1-β1-α2-α3-β2-α4单元形成，为DNA结合区域；C端胞质(C-terminal domain, CTD)结构域含一个Rossmann折叠，用于吡啶核苷酸结合及亚基二聚体形成(图 1a)。Rex稳定性与C-端α-螺旋交换域有关。Rex两个单体间的C胞质末端α8螺旋相互交叉，同时与另一单体CTD的三个β折叠和NTD的α1与α4产生紧密的相互作用，保证了此二聚体的稳定性^{[9, 12]}。

据研究，B-Rex是一个不对称的二聚体(图 1b)，单体包含两个不同的区域，此两个区域通过一个5-氨基酸残基相连，N-端由4个α螺旋组成，其中α3用于结合DNA主要沟槽^[8]。B-Rex的两个N端以不同的方式向外延，远离核心区。B-Rex中DNA识别的α3螺旋指向远离DNA识别区导致其不能形成复合DNA晶体。B-Rex交换域的C端螺旋与T-Rex中的位置和功能相同。且，T-Rex和B-Rex的N端和C端的折叠、二聚体界面和主要残基仍位于保守区域。

厌氧菌中RSP功能及结构相继被解析^{[11, 13]}。由图 1c可知，RSP亦为二聚体，每个单体由两个结构域组成：N末端被折叠成4个α螺旋和两个小的β折叠；C端包含7个β折叠股和4个α螺旋。RSP二聚体两个单体C端片段α螺旋相互交叉，并与另一单体的NTD和CTD结构域紧密作用。RSP二聚体apo-form与RSP/NADH复合物都具有相似的闭式构像。与T-Rex和S-Rex二聚体重叠程度较高，但对应的结构仍具有一定的偏差。RSP中NTD和CTD结构域与B-Rex在某些残基片段可以很好地叠加。

1.2 Rex复合物的构象

需氧菌Thermus中T-Rex/ NAD⁺/ROP和厌氧菌T. ethanolicus中RSP/NAD⁺/TRR(ROP和TRR分别为Thermus和T. ethanolicus中Rex结合的反向重复序列)复合物结构呈开式构象(图 1d和图 1e)，其中，烟酰胺都以顺式构象与磷酸和氨基酸基团结合^{[4, 9, 12, 14-15]}。NAD⁺结合在Rex二聚体表面，腺苷部分残基结合在C末端与交换域间的P环上，烟酰胺部分与接近二聚体界面的疏水性口袋结合^[7]。NAD⁺与Rex结合对Rex构象变化无影响。需氧性复合物T-Rex/ NAD⁺/ROP中Rex两个亚基通过α螺旋分别与双链DNA片段结合，其CTD端仅与一分子NAD⁺结合导致复合物成为一个不对称晶体^[9-10]。由于T-Rex中NAD⁺结合的两分子较近导致两个带正电的烟酰环产生较强的静电斥力，同时Rex/NAD⁺侧链不对称的两个Phe189残基会提高静电斥力^[9]。X-射线衍射发现T-Rex与ROP结合形成一个边长约为70Å类似正三角形结构。其中，目标DNA是一个22bp的回文序列，通过对S. coelicolor和B. subtilis中调节子靶标基因位权重分析得到最小回文序列“TGTGAA” ^{[2, 16]}。由于NAD⁺所含的带电平面烟酰基团不能与B-Rex的疏水口袋结合，导致B-Rex与NAD⁺的结合能力极低。当DNA与B-Rex结合后构象发生变化才能提高Rex与NAD⁺能力，因此，B-Rex/ NAD⁺/ROP常作为过渡结构，所以此复合物结构并未进行深层次分析。

RSP/NAD⁺/TRR复合物中RSP二聚体与两分子NAD⁺结合，并与一段长为22bp双链DNA结合，其中有两个核苷酸悬在5′端。RSP/NAD⁺/TRR复合物中存在12Å距离去容纳两分子NAD⁺，所以NAD⁺间不会产生静电斥力。此外，与T-Rex中Phe189残基等价的Leu195残基对静电斥力影响不大，因而RSP复合物仍以对称的形式存在。厌氧型核苷酸序列与需氧型有一定的差异，比对发现AT/GC碱基对是唯一保守的最小回文序列结合位点^[17]。

NADH与Rex的结合位置与NAD⁺相同，因此二者存在竞争关系。T-Rex/NADH、S-Rex/NADH和RSP/NADH都呈闭式构像，而B-Rex/NADH复合物为不对称的伸展构象，两个NTD以不同的方式向外延伸远离二聚体核心。其中，Rex/NADH复合物中NADH均以反式构像的形式存在。T-Rex/NADH为紧凑二聚体，N末端包在CTD结合域下面。两分子NADH分别与T-Rex/NADH复合物的两个亚基的等价位点结合，但T-Rex/NADH复合物是不对称的，主要是由于T-Rex侧链Phe189为响应NADH会发生改变域间重排^[9-10]。RSP/NADH复合物也与两分子NADH结合仍保持对称性，是因为NADH与RSP的结合不会引起侧链Leu195残基发生域间重排。B-Rex/NADH复合物仍为不对称的二聚体，其中腺苷部分与Rex的结合不会导致结构的变化。在B-Rex/NADH复合物中，NADH仅与结合口袋的上方结合，导致N端固定同时引发C端构象变化锁定NADH结合。

2 Rex调控机制

还原态NADH可以解除Rex对基因的抑制^{[2, 4, 8, 10]}。氧化态NAD⁺与还原态NADH竞争性与Rex结合。需氧菌内，氧化态NAD⁺不影响或加强Rex与基因启动子区的结合^{[8, 18]}。厌氧菌T. ethanolicus中NAD⁺在一定浓度范围内对RSP/TRR结合活性基本没影响，但NAD⁺到达一定浓度将会抑制RSP/TRR特异性结合^[13]。

T. aquaticus中从DNA结合状态开始，NADH/ NAD⁺传感步骤如下：NAD⁺解离，NADH结合，同时Rex亚基旋转为NADH结合的最适构象；Tyr98与ASP188′结合形成成闭式状态，此外，二者的结合削弱并解开了Arg16和ASP188′之间的盐桥(Arg16与ASP188′结合形成开式状态)；由于WH结构域与DNA位点间的显著重叠，Rex复合物释放DNA，由此说明T-Rex与两分子NADH结合后，其NTD与双链DNA结构上存在立体冲突^[9]。此外，Phe189与NADH之间产生的氢键会进一步弱化Arg16-ASP188′盐桥。因此，DNA片段与Rex分离，反之亦然。Tyr98、Arg16、ASP188′和疏水Phe189在需氧型Rex家族都是相对保守的。Rex响应NADH/ NAD⁺的机制如图 2。

B-Rex与T-Rex响应机制不同点在于，带正电的NAD⁺与Rex的结合能力，当DNA与Rex形成复合物并引起蛋白构象变化，NAD⁺才能与Rex结合。NADH浓度增高时，Rex/DNA复合物的解离需要一个B-Rex/ NAD⁺/Rop复合物作为过渡状态，NADH的结合影响了Rex构象变化，使之不能与DNA结合。而其构象变化过程的分子机制需进一步探讨研究^[4]。

RSP中Arg20和Tyr102与T-Rex中Arg16和Tyr98等价，RSP中His194′替换T-Rex中ASP188′，但是His194′不与Arg20和Tyr102二者结合。T-Rex响应NADH/ NAD⁺的机制与需氧型T. aquaticu感受机制基本一致。RSP响应NADH/ NAD⁺主要是通过C端α8a/α8b螺旋、Ser198、Trp175′及Asn207等残基结合与解离实现的^[17]。

3 Rex蛋白的主要功能

研究发现，不同菌属中Rex识别不同的共有序列。经比对发现进化过程中，Rex结合位点仅保留了T/G5和A/C14两个对称位(dmitry)。Rex可通过响应NADH/ NAD⁺浓度调控新陈代谢，包括厌氧代谢，发酵，生物膜形成和压力胁迫等。NADH/ NAD⁺比率较低时，Rex可与启动子区结合，抑制目的基因表达。反之，目的基因正常表达。

3.1 Rex对碳和能量代谢的调控作用

NADH产生于糖酵解和柠檬酸循环，又可通过氧化磷酸化为机体提供能量。在有氧环境中，丙酮酸转化为乙酰辅酶A进入三羧酸循环，NADH的电子通过呼吸链将电子传递给外源氧分子，产生水并释放能量^[19]。因而，在耗氧微生物Rex可通过调节呼吸代谢中的酶的转录表达控制NADH/ NAD⁺比率。此外，Rex可通过响应NADH/ NAD⁺调节代谢途径中的关键酶，实现对碳代谢及其通量的调控。

在天蓝色链霉菌及枯草芽孢杆菌(S. coelicolor and B. subtilis)，呼吸链中的细胞色素bd末端氧化酶(CydABCD)、血红素合成酶及NADH脱氢酶(Ndh)的表达受Rex调控。细胞色素bd末端氧化酶是呼吸电子传递的中心酶复合物，对氧有很高的结合力，氧缺乏时可为氧化磷酸化和NAD⁺再生提供氧^{[2, 4, 8, 16, 20]}。NADH脱氢酶(Ndh)是呼吸链的重要组分，可催化NADH氧化及电子转移，同时在细胞膜表面产生质子动力^{[2, 4]}。在氧充足条件下，Ndh与Rex形成一个调控循环控制NADH/ NAD⁺比率。有研究者利用微矩阵研究，发现细菌从有氧过渡到微氧最后到无氧生长过程中，呼吸链协同基因包括细胞色素bd末端氧化酶(Cyd)、乳酸脱氢酶(Ldh)、乳酸通透酶(LctP)及甲酸-硝酸转运子诱导表达，且受抑制子Rex的调控^[4]。

细菌从有氧过渡到微氧最后到无氧生长过程中，糖酵解和发酵途径激活NADH被丙酮酸再氧化生成NAD⁺同时产生ATP。糖酵解激活可能是由于糖酵解过程中某些酶类被调控激活。研究发现，Thermotogales、Streptococcaceae和Clostridiaceae等菌属中存在受Rex调控的糖酵解酶(Gap，Pgk，Tpi等)，其中Gap和GapN两种酶类需要NAD和NADP作为辅助因子^[18]。例如，在有氧条件下，B. cereus和S. aureus中的葡萄糖经过三羧酸循环和糖酵解途径丙酮酸被氧化为CO₂和乳酸，伴随着NADH催化氧化为NAD^+[1]。此外，Rex可控制丙酮酸脱氢酶(pDhAB), 延胡索酸还原酶(frdC)和丙酮酸甲酸裂解酶(PflC)的表达，调控糖酵解的途径^[1]。

在厌氧条件下，菌株通过底物磷酸化和发酵将NADH氧化为NAD⁺伴随着ATP产生，同时部分丙酮酸被还原为乳酸。乳酸作为葡萄糖代谢的副产物，Rex通过控制进入乳酸途径的碳流，来调节用于厌氧和需氧环境的糖酵解中间产物^[18]。此外，厌氧菌株Clostridiaceae和Thermo anaerobacterales中Rex可通过铁氧还蛋白-NADP氧化还原酶(fnor)控制碳水化合物分解代谢途径^{[3, 13, 18]}。

3.2 Rex对发酵的作用

厌氧和兼性厌氧环境中，菌株通过糖酵解产生NADH，而NADH产生的还原能只能由发酵途径消耗，最终使胞内氧化还原势能达到平衡。研究发现，糖酵解及发酵相关基因(adhABE，ldh，pflBA，dhaT，bcd-hbd，butA)受Rex调控，发酵过程中会产生一些中间代谢产物如乙醇，乳酸，丙酮酸，乙酰-CoA及乙醛等。与电子传递链相比，发酵途径NADH氧化效率较低，因而发酵过程中酮、醛、酸等电子受体会增加，提高了细胞内的氧化还原平衡。例如，发酵过程中的乙醇代谢是一个可逆反应。催化氧化乙酰-CoA为乙醇的过程中，两分子的NADH在氧化成NAD⁺, 胞内势能达到平衡。此过程主要是由于还原力感应蛋白Rex能控制乙醇代谢过程中的关键酶醛脱氢酶(AdhE)和醇脱氢酶(AdhB)的转录^{[13, 15]}。

C. acetobutylicum中Rex可通过调控丁酸/丁醇合成基因以及丁酰-CoA(bcs)操纵子(crt, bcd, etfB, etfA和hbd)的转录调节胞内NADH/ NAD⁺水平。此外NADH/NAD⁺比率仍可通过C.acetobutylicum和Thermotogales等产氢维持胞内氧化还原平衡^{[3, 8, 11, 16-17, 21]}。

3.3 Rex对生物膜及氧胁迫的影响

生物膜可划分和分隔细胞和细胞器，并参与能量转化和细胞内通讯，同时，生物膜上还有大量的酶结合位点。Rex缺失导致葡糖转移酶(GtfB, -C, 和-D)的量和定位发生改变，尤其是GtfC表达异常导致葡聚糖结构发生改变，从而引起细胞膜发生变化。

氧胁迫和H₂O₂积累会影响胞内NADH/NAD⁺平衡，需氧菌可以利用呼吸代谢等途径消耗氧，而兼性厌氧菌和厌氧菌只能通过细胞保护酶类作用平衡胞内氧化平衡态。在氧应激时，S. mutans中Rex可直接转录调节部分细胞保护酶(NADH过氧化酶，Npr；NADH氧化酶Nox，烷基氢过氧化物AhpC和AhpF)，其中Nox，AhpC和AhpF可分别将O₂还原为H₂O和H₂O₂，伴随着NADH氧化为NAD⁺，而绝对厌氧菌clostridia中Rex间接调控中心代谢酶相关基因(ldh, adhE2, bcd-etfoBA, 和hbd)监控胞内NADH/NAD⁺比率^{[1, 3, 21-22]}。

3.4 Rex其他调控作用

胞内NADH/NAD⁺比率的平衡，不仅可以通过NADH氧化实现，还可通过从头辅因子合成及NADH和NADPH间的转氢作用提高NAD⁺浓度。Rex可调控吡啶辅因子代谢，主要是由于吡啶辅因子代谢相关基因(NAD合成基因nadABC和pncB-nadE以及吡啶核酸转氢酶基因pntAB)为Rex的靶基因^[22]。

Desulfovibrionales中Rex主要调控硫化氢还原酶类(Sat, PpaC, ApsAB, Adk, DsrABD)类来控制胞内氧化还原平衡，不能调控NAD[P]H依赖酶，因而不能控制NAD[P]H代谢途径的酶类^{[13, 23]}。

此外在枯草芽孢杆菌中，Rex仍可调控甲酸盐/亚硝酸盐转运体ywcJ ^{[10, 20]}。C. acetobutylicum和S. aureus中硝酸盐和亚硫酸盐还原基因(narK, asrABC和asrT)，硝酸盐/亚硝酸盐代谢基因(nar，nir，nas，hmp)的转录受Rex调控^{[3, 11]}。胞内产生毒素时，Rex通过调节乳酸脱氢酶(Ldh)控制毒素NO对S. aureus的影响^[11]。另外，在有氧条件下，蜡样芽孢杆菌Rex中可在转录后水平调控胞外蛋白细胞毒素^[24]。

3.5 Rex-NAD[H]氧化还原传感器的应用

基于Rex依赖于NADH/NAD⁺比率发挥调控作用的机制，Weber^[23]等构建了一种哺乳动物双传感器的转录控制系统，通过利用S. coelicolor中Rex与Herpes simplex中转录激活域VP16的融合，形成一个能与ROP结合并激活复合启动子的反式激活因子。此系统可通过报告基因rLuc表达量模拟哺乳细胞内营养物质的量及氧化还原状态^[23]。Yuzheng ^[26]等及Pun^[18]等将遗传编码荧光蛋白即环状排列荧光蛋白分别插入至B-Rex与T-Rex蛋白的两个单体间形成生物传感器，可特异性地与NADH结合并产生荧光变化，实现了对活体细胞中NADH的实时检测。此外，Bilan^[1]基于Yuzheng和Huang的研究进一步改造了此类生物传感器使其检测更为稳定和高效。

4 总结与展望

Rex具有调节基因转录的作用，其调节作用与辅酶NADH/NAD⁺相关。菌种差异导致Rex在菌体内调控的基因不近相同，但一般以阻遏子的形式存在。Rex可结合到一段含反向重复序列的回文序列上，但由于菌属不同结合位点存在差异。厌氧和需氧菌中Rex单独和复合物晶体结构解析发现Rex单体为二聚体复合物。Rex每个单体包含CTD、NTD两个结构域。厌氧和需氧菌中，Rex/NAD⁺/DNA复合物晶体为开式构象，NAD⁺被NADH替代时Rex/NADH复合物形成闭式构像，构象的变化导致DNA从Rex N-端解离。由于厌氧和需氧菌Rex晶体存在一定差异，NAD(H)和DNA与Rex作用有一定差别，但相同的是NADH可抑制Rex与DNA结合，减弱Rex的抑制作用。因此NADH/ NAD⁺比率较低时，Rex可与启动子区结合，抑制目的基因表达。反之，目的基因正常表达。在不同菌株中，Rex通过响应NADH/ NAD⁺浓度调控各类代谢，包括厌氧代谢，发酵，生物膜形成和压力胁迫等。

目前对于Rex家族晶体结构的报道还不完整，仍需对不同种族的晶体结构的解析，这有助于完整了解Rex的功能。Rex与生物体诸多生理过程相关，但仍不能形成体系，进一步深入研究可用构建调控或代谢网络奠定基础。同时，基于Rex与NAD(H)的响应机制制备的生物传感器目前应用范围较窄，还需进一步研发和利用。