2016, Vol. 36文章信息
- 朱雪瑞, 季静, 王罡, 马志刚, 杨丹, 金超, 李辰.
- ZHU Xue-rui, JI Jing, WANG Gang, MA Zhi-gang, YANG Dan, JIN Chao, LI Chen.
- 马铃薯不同组织的诱导分化及其对遗传转化效率的影响
- Influence on the Conversion Efficiency of Induced Differentiation of Various Potato Tissues
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(10): 53-59
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(10): 53-59
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161008
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文章历史
- 收稿日期: 2016-05-03
- 修回日期: 2016-05-24
2. 天津大学化工学院 天津 300072
2. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China
马铃薯现为我国第四大粮食作物[1]，近几年来对其的研究越来越多，马铃薯在工业领域的应用也越来越广泛，通过在植物体内调控基因合成酶或表达异源酶，改变其成分、结构并制造带有新理化特性的马铃薯，能够带来具有巨大的经济和环境效益[2-3]。目前利用基因工程方法探究基因在马铃薯中的功能以及改造马铃薯的性状备受关注，而优化的再生体系和高效的转化体系是实现马铃薯转基因的先决条件[4]。
不同品种马铃薯的基因型不同，细胞分化时培养基成分不同，对根癌农杆菌C58的敏感度不同，在遗传转化时会表现出明显的差异[5]。实验材料选取具有代表性的极早熟品种东农303、早熟品种早大白、中晚熟品种大西洋，三个品种均为普通四倍体栽培种，由于遗传背景的狭窄, 常规育种技术很难选育出满足多种用途的品种，且四倍体马铃薯的生长状态不易受控制，遗传也不稳定[6]，研究其再生体系具有相当重要的应用价值；不同植株、同一植株的不同基因型或者同一基因型的不同部位被诱导后产生愈伤组织的能力都是不同的，有时甚至会有显著差异[7-8]，所以各个品种的高效再生体系必须建立在最适试管苗组织以及最佳预培养、共培养的时间和激素之上。目前所研究的马铃薯再生体系，较多建立于叶片和茎段脱分化形成的愈伤组织[9-11]。愈伤组织再生体系扩繁量大, 可获得较多的转化植株, 外植体试材广泛, 多种组织均可诱导愈伤组织, 甚至分化程度较高的组织也能诱导出愈伤组织。但缺点是该再生体系获得的再生植株无性系变异较大, 转化的外源基因遗传稳定性较差。马铃薯为极其敏感的植株，减少再分化或者缩短愈伤组织阶段的时间会有较快的再生速率而且可以减少体细胞克隆的多样性[12]。直接分化再生体系获得再生植株的周期短, 操作简单[13-14], 由于未经脱分化的细胞直接分化芽, 因此体细胞无性系变异小, 能较好地保持受体植物的遗传稳定性, 转化的外源基因也能实现稳定遗传，其缺点是外植体细胞直接分化芽比诱导愈伤组织困难得多, 要使转化细胞直接分化成植株则更加难[15]。根癌农杆菌对不同品种的马铃薯转化条件有所差异，转化率也会不同，因此转化条件也是保证马铃薯转基因高效进行的基础。实验对试管薯薄片直接分化成不定芽和茎段产生愈伤组织的两种分化方式，在三种栽培种的试管苗中验证转化效率[16-18]，寻求各个品种最适的离体组织所对应的高效再生体系和最优转化条件。首先对东农303、早大白、大西洋试管薯和茎段的再生体系进行筛选及优化，以根癌农杆菌C58的最佳侵染转化方式为定量探讨三个品种不同分化方式的转化效率，从而建立转基因马铃薯的最优转化体系，为后续的基因转化以及基因功能验证奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 试管苗的扩繁以及试管薯的诱导将2~3cm的试管苗带腋芽的茎段竖插于基本培养基(MS+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8)中，培养条件：22℃，2 000Lx，16h/d。苗龄28~35d的试管苗即可用于实验。试管薯的诱导:将试管苗接入液体培养基(MS+3%蔗糖，pH5.8)，22℃，2 000Lx下培养30d后换诱导薯培养基(MS+8%蔗糖+1.5 g/L活性碳+1mg/L NAA)，暗培养6~8周。
1.2 试管苗茎段以及试管薯薄片再生体系的建立以MS为基本培养基(同1.1), 附加不同种类和不同浓度的激素设计三因素三水平的正交试验表。分别将试管苗茎切成2~3cm茎段、试管薯切成半径为5mm，厚度为1~2mm的薄片平铺于对应的培养基上进行离体培养, 培养条件：22℃，2 000Lx，16h/d，建立茎段和试管薯相应的再生体系。
1.3 不定芽的生根培养以MS为基本培养基(同1.1)，在此基础上添加不同浓度的矮壮素(CCC)(0、25、50、75、100mg/L)，将试管苗茎段以及试管薯薄片诱导分化后产生的不定芽，切成4~5cm的长度竖插入培养基中进行生根培养，培养条件：22℃，2 000Lx，16h/d，建立不定芽的生根体系。
1.4 抗生素敏感性实验以MS为基本培养基(同1.1)，在附加不同浓度抗生素的培养基上，对不同植株的不同组织进行敏感性试验测定。将茎段、试管薯薄片和不定芽分别置于附加不同浓度的卡那霉素(Kana)(0、25、50、75、100、120、140mg/L)和头孢霉素(Cef)(0、250、500、750mg/L)的培养基上, 培养条件：22℃，2 000Lx，16h/d, 定期观察记录外植体褐变的情况。
1.5 农杆菌侵染实验农杆菌侵染详细见文献[19]。本实验所用载体为本实验室(天津大学遗传工程研究所)保存的植物双元表达载体pCAMBIA2300, 具有卡那霉素抗性基因的质粒图谱(图 1)。本实验所用根癌农杆菌菌株为实验室保存的C58菌株，含有pCAMBIA2300-LcLYCB质粒。
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| 图 1 pCAMBIA2300-LcLYCB载体 Figure 1 The map of pCAMBIA2300-LcLYCB vector |
待转化组织的再生不定芽长出3~4片叶时，剪取叶片，用CTAB法提取DNA，以野生型试管苗的基因组DNA为阴性对照，植物表达载体质粒为阳性对照，利用Kana抗性基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)的两个特异引物(表 1)进行PCR扩增。
| 引物名称 | 引物序列 |
| NPTII-F | 5′-GCTATGACTGGGCACAACAG-3′ |
| NPTII-R | 5′-AAGGAGCACGAAATGCCATA-3′ |
将利用抗性基因NPTII检测出的阳性植株，以野生型试管苗的基因组DNA为阴性对照，植物表达载体质粒为阳性对照，利用基因LYCB的两个特异引物(表 2)，对目的基因番茄红素β-环化酶基因(LYCB)进行PCR扩增，检测阳性植株，得到最终的阳性植株并计算转化率。
| 引物名称 | 引物序列 |
| LYCB-F | 5′-ATGGATACTTTGTTGAAAACCCCAA-3′ |
| LYCB-R | 5′-TTATTCTGAATCCTGTAACAAATTGTTGA-3′ |
2 结果与分析 2.1 试管苗的扩繁以及试管薯的诱导
在黑暗条件下诱导试管薯，处理7d后叶柄基部出现芽端膨大，3~4周后，明显看到鲜绿色试管薯的形成，继续培养一段时间后，薯块膨大逐渐成熟变白(图 2)，可用于侵染试验。1mg/L的NAA诱导的结薯率最高，薯块质量最优，其中大西洋结薯量最高达95%，结薯量大、薯块较小；早大白薯块较大、结薯量不占优势，结薯量为60%；东农303结薯量仅有50%。
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| 图 2 试管薯 Figure 2 Microtuber |
据正交试验的结果表明，茎段一般在25d左右形成愈伤组织，其中大西洋和早大白的最佳愈伤组织培养基为MS+0.1mg/L NAA+3mg/L 6-BA，大西洋的愈伤组织诱导率最高，为90%，形成愈伤组织的茎段多，增殖速度快，愈伤颜色透亮，细胞结构呈小米粒状且致密；早大白几乎所有茎段都产生愈伤组织，但褐变速度最快；东农303的最佳愈伤组织培养基MS+0.2mg/L NAA+5mg/L GA+2mg/L 6-BA；其愈伤组织最大，呈绿色，质地致密，增殖速度最快，但未产生愈伤组织的茎段较多(表 3)。将诱导的愈伤组织转移到再分化培养基上，三个品种的最佳再分化培养基均为MS+1.0mg/L 6-BA+1.5mg/L IAA +2mg/L ZT (表 4), 再分化为植株的最高效率均为80%，得到的试管苗茎段粗壮，叶片呈绿色(图 3)。由试验数据可得：大西洋、早大白、东农303茎段愈伤再生体系的分化效率分别为76.5%、59.5%、72.25%。
| 序号 | 6-BA(mg /L) | NAA(mg /L) | GA(mg /L) | 大西洋愈伤率 | 早大白愈伤率 | 东农303愈伤率 |
| 1 | 1.0 | 0.1 | 0.0 | 30% | 30% | 40% |
| 2 | 1.0 | 0.2 | 5.0 | 40% | 40% | 50% |
| 3 | 1.0 | 0.3 | 10.0 | 35% | 35% | 50% |
| 4 | 2.0 | 0.1 | 0.0 | 65% | 65% | 40% |
| 5 | 2.0 | 0.2 | 5.0 | 80% | 70% | 70% |
| 6 | 2.0 | 0.3 | 10.0 | 80% | 70% | 70% |
| 7 | 3.0 | 0.1 | 0.0 | 90% | 85% | 55% |
| 8 | 3.0 | 0.2 | 5.0 | 75% | 75% | 60% |
| 9 | 3.0 | 0.3 | 10.0 | 80% | 80% | 60% |
| 序号 | 6-BA(mg /L) | IAA(mg /L) | ZT(mg /L) | 大西洋再分化效率 | 早大白再分化效率 | 东农303再分化效率 |
| 1 | 1.0 | 0.5 | 1.0 | 70% | 70% | 70% |
| 2 | 1.0 | 1.0 | 1.5 | 80% | 80% | 80% |
| 3 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 80% | 80% | 80% |
| 4 | 2.0 | 0.5 | 1.0 | 65% | 65% | 65% |
| 5 | 2.0 | 1.0 | 1.5 | 60% | 60% | 60% |
| 6 | 2.0 | 1.5 | 2.0 | 65% | 65% | 65% |
| 7 | 3.0 | 0.5 | 1.0 | 50% | 50% | 50% |
| 8 | 3.0 | 1.0 | 1.5 | 50% | 50% | 50% |
| 9 | 3.0 | 1.5 | 2.0 | 50% | 50% | 50% |
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| 图 3 茎段愈伤分化 Figure 3 The picture of stem callus differentiation |
试管薯薄片直接分化出不定芽一般需要10d左右，三种试管薯的最佳分化培养基均为MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA +2mg/L ZT (表 5), 但分化效率和不定芽长势有些许差异。大西洋和早大白直接分化为不定芽的效率均可达到100%，东农303可达到90%的分化率。其中大西洋和东农303产生不定芽的速度较快，再生率高，芽段深绿色，茎段粗壮，在顶端有开始分化成叶片的趋势(图 4)；早大白在后期长势较弱，茎段黄绿色，再生率低。
| 序号 | 2, 4-D(mg /L) | IAA(mg /L) | ZT(mg /L) | 大西洋分化率 | 早大白分化率 | 东农303分化率 | 不定芽状态 |
| 1 | 1.0 | 0.0 | 1.0 | 35% | 30% | 20% | 浅绿，细弱 |
| 2 | 1.0 | 1.0 | 2.0 | 100% | 100% | 90% | 深绿，粗壮 |
| 3 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 100% | 100% | 85% | 深绿，粗壮 |
| 4 | 2.0 | 0.0 | 1.0 | 70% | 55% | 55% | 浅绿，细弱 |
| 5 | 2.0 | 1.0 | 2.0 | 85% | 80% | 85% | 深绿，粗壮 |
| 6 | 2.0 | 2.0 | 3.0 | 75% | 80% | 75% | 深绿，粗壮 |
| 7 | 3.0 | 0.0 | 1.0 | 50% | 40% | 40% | 浅绿，细弱 |
| 8 | 3.0 | 1.0 | 2.0 | 95% | 90% | 75% | 深绿，粗壮 |
| 9 | 3.0 | 2.0 | 3.0 | 90% | 90% | 75% | 深绿，粗壮 |
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| 图 4 试管薯的直接分化 Figure 4 The picture of microtuber direct differentiation |
将由茎段和试管薯分化诱导产生的不定芽移植到生根培养基后，一般10d即可看到明显的不定芽生根现象(图 5)，在所配置的培养基中均可生根，但是当矮壮素浓度为50mg/L时，不定芽生长较快且成苗粗壮，颜色深绿；浓度低时，长势较弱，成苗黄绿色；浓度过高时，虽成苗健康，但会出现抑制其长高的现象，不利于后期的试管苗扩繁。从试管苗长势和扩繁两项工作上讲，选取矮壮素浓度为50mg/L的MS培养基最为合适。
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| 图 5 不定芽的生根 Figure 5 Rooting of adventitious buds (a) Primary root (b) Anaphase root |
将三种栽培种野生型的茎段、试管薯薄片接种在不同浓度Kana的选择培养基上, 一月后观察褐变情况。茎段和试管薯薄片在较低浓度的Kana培养基上生长几乎不受影响, 在较高浓度的Kana培养基上全部褐化致死，结合试验结果的褐化率最终采用茎段和试管薯薄片再生体系的卡那霉素筛选浓度分别为75mg/L、100mg/L。而对于不定芽生根的研究中，发现当卡那霉素浓度达到50mg/L时，成苗的茎段大多数黄化，而浓度至75mg/L时, 基本上都发生黄化。据此结果，本实验认为生根体系的卡那霉素筛选浓度可采用75mg/L。
2.3.2 头孢霉素敏感性试验实验选择Cef作为抑菌性抗生素，低浓度Cef并不抑制植物细胞正常生长, 能使茎段和试管薯薄片正常诱导分化出不定芽, 较高浓度时则会抑制植株的生长，在诱导阶段Cef选择压在500mg/L时即可达到较好抑菌效果。在生根培养时，当浓度采用250mg/L时，不定芽开始出现玻璃化的现象，当浓度采用500mg/L时，不定芽出现玻璃化的现象非常严重，导致试管苗不能正常生长。据试验结果，选取头孢霉素为250mg/L的培养基较为合适。
2.4 农杆菌侵染条件根癌农杆菌对不同的植株的侵染条件不同，其中经过预试验的体系摸索后发现，在农杆菌OD600=0.5, 茎段侵染时间10min，试管薯薄片侵染时间5min时侵染效果最好。菌液浓度过高或侵染时间过长在共培养时农杆菌不易被控制，从而导致植株死亡；而菌液浓度过低或侵染时间过短则转化效率较低。另外，经试验验证，暗培养3d最为合适，另外，为了保证外植体能够持续吸收营养物质和外源激素的有效性，应当10d换一次新鲜培养基。
2.5 PCR检测利用PCR检测在抗性条件下成活的转基因植株，先检测796bp的选择标记基因NTPII，得到PCR条带(图 6)，再对1 259bp的目的基因LYCB进行检测，得到PCR条带(图 7)，经过筛选基因和目的基因的筛选，得到阳性植株。根据各个品种得到的阳性植株数目计算两种组织分化方式的转化率，在茎段愈伤再生体系中，大西洋、早大白和东农303的转化率分别为28%、35%、36%；在试管薯直接分化再生体系中所对应的转化率分别为17%、45%、43%。由此转化效率，可以说明，在进行转基因操作时，大西洋适合用茎段作为试验转化组织，而早大白和东农303则更适宜于采用试管薯作为转化组织。
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| 图 6 基因NPTII的PCR Figure 6 Gene NPTII band |
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| 图 7 基因LYCB的PCR Figure 7 Gene LYCB band |
马铃薯试管苗在组培瓶内培养时容易产生玻璃化的现象，玻璃化的产生与很多原因有关：外植体、光照、温度、营养物质等，外植体包括种类、取材部位、及外植体大小等方面的影响，这些因素均会显著影响玻璃苗的发生。在外植体培养过程中发现, 顶芽与幼叶叶片更易发生玻璃化, 试管苗茎段小于0.5cm时容易发生玻璃化，较大外植体不易发生玻璃化可能是由于其分生组织距离培养基表面较远, 从而使组织生长环境的水分状况得到改善，可在一定程度上减少其玻璃化苗的产生[20]；试管薯再生芽出现玻璃化的概率很低，可能是由于试管薯薄片本身含有的营养物质会提供其生长的所需环境，从而利于植株再生且再生植株茎秆绿壮，在此试验中，通过加入矮壮素改善植株玻璃化现象，效果明显(图 8)。
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| 图 8 试管苗 Figure 8 Test-tube plantlet (a) Normaltest-tube plantlet (b)Glass transitiontest-tube plantlet |
在农杆菌侵染转化时，外植体的选择对转化成功与否也有着决定性的作用，其中茎段与菌液的接触面积较小，自身缺少提供生长的物质；而试管薯薄片作为受体材料伤口面积大，薯块本身含有较高含量的酚类物质，有助于农杆菌的侵染和转化[21-22]。试管薯作为试验材料不需要进行预培养，仅需要直接分化培养基且分化周期短。即使试管薯薄片具有众多的优势，但不同品种马铃薯的基因型不同，马铃薯的转化体系也就存在很大的差异，在试验中研究的大西洋和早大白对于采用试管薯作为转化组织具有较高的转化效率，而对于东农303则需要采用茎段作为转化组织。不同品种的马铃薯基因型不同，所对应的再生体系也不相同。同种培养基可能使不同品种产生愈伤组织的效率不同，也可能产生愈伤组织的状态不同[23]。证明，由于基因型而产生的受体系统的差异是存在的。转化效率与转化体系呈正相关，同时也具有基因型依赖性的特点, 具体依赖性程度还需进一步研究。
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