干旱，低温以及盐碱等非生物胁迫严重影响着植物的生长发育及作物产量，因此，植物进化出一系列的代谢响应及防御机制来应对不利的外界环境因素。逆境胁迫诱导了特异基因的表达，胚胎晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白)就是植物在逆境胁迫下诱导产生的具有保护细胞免受伤害、维持植物体基本代谢活动的一类应激蛋白。

LEA蛋白最早发现于棉花发育后期的子叶中^[1]，之后陆续在大麦、玉米、拟南芥、大豆等植物中检测到LEA蛋白^[2-4]。LEA蛋白基因数目众多，是一类大的基因家族，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有51个成员^[5]，毛果杨(Populus trichocarpa)中有53个^[6]，水稻(Oryza sativa)中有35个^[5]。多数LEA蛋白的分子质量较小，大约在10~30 kDa之间，具有高度的亲水性和热稳定性，在煮沸时也能保持水溶状态^[2]，LEA蛋白的高度亲水性能够使植物在干旱等胁迫下维持膜的稳定性，同时保护蛋白质的结构和功能，使植物免受胁迫伤害^[7-8]。

LEA蛋白不仅在种子发育后期大量积累，在根、茎、叶和花等其他组织中也有表达，在受到胁迫时也会被迅速诱导^[8-9]。大量研究表明，LEA蛋白在植物抵御干旱、高温、高盐等逆境胁迫过程中发挥着重要作用，在植物中过量表达LEA基因，能够增强转基因植物对多种非生物胁迫的抗性。早在1996年，Xu等^[10]将大麦HAV1基因转入水稻中表达，增强了转基因水稻对干旱和盐的耐受能力，这是第一个转化后成功增强植物抗性的LEA基因。在拟南芥中异源表达月季RcLEA基因后，转基因拟南芥对高温和低温胁迫的抵抗能力显著增加，同时CAT酶的活性增强，电解质渗漏率降低^[11]。组成型过量表达谷子SiLEA14基因，增强转基因谷子和拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性^[12]。AtLEA14基因明显增强了拟南芥对干旱的抵抗能力，并提高了拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率及根长^[13]。

柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii Kom.)属于豆科锦鸡儿属植物，广泛分布于中国西北荒漠和半荒漠地区，具有极强的抗逆性和适应性，对生态环境的维持起到重要的作用，同时还具有较高的饲用价值，是西北地区重要的饲料来源^[14-15]。本实验室前期从柠条锦鸡儿干旱胁迫下抑制性削减杂交文库中筛选得到CkLEA1基因，并利用实时荧光定量PCR技术研究发现CkLEA1受干旱、盐、碱、冷、热、ABA等不同胁迫处理的诱导，推测其与柠条锦鸡儿逆境胁迫响应机制有关^[16-17]。本研究在此基础上构建了柠条锦鸡儿CkLEA1基因过表达载体并转化野生型拟南芥，对转基因拟南芥抗逆性进行分析，进一步研究CkLEA1基因的功能，以期为改善和提高木本植物的抗逆性提供理论支持，同时为植物抗逆育种提供有效的基因资源。

1 材料与方法 1.1 植物材料、质粒及菌株

柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii Kom.)种子采自内蒙古赤峰市，野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.) Columbia-0生态型(Col-0)由本实验室保存，植物表达载体pCanG-HA由中国科学院遗传与发育研究所谢旗研究员惠赠，该载体含有卡那霉素抗性基因NPT Ⅱ，大肠杆菌DH5α及农杆菌GV3101由本实验室保存。

1.2 植物表达载体构建

根据植物表达载体pCanG-HA的多克隆位点设计含有Sal I和Sac I酶切位点的特异性引物，取1个月苗龄柠条锦鸡儿叶片和茎的cDNA为模板，以特异性引物CkLEA1-F1(5′-GCgtcgacTTCAAATCACTAATGGCTCG-3′，下划线为Sal I酶切位点)和CkLEA1-R1(5′-GCgagctcGTTTAAATAGAATGCAATATTTCTTA-3′，下划线为Sac I酶切位点)进行PCR扩增，反应程序为：98℃预变性3 min，98℃变性15 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃补充延伸5 min，30个循环。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生物公司)回收目的片段，插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中(北京全式金生物公司)，将测序验证后的序列通过Sal I和Sac I(Thermo公司)酶切位点连入由CaMV35S驱动的植物表达载体pCanG-HA中，进行菌落PCR及双酶切验证，将验证正确的重组质粒电转化农杆菌GV3101，挑取阳性克隆，进行PCR鉴定。PCR引物合成及产物测序由上海生工生物公司完成。

1.3 拟南芥遗传转化及纯合体筛选

通过浸花法将重组植物表达载体pCanG-CkLEA1转入野生型拟南芥^[18]，并将收取的种子种在含有25 mg/L卡那霉素的1/2 MS培养基上筛选阳性植株，提取T₃代转基因植株总RNA，反转录成cDNA，利用特异性引物CkLEA1-F1和CkLEA1-R1对转基因植株进行RT-PCR鉴定。通过实时荧光定量PCR对CkLEA1在转基因株系中的表达量进行检测，利用LightCycler 480实时荧光定量PCR仪(Roche公司)进行扩增。反应体系为: SYBR PremixEx Taq(TaKaRa公司)10 μl，稀释的cDNA模板5 μl，上、下游引物各0.4 μl(10 μmol/L)，DEPC处理的水4.2 μl。反应程序为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40个循环。所用引物为CkLEA1-F2(5′-GGCAACTTCACCATTCCTCTTT-3′)和CkLEA1-R2(5′-CTAGGCCACCCAAAATTCACA-3′)，内参引物为AtEF1α-F(5′-AGAAGGGTGCCAAATGATGAG-3′)和AtEF1α-R(5′-GGAGGGAGAGAGAAAGTCACAGA-3′)，基因表达量以2^-ΔCT法计算，选取3株表达水平较高的株系进行后续表型实验。

1.4 胁迫处理下萌发率分析

拟南芥种子经75%乙醇灭菌10 min后，用含有0.05% Tween-20的100%乙醇继续灭菌10 min，待种子晾干后分别种在含有不同浓度NaCl和甘露醇(mannitol)的1/2 MS培养基平板上，每个株系各55颗种子，4℃同步化处理3 d后，将平板取出置于22℃，16 h光照/8 h黑暗条件下培养，每天同一时间统计萌发率。

1.5 转基因拟南芥干旱处理

将野生型和CkLEA1转基因株系种在育苗盘中，每孔各30株幼苗，正常生长条件下(22℃，16 h光照/8 h黑暗)培养2周后，停止浇水进行干旱处理。10 d后观察表型变化，复水3 d后统计存活率。

1.6 脱水处理生理指标检测

失水率检测：剪取正常条件下生长4周大的拟南芥植株地上部分，立即称重并记录，之后放置于温度为22℃，湿度为60%~70%的植物培养室中，每隔1 h称重一次，共统计10 h。

MDA(丙二醛)、SOD(总超氧化物歧化酶)和GSH(谷胱甘肽)含量检测：剪取正常条件下生长3周大的拟南芥植株地上部分，放置于滤纸上，在温度为22℃，湿度为60%~70%的植物培养室中进行脱水处理5 h，以未处理的新鲜植株作为对照。SOD、MDA、GSH测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，检测方法按照试剂盒说明书进行。

2 结果与分析 2.1 pCanG-CkLEA1植物表达载体的构建

利用特异性引物CkLEA1-F1和CkLEA1-R1扩增长度为300 bp的CkLEA1编码区(图 1a)，连接到pEASY-Blunt Simple克隆载体中，测序正确后用Sal I和Sac I双酶切连接到pCanG-HA表达载体。将构建好的重组表达载体pCanG-CkLEA1转化大肠杆菌并进行菌落PCR验证(图 1a)，提取验证正确的菌落质粒用Sal I和Sac I双酶切鉴定，能够切出目的片段，表明载体构建成功(图 1a)，构建好的载体图谱见图 1d。

2.2 CkLEA1转基因纯合体植株鉴定

通过农杆菌介导的浸花法将重组植物表达载体pCanG-CkLEA1转入野生型拟南芥^[18]，筛选出具有卡那霉素抗性的阳性植株7株，提取这些株系的RNA并合成cDNA，利用特异性引物CkLEA1-F1和CkLEA1-R1进行RT-PCR鉴定，结果如图 2a所示，以野生型拟南芥cDNA做的阴性对照没有扩增出目的条带，柠条锦鸡儿cDNA做的阳性对照有单一条带，在7个转基因株系中均扩增出目的条带，表明CkLEA1在各转基因株系中都有表达。同时利用实时荧光定量PCR检测CkLEA1在转基因株系中的表达水平(图 2b)，选取表达量较高的3个株系OE-26、OE-27和OE-38进行后续表型检测实验。

2.3 CkLEA1转基因拟南芥种子萌发阶段抗逆性检测

将野生型和3个转基因株系种在含有0或200 mmol/L NaCl、400 mmol/L mannitol的1/2 MS培养基中，观察各株系萌发变化。在1/2 MS培养基中，转基因株系和野生型的萌发率相近，没有明显的区别(图 3a)。而在含有200 mmol/L NaCl或400 mmol/L mannitol的1/2 MS培养基中，3个转基因株系的萌发率均高于野生型(图 3a和图 3b)，说明CkLEA1异源表达后提高了拟南芥种子萌发阶段对盐和渗透胁迫的耐受能力。

2.4 CkLEA1转基因拟南芥耐旱能力检测

正常生长2周大的野生型拟南芥和转基因株系在表型上没有区别，干旱处理10 d后，野生型叶片失水卷曲，萎蔫严重，而3个转基因株系表现出比野生型更强的耐旱性，萎蔫程度低于野生型。复水3 d后统计植株存活率发现，转基因株系的存活率显著高于野生型，野生型存活率为34.4%，3个转基因株系OE-26、OE-27、OE-38的存活率分别是98.3%、92.8%、95.3%，说明CkLEA1异源表达后增强了拟南芥幼苗生长阶段对干旱的耐受性(图 4)。

2.5 脱水处理CkLEA1转基因拟南芥生理指标检测

剪取生长4周大的野生型和转基因拟南芥地上部分进行失水率检测，如图 5a所示，转基因株系失水率低于野生型。脱水处理0、5 h时取样检测MDA含量，结果如图 5b所示，脱水处理前，转基因株系的MDA含量均低于野生型植株，OE-38达到显著水平，胁迫处理后，各株系MDA含量均升高，但转基因株系的含量均低于野生型，说明过量表达CkLEA1减少了拟南芥中MDA的生成，降低了膜脂过氧化程度。而SOD酶活性和GSH含量检测结果发现，脱水处理前后转基因株系SOD酶活性和GSH含量均高于野生型(图 5c、图 5d)，且脱水处理5 h后3个转基因株系的SOD酶活性和GSH含量均显著高于野生型。以上结果说明CkLEA1异源表达后，使转基因拟南芥有更高的SOD酶活性，积累了更多的GSH，减少了脱水胁迫引起的氧化损伤，从而提高了拟南芥对脱水胁迫的抗性。

3 讨论

LEA基因提高植物抗逆性的可能机制包括:第一，通过氢键与水分子、糖类结合，作为脱水保护剂，捕获更多的水分到细胞内，结合各种金属离子、活性氧等，清除活性氧自由基，保护细胞免受胁迫伤害；第二，通过与细胞膜结合，维持膜的稳定性和完整性；第三，通过分子伴侣的作用对错误折叠的蛋白质进行组装和修补，保护蛋白的活性以及通过分子屏障作用，在细胞质中起到隔离作用，减少蛋白的累积，保护乳酸脱氢酶、延胡索酸酶和硫氰酸酶等各种酶的活性^[19-21]。

CkLEA1基因能够受干旱、盐、碱、冷、热和ABA等不同胁迫处理的诱导，其中干旱和盐处理下的诱导最为显著^[17]，因此推测CkLEA1可能与植物响应渗透胁迫机制有关，尤其是与干旱胁迫密切相关。检测NaCl和mannitol处理下种子的萌发率发现，转CkLEA1基因拟南芥的萌发率明显高于野生型，这一结果与Zhao等^[22]对拟南芥AtLEA3-3在NaCl和mannitol处理下的种子萌发率结果一致。胡椒CaLEA1基因在拟南芥中异源表达后在NaCl处理下的种子萌发率也高于野生型^[13]。

干旱处理后，转基因植株的存活率显著高于野生型，并且失水率低于野生型，说明CkLEA1增强了拟南芥对干旱胁迫的抵抗能力。植物在干旱胁迫下，体内活性氧的大量产生会导致细胞膜受到氧化损伤，MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，因而常被用作检测膜脂过氧化的指标，通过检测MDA的含量可以测定细胞膜受损程度及植物的抗逆性^[23]。本研究发现，3个转基因株系的MDA含量在脱水处理前后均低于野生型，说明CkLEA1异源表达后，使拟南芥积累了较少的MDA，膜脂过氧化程度更低，抗旱性更强。这一结果与玉米ZmLEA3基因在烟草中异源表达后的研究结果相似，ZmLEA3不仅提高了烟草的抗旱性，还提高了抗氧化能力，MDA含量也低于未转化的烟草^[24]。

植物在受到非生物胁迫后还可以通过抗氧化酶防御系统来保护自身免受伤害，包括SOD、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和GSH。SOD的作用是将O₂^-歧化为H₂O₂和O₂，CAT、POD和GSH等会参与将H₂O₂分解为无害的水^[25-26]。本实验中，CkLEA1转基因拟南芥中SOD活性和GSH含量在脱水处理前高于野生型，脱水处理5 h后SOD酶活性和GSH含量均增加，并且都显著高于野生型。Liu等^[27]将多毛番茄ShDHN基因在番茄中过量表达后，提高了番茄对干旱胁迫的耐受性，同时在干旱胁迫下SOD酶的活性增强，MDA含量降低。Hara等^[28]发现柑橘脱水素基因CuCOR19可以通过清除活性氧自由基来保护膜系统，提高转基因烟草对冷胁迫的耐受力。根据以上结果，我们推测，CkLEA1基因在拟南芥抵抗脱水胁迫过程中，通过作为活性氧清除蛋白，减少活性氧的产生，降低脱水胁迫引起的氧化损伤，从而提高植物的抗旱性。