2016, Vol. 36文章信息
- 叶慧华, 胡蝶, 李闯, 程建青, 邓超, 邬敏辰.
- YE Hui-hua, HU Die, LI Chuang, CHENG Jian-qing, DENG Chao, WU Min-chen.
- 新型菜豆环氧化物水解酶的异源表达及对映归一性催化特性
- Expression of a Novel Epoxide Hydrolase from Phaseolus vulgaris and Its Enantioconvergent Catalytic Performance
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(10): 21-27
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(10): 21-27
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161004
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文章历史
- 收稿日期: 2016-04-05
- 修回日期: 2016-04-25
2. 生物工程学院 无锡 214122；
3. 无锡医学院 无锡 214122
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;
3. Wuxi Medical School, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
手性环氧化物或邻二醇是一类高附加值的多功能合成子，可用于药物、精细化学品、农药和功能性材料等的合成[1]。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases, EHs)能催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇[2]。目前报道了约40种对映选择性高的EHs (对映选择率E值 > 30)，主要用于环氧化物的水解动力学拆分，但理论产率仅为50%[3]。
与水解拆分不同，对映归一性水解的理论产率可达100%[1]。对映归一性水解制备手性邻二醇有三种途径：(1) 对映和区域选择性高且互补的两种EHs联合催化。Lin等[4]将源自Streptomyces globisporus和Streptomyces carzinostaticus的两种EHs共催化外消旋环氧苯乙烷(SO)归一性水解，(R)-苯乙二醇(PED)的产率和纯度分别为87%和99% e.e.p。(2) 生物酶法和化学酸法串联催化。Orru等[5]利用Nocardia sp.胞内对映和区域选择性高的EH攻击一种对映体中取代基少的β-碳原子，构型保留；再用硫酸催化残留的另一种对映体水解，攻击发生在取代基多的α-碳原子上，构型反转。(3) 区域选择性高且互补的单一EH催化。Kotik等[6]利用表达最优AnEH突变酶H:12-A1的E. coli全细胞催化(R, S)-SO对映归一性水解，(R)-PED的纯度为70.1% e.e.p。
本研究借助序列搜索和比对在线工具Blast，在菜豆基因组中查找与植物EHs基因同源性高的未知功能序列，推测该序列是一种编码菜豆EH (PvEH1)的基因pveh1。采用RT-PCR扩增pveh1，将其在E. coli BL21(DE3)中表达。借助生物学软件分析PvEH1的一级和三维结构。以(R, S)-SO为底物，测定PvEH1的对映选择率E值；分别以(S)-和(R)-SO为底物，测定其区域选择性系数αS和βR。
1 材料与方法 1.1 菌株、质粒和培养基E. coli JM109和BL21(DE3)及表达质粒pET-28a(+)购自Novagen公司；克隆质粒pUCm-T购自上海Sangon公司；LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和NaCl 10 g/L，pH 7.2。
1.2 试剂RNA PCR Kit Ver. 3.0、rTaq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA和蛋白质markers购自大连TaKaRa公司；UNIQ-10 Trizol总RNA抽提试剂盒和SanPrep DNA胶回收试剂盒购自上海Sangon公司；(R, S)-SO购自上海TCI公司；(S)-SO、(R)-SO、(S)-PED和(R)-PED购自上海安耐吉公司；其他试剂均为分析纯。手性气相色谱柱CYCLOSIL-B (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)为美国Agilent科技公司产品。
1.3 引物设计源自绿豆的两种EHs (VrEH1和VrEH2)能催化环氧化物对映归一性水解[7-8]。借助NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast进行序列查找和比对，发现菜豆基因组中含有与VrEHs基因同源性较高的未知功能序列(XM_007146940)。基于该序列和VrEHs基因序列5′和3′端的一致序列，设计一对PCR引物Pv-F和Pv-R (包含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点)并委托上海Sangon公司合成(表 1)，用于pveh1的克隆。
| Primer name | Primer sequence (5′→3′) |
| Pv-F | *CATATGGAAGGCGTAGAACACAG |
| Pv-R | *CTCGAGTCAGAACTTGTTGATAAAATCATAAATGTGATTGC |
| * The base sequences underlined are the restriction sites | |
1.4 PvEH1基因的克隆
选取籽粒饱满的菜豆，30℃浸泡8 h，孵育20 h。取100 mg胚芽提取总RNA。以菜豆总RNA为模板、Oligo dT-Adaptor为引物，逆转录合成cDNA第一链；以该链为模板、Pv-F和M13 Primer M4为引物，进行第一轮PCR：94℃变性3 min，30个循环(94℃ 30 s、50℃ 30 s和72℃ 70 s)；再以第一轮PCR产物为模板、Pv-F和Pv-R为引物，进行第二轮PCR：94℃变性2 min，30个循环(94℃ 30 s、52℃ 30 s和72℃ 60 s)，72℃延长10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析、割胶回收目的基因，与pUCm-T连接，转化E. coli JM109，经蓝白斑筛选、SacⅠ酶切鉴定和DNA测序。将测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-pveh1。
1.5 PvEH1一级和三维结构的分析在Swiss-Prot Protein (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)搜集与PvEH1同源性较高的EHs。运用MEGA 4.0 (http://www.megasoftware.net/)构建EHs进化树；运用ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)和ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/)进行多序列比对和保守区域分析。以马铃薯EH (StEH)晶体结构(PDB: 2CJP)为模板，运用MODELLER 9.11 (http://salilab.org/modeller/)和PyMOL (http://pymol.org/)对PvEH1三维结构进行同源建模和分析。
1.6 PvEH1在大肠杆菌中的表达用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pUCm-T-pveh1，回收pveh1，与经同样双酶切的pET-28a(+)连接，获重组质粒pET-28a(+)-pveh1，转化E. coli BL21(DE3)，测序正确的转化子命名为E. coli/pveh1；而pET-28a(+)转化子命名为E. coli/pET-28a。分别挑取E. coli/pveh1和E. coli/pET-28a单菌落接种于2 ml含100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃、220 r/min培养过夜；取1 ml培养液转接于50 ml相同的培养基中，培养至OD600为0.6~0.8时，添加IPTG (终浓度0.5mmol/L)，20℃诱导10 h。收集菌体，每g湿菌体用10 ml磷酸钠缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4, 100 mmol/L, pH 7.5)悬浮，用于SDS-PAGE和对映归一性催化特性的分析。
1.7 对映体纯度和对映选择率的测定在1.5 ml EP管中加入450 μl菌悬液和500 μl磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，25℃保温5 min，再加入50 μl (R, S)-SO (终浓度10 mmol/L)进行反应。定时取样50 μl至1 ml乙酸乙酯(含1 mmol/L正己醇作为内标)中萃取，样品分析采用气相色谱仪GC-2010 (日本Shimadzu公司)、手性气相色谱柱和氢火焰离子化检测器。分析条件为：进样口和检测器温度250 ℃；初始柱温100℃，以5℃/min升温至195℃；载气为氮气，流速3.0 ml/min，分流比1:50。正己醇、(R)-SO、(S)-SO、(S)-PED和(R)-PED的保留时间分别为3.477、5.959、6.065、16.752和16.866 min。底物e.e.s=[(R-S)/(R+S)] × 100%；产物e.e.p=[(Rd-Sd)/(Rd+Sd)] × 100%；E=ln[(1-c)×(1-e.e.s)]/ln[(1-c)×(1+e.e.s)]。其中：R和S表示(R)-和(S)-SO浓度，Rd和Sd表示(R)-和(S)-PED浓度，c表示(R, S)-SO转化率。以E. coli/pET-28a菌悬液为对照，进行上述相同的反应和分析。
1.8 区域选择性系数的测定在两支1.5 ml EP管中各加入245 μl菌悬液和250 μl磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，25℃保温5 min，再分别加入5 μl (S)-和(R)-SO (终浓度5 mmol/L)反应2 h。αS=[RdS/(RdS+SdS)] × 100%；βR=[RdR/(RdR+SdR)] × 100%。其中：RdS和SdS表示由(S)-SO转化的(R)-和(S)-PED浓度，RdR和SdR表示由(R)-SO转化的(R)-和(S)-PED浓度。
2 结果与讨论 2.1 PvEH1基因的克隆以逆转录合成的第一链cDNA为模板，按1.4方法进行两轮PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。第一轮PCR约在1 200 bp处出现一特异性条带，第二轮PCR获得长度约为1 000 bp的pveh1，大小与预期相符。将其克隆至pUCm-T获重组质粒pUCm-T-pveh1。DNA测序结果显示，pveh1开放阅读框长963 bp，编码320个氨基酸。将pveh1序列及其推导的PvEH1序列递交至GenBank数据库，登录号为KR604729。
2.2 PvEH1一级结构的分析运用MEGA 4.0构建了PvEH1与代表性EHs的进化树(图 1)。在进化关系上，PvEH1与V. radiata EH1 (ADP68585; 85.7%)最近，其次为M. truncatula EH (XP_003626240; 81.1%)和G. max EH (XP_003554633; 81.0%)；与Nicotiana benthamiana EH (ACE82566)和S. tuberosum EH (AAA81891)的同源性分别为67.0和56.6%。一级结构分析显示PvEH1与其他EHs的最高同源性仅为85.7%，表明是一种新型的植物EH。
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| 图 1 α/β水解酶超家族EHs的进化树 Figure 1 Phylogenetic tree of EHs belonging to an α/β-hydrolase superfamily |
运用ClustalW2和ESPript 3.0对PvEH1与植物EHs进行了多序列比对及保守区域分析(图 2)。结果表明，PvEH1含有α/β水解酶家族特有的保守区域HGXP、GXSmXS/T和SmXNuXSmSm (X、Sm和Nu分别代表任意氨基酸、小氨基酸和亲核试剂)[9]，PvEH1催化三联体为Asp101-His299-Asp264，其盖子域中的保守质子供体为Tyr150和Tyr234。
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| 图 2 PvEH1与其他植物EHs的多序列比对和保守区域分析 Figure 2 Alignment of multiple sequences and analysis of conserved and functional motifs between PvEH1 and other plant EHs PvEH1: P. vulgaris EH1 (this paper); VrEH1: V. radiata EH1 (ADP68585); GmEH: G. max EH (XP_003554633); MtEH: M. truncatula EH (XP_003626240); NbEH: N. benthamiana EH (ACE82566); StEH: S. tuberosum EH (AAA81891). The conserved motifs of HGXP, GXSmXS/T and SmXNuXSmSm are boxed, the catalytic residues of D101, D264 and H299 are marked with stars, and the functional motifs of NC, cap and core loops as defined[10] are underlined |
以StEH晶体结构为模板，对PvEH1三维结构进行同源建模(图 3)。基于StEH结构与功能的研究[10]及PyMOL对PvEH1模型的分析，PvEH1由两大结构域组成：α螺旋和β折叠所形成的中心结构域(α/β-hydrolase domain)和位于活性中心上端的盖子结构域(lid domain)。PvEH1中心域由5个α螺旋、8个β折叠股和core loop组成，包含3个催化氨基酸残基D101、D264和H299；盖子域含有5个α螺旋、保守质子供体Y150和Y234及在第3和第4个α螺旋之间有一长度为35个残基的cap loop。两大结构域由长度为24个氨基酸残基的NC loop连接，决定EHs活性位点的外部区域特征。不同来源的EHs，其lid domains的一级结构同源性远低于α/β-hydrolase domains的同源性；NC loop和cap loop的氨基酸残基数目与EHs催化的底物类型有关[11]。
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| 图 3 PvEH1的三维结构模型 Figure 3 The three-dimensional structure model of PvEH1 |
分别将E. coli/pveh1和E. coli/pET-28a按1.6方法进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示，E. coli/pveh1诱导全细胞约在相对分子质量35.7 kDa处有一明显的特异性目的蛋白条带(图 4, 泳道2)，而E. coli/pET-28a在此处无特异性蛋白条带(图 4, 泳道1)，表明PvEH1在E. coli BL21(DE3)中实现了异源表达。
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| 图 4 重组大肠杆菌全细胞的SDS-PAGE分析 Figure 4 SDS-PAGE analysis of the recombinant E. coli whole cells M: Protein marker; 1: E. coli/pET-28a; 2: E. coli/pveh1 |
按1.7方法测定了PvEH1催化(R, S)-SO水解的进程曲线(图 5)。PvEH1与某些植物EHs如VrEH1、VrEH2[12]和StEH[13]的对映选择性相同，优先水解(S)-SO。当水解反应进行到40 min时，(R, S)-SO转化率达70.0%，(R)-SO和(R)-PED的对映体纯度分别为30.7% e.e.s和42.3% e.e.p；当底物转化率达到99.1%时，(R)-PED的纯度为33.6% e.e.p。PvEH1的E值为1.5±0.1，与VrEH2[12]接近(E=1.3)，但明显低于VrEH1[12] (E=5.0)。已有研究表明，EH的E值愈低，环氧化物的水解愈彻底，是单一EH催化外消旋底物对映归一性水解的必备特性[3]。
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| 图 5 PvEH1催化(R, S)-SO水解的进程曲线 Figure 5 The hydrolytic course curve of (R, S)-SO catalyzed by PvEH1 Solid circle: Concentration of (R)-SO (R); Hollow circle: Concentration of (S)-SO (S); Solid diamond: Enantiomeric excess of substrate (e.e.s); Hollow diamond: Enantiomeric excess of product (e.e.p); Solid triangle: Conversion rate (c) |
按1.8方法测定了PvEH1的区域选择性系数(图 6)。针对(S)-SO，PvEH1主要攻击多取代基的α-碳原子，构型反转，生成(R)-PED，αS为91.1±3.8%；而针对(R)-SO，该酶稍偏向于攻击少取代基的β-碳原子，构型保留，生成(R)-PED，βR为53.3±1.9%。与mbEH A (又称VrEH1)[14] (αS=83%, βR=68%)相比，PvEH1对(S)-SO区域选择性较好，对(R)-SO区域选择性较差。对比黑曲霉AnEH (优先水解(R)-SO, βR=99%)[6]，发现PvEH1与其对映和区域选择性互补，可联合催化环氧化物的对映归一性水解。PvEH1的βR虽未达到理想水平，但可借助基因工程手段对其进行定向改造。如Kotik等[15]对来源于宏基因组的Kau2进行迭代饱和突变，最优突变酶F:13-B11的βR从80%提高至97%。
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| 图 6 PvEH1分别针对(S)-和(R)-SO的区域选择性 Figure 6 Regioselectivity of PvEH1 towards (S)-and (R)-SO, respectively |
本研究首次从菜豆基因组中克隆了一种PvEH1编码基因pveh1，并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了胞内表达。一级结构分析表明，PvEH1是一种新型植物EH。采用重组大肠杆菌全细胞催化(R, S)-SO对映归一性水解，(R)-PED的对映体纯度为33.6% e.e.p。PvEH1针对(S)-和(R)-SO的区域选择性系数αS和βR分别为91.1和53.3%，其中低的βR是导致(R)-PED纯度不高的主要原因。
单一EH催化外消旋环氧化物对映归一性水解获得高对映体纯度的邻二醇，是一种非常理想的结果，但对该酶的要求很高，需同时具备高且互补的区域选择性和低的对映选择性(E值 < 3)。目前仅有少数EHs能实现单一催化底物对映归一性水解，其中植物来源的仅报道了StEH、VrEH1和VrEH2，且通常其催化效果也不尽人意。因此，如何获得更多可用于单一催化对映归一性水解的EHs，并针对野生型酶某些固有的缺陷进行改造，提高产物的纯度和产率，是突破该酶生产和应用瓶颈的关键所在。
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