2016, Vol. 36文章信息
- 余自青, 吴锁伟, 张丹凤, 柳双双, 谢科, 饶力群, 万向元.
- YU Zi-qing, WU Suo-wei, ZHANG Dan-feng, LIU Shuang-shuang, XIE Ke, RAO Li-qun, WAN Xiang-yuan.
- 玉米隐性核不育突变体ms14的遗传分析与基因定位
- Genetic Analysis and Gene Mapping of Recessive Genic Male Sterility14 (ms14) Mutant in Maize
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(10): 8-14
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(10): 8-14
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161002
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-02
- 修回日期: 2016-04-20
2. 北京首佳利华科技有限公司 现代生物农业产业技术研究院 北京 100192
2. Institute of Industrial Technology on Modern Bio-Agriculture, Beijing Shou Jia Li Hua Sci-Tech Co. Ltd., Beijing 100192, China
本试验所用的材料包括玉米雄性不育突变体ms14，玉米自交系郑58、昌7-2。其中玉米雄性不育突变体ms14从美国玉米种质资源中心(Maize Genetics Cooperation Stock Center)引进，玉米自交系郑58、昌7-2为本实验室保存的国内常规育种材料。
1.2 玉米不育突变体ms14的表型鉴定、分离群体构建及遗传分析玉米植株抽雄散粉时，取突变体成熟颖花在解剖镜下进行形态观察，同时取不育株和可育株雄穗上、中、下3个部位的小穗，用卡氏固定液固定，剥取花药，用1% I2-KI染色，镜检花药的可染性；田间参照Duvick提出的5级育性鉴定标准[22]，逐株进行育性鉴定。
2013年夏季在北京通州试验基地，以玉米不育突变体ms14为母本，以自交系郑58、昌7-2为父本，杂交获得ms14×郑58、ms14×昌7-2的F1种子；2013年冬季在海南三亚基地，种植F1种子，并套袋自交，获得F2分离群体(ms14×郑58、ms14×昌7-2)种子；2014年夏季在北京通州基地，种植F2分离群体，单株挂牌编号，在抽雄散粉期观察各单株的雄花育性表型，记录群体总株数、不育株数和可育株数，计算不育株/可育株的分离比例，并做卡方检验，进行遗传分析。
1.3 玉米DNA提取、分子标记开发及筛选在抽雄散粉期完成F2群体(ms14×昌7-2)的雄花育性调查鉴定后，按照单株编号，分别剪取其中的全部不育株、部分可育株、母本ms14和父本昌7-2的叶片，采用改良的CTAB法[23]提取亲本和F2不育株的基因组DNA。
根据田间的育性调查结果，随机选取完全不育株和可育株的DNA各10份，分别组成不育池和可育池，再加上不育和可育亲本DNA，选择分布于玉米第1染色体上的SSR分子标记40对，进行SSR引物的多态性标记筛选和基因初步定位。然后在初步定位的基础上，围绕不育基因位点进行SSR、Indel标记开发(表 1)，引物由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。PCR反应体系及程序参照文献[24]，扩增产物利用8%的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，银染检测。
| 引物名称 | 正向序列(Forward) | 反向序列(Reverse) | 染色体位置 |
| umc2229 | CGAAGAGCACGATGTTGACG | GAGAAGGGCGGGAGGAATAAC | 1.04 |
| umc2025 | CGCCGTAGTATTTGGTAGCAGAAG | TCTACCGCTCCTTCGTCCAGTA | 05 |
| umc1676 | AGTCGTACGATGACGGAGGC | GCACCACCGACTGATCAAGA | 05 |
| umc1611 | TACTACCAGCAGCTTGCTTCAACA | CTTCTTGTTCTTCACGCAGTTGTC | 05 |
| umc2232 | CTAGATTGCCTCGGACCTGTAAGA | CATTCATCCACCATAAATATCCTGC | 05 |
| umc1972 | ATAGCTCGAGTATTGCGTTGCTCT | AGTTGTTGGTGATGGTGAAGGTG | 06 |
| umc1035 | CTGGCATGATCACGCTATGTATG | TAACATCAGCAGGTTTGCTCATTC | 06 |
| umc1590 | CAGAGTCTGATAGTCCGAACCCAG | GTAAAGCTCACAGCTTCCGACAG | 06 |
| EP6 | CAAATTCCCACAATCACACG | ACTGAGCTTCAGGAACTCGC | 05 |
| EP7 | GAAGACCGTCTCTGTCCTCG | ACGATCTTATGCTGGTTGCC | 05 |
1.4 玉米隐性不育基因ms14的连锁分析与遗传作图
以ms14×昌7-2的F2群体为作图群体。根据PCR扩增产物电泳后显示的谱带，按以下方法赋值：将具有不育株带型单株记为“A”，具有可育株带型单株记为“B”，杂合体带型记为“H”。采用Mapmaker3.0作图软件进行数据分析和作图，用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离，构建ms14基因所在区域的遗传连锁图谱。
2 结果与分析 2.1 玉米隐性核不育突变体ms14的表型鉴定玉米ms14突变体植株在营养生长阶段与正常可育株在株型上基本无差异，到了生殖生长阶段，可育植株能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实；与可育株相比，ms14不育株能正常抽雄，但是不能正常开花，花药颖壳不开裂，花药干瘪不外露，无花粉粒形成(图 1 A，B)。对雌穗发育的观察发现，突变株与正常株的雌穗均可以正常授粉结实，说明突变基因不影响雌穗育性。
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| 图 1 玉米不育突变体ms14的雄穗与花药表型 Figure 1 Phenotypes of the tassel and anther of male sterility mutant ms14 in maize (A), (B) and (C) shows that phenotypes of tassel, anther and anther treated by I2-KI in male fertile plant (ms14/+) and male sterility mutant (ms14/ms14), respectively. Bar=2 mm |
对正常株花药和突变株花药进行I2-KI染色发现，正常株花粉粒经染色后呈黑褐色(图 1C左)，表明正常株花粉发育正常；而突变体无法进行I2-KI染色(图 1C右)，说明突变体花药发育异常，不能正常形成花粉粒。
2.2 玉米隐性核不育突变体ms14的遗传分析为了验证玉米ms14突变体是否是隐性单基因控制的核雄性不育，我们通过ms14突变体分别与郑58、昌7-2杂交，获得F1杂交种，F1植株的雄花均表现为正常可育(与父本一致)，说明ms14不育基因呈隐性遗传；F1植株进一步自交构建了2个F2分离群体，并在开花散粉期对分离群体的单株进行了雄花育性调查(表 2)。其中，ms14×郑58的F2分离群体共调查了631个单株，其中可育株数488个，不育株数143个，可育株与不育株的分离比是3.41:1；ms14×昌7-2的F2分离群体共调查了826个单株，其中可育株数645个，不育株数181个，可育株与不育株的分离比是3.56:1。经过卡方测验，表明两个F2分离群体的可育株:不育株的育性分离比都符合3:1，证明该突变体不育性状受1对隐性核基因控制。
| F2分离群体 | 总株数 | 可育株数 | 不育株数 | 分离比 | χ2 | P | 显著性测验 (P > 0.05) |
| ms14×郑58 | 631 | 488 | 143 | 3.41:1 | 0.971 | 0.324 | ns* |
| ms14×昌7-2 | 826 | 645 | 181 | 3.56:1 | 1.959 | 0.161 | ns* |
| * ns经卡方测验实际分离比与理论分离比差异不显著，符合3:1 | |||||||
2.3 玉米隐性核不育基因ms14的连锁标记筛选
前人的研究已经将玉米隐性核不育基因ms14遗传定位于玉米第1号染色体上(MaizeGDB，http://www.maizegdb.org/)。为了进行ms14的遗传定位，我们筛选了玉米第1号染色体上的40对SSR引物，发现8对SSR引物(表 1)在ms14突变体与昌7-2之间有多态性，可作为基因定位的分子标记。首先，利用SSR标记umc2025对ms14×昌7-2的F2分离群体的171不育个体进行PCR扩增和电泳分析(图 2)，发现umc2025在171个不育单株群体中ms14背景基因型占比94%(表 3)，表明umc2025与ms14紧密连锁。
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| 图 2 玉米隐性核不育基因ms14的SSR标记分析(umc2025) Figure 2 SSR marker analysis of the recessive male sterility gene ms14 in maize A:P1, male sterile parent ms14; B:P2, fertile parent line Chang7-2; 1~48 shows that DNA samples of 48 sterile plants in F2 segregation population; M: Molecular weight marker; * indicates the recombinant |
| F2群体 | 母本(A) | 父本(B) | 目标基因位点 | 目标基因位置 | SSR标记 | A基因型数 | B基因型数 | H基因型数 | 缺失样品数 | 不育株数 | A基因型占比 |
| Ns14×昌7-2 | ms14 | 昌7-2 | ms14 | 1.05 | umc2025 | 159 | 0 | 10 | 2 | 171 | 94% |
2.4 玉米隐性核不育基因ms14的初步定位
为了初步定位不育基因ms14，利用8个多态性SSR分子标记对ms14×昌7-2的F2分离群体的171个不育植株进行PCR电泳分析，构建了玉米不育基因ms14所在区间的遗传连锁图谱。结合表型数据，进行连锁交换分析，初步将ms14基因定位于umc2025与umc1676之间，遗传距离分别为2.2cM和0.3cM(图 3)。
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| 图 3 玉米不育基因ms14的初步定位 Figure 3 Primary mapping of maize male sterility gene ms14 |
为了进一步精细定位不育基因ms14，在umc2025与umc1676之间，根据单拷贝基因设计多态标记，并对亲本进行多态性分析，筛选到2个Indel标记(EP6，EP7)在两亲本间有多态性(表 1)。但是，进一步对F2群体171个不育单株进行分析后，发现这两个多态标记的定位结果与SSR标记umc1676和umc1611无差异，暗示该区段的重组率非常低。因此，ms14最终只能初步定位于umc2025和umc1676之间的近着丝粒区。
3 讨论玉米是雌雄同株异花作物，也是杂种优势利用的典范，其中杂交制种技术的关键在于母本的去雄。玉米人工去雄相对容易，也可以通过机械去雄、化学杀雄等途径，但是这些策略存在一些问题：一方面，这些去雄技术大大增加了制种的成本；另一方面，因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上大面积减产，导致巨大的经济损失。因此，降低制种成本、提高种子纯度是当前玉米生产急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是最为有效的途径之一。
迄今，创制和利用玉米的雄性不育系进行“三系法”或“两系法”制种，已获得了一定的成功。“三系法”主要利用玉米的细胞质(质核互作)雄性不育性，实施不育系、保持系和恢复系三系配套技术，易受专化性病原小种侵染，同时限制了杂交育种中玉米种质资源的利用率。“两系法”主要利用玉米的光温敏雄性核不育系，在特定的光温环境条件下，可以实现雄花育性转换，从而达到一系两用的目的。但是，由于光温敏雄性不育系易受环境因素影响，育性不稳定，在玉米制种过程中存在较大风险。因此，建立一套“遗传可控的、不受光温敏影响的玉米核雄性不育系”技术体系，并创制出一批稳定的核雄性不育系，对玉米优异杂交新品种培育和高效、低成本、无风险制种，具有重要意义。
玉米隐性核不育材料是一种重要的种质资源，在玉米雄花发育分子机制与遗传育种应用中具有重要价值。相对于细胞质不育系(三系法)和光温敏核不育系(两系法)而言，隐性核不育材料具有不育性稳定、种质资源利用率高等优点，因而越来越受到玉米遗传育种工作者的青睐。
本文对玉米不育突变体ms14进行了雄花和花药表型鉴定、遗传分析、基因定位等初步研究，结果表明ms14是单隐性基因控制的无花粉型核不育突变体，并通过分子标记连锁分析将其定位于玉米第1染色体的SSR标记umc2025与umc1676之间，遗传距离分别为2.2 cM和0.3cM，为ms14基因的精细定位、分离克隆及其产业化应用奠定了基础。
目前，由于F2分离群体规模较小(小于1000株)，同时由于ms14定位于玉米第1染色体的近着丝粒区，该区段的重组率极低，致使4个多态性分子标记(umc1676，umc1611，EP6与EP7)对ms14基因的定位结果无差异。下一步将通过扩大F2分离群体(其中不育株10 000株以上)，进一步对ms14进行精细定位，并完成ms14基因的分离克隆。此外，通过突变体与野生型的测序分析、玉米转基因功能互补试验等，完成ms14基因的功能验证。
玉米隐性核不育材料ms14是遗传稳定的无花粉型不育系，在玉米不育化杂交育种和制种中具有巨大的应用潜力。通过紧密连锁标记(如umc1676、umc1611、EP6与EP7)的标记辅助选择育种，可以创制不同遗传背景的ms14不育系，为其产业化应用奠定基础。此外，ms14基因一旦完成克隆验证后，可以通过构建以其野生型基因Ms14为核心的多控不育载体(同时含有育性恢复基因Ms14、花粉失活基因ZmAA/Dam、筛选标记基因DsRed/mCherry/Bar等4～5个功能元件)并转化玉米ms14突变体材料，以获得转基因的多控不育保持系；通过转基因技术、传统育种技术(杂交、回交)和分子标记辅助选择技术的综合应用，筛选和创制不同遗传背景的非转基因玉米雄性不育系，实现隐性核不育系材料的有效保持和繁殖。建立基于玉米隐性核不育系(以ms14基因为核心)的高效杂交育种和制种技术体系，实现降低玉米制种成本、提高制种纯度、提高杂种优势利用效率、有效保护品种权等目的，为我国玉米种业的发展提供科技支撑。
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