热休克蛋白(heat-shock protein)是生物体应对温度、pH、渗透压等不利环境刺激时合成的一种高度保守的保护蛋白。热休克反应的特点是快速诱导编码热休克蛋白基因的表达，这些基因编码的蛋白质可以防止蛋白质的聚集、协助蛋白质跨膜转运、参与寡聚结构的组装和降解等^[1]，降解不可逆损伤蛋白质^[2]。调控因子可以在转录水平上对热休克基因正向调控和逆向调控，在环境应激时调控热休克基因的表达，恢复或加速清除细胞内已经变性的蛋白质，使细胞处于稳态并产生耐受性。

在革兰氏阳性菌中，根据它们的共同调控因子，编码热休克蛋白的基因分成6类^[3]。如表 1所示，HrcA是第I类热休克调控因子，是一个抑制因子，可以调控下游基因(包括groEL和dnaK操纵子)的表达，进而抑制异常蛋白聚合和折叠^[4]。σ^B是第II类热休克调控因子，在菌体受到化学、物理、生物等各种各样的胁迫条件时，σ^B可以调控200多个热休克基因的表达^[5]。CtsR是第III类热休克调控因子^[6]，阻遏热休克基因的表达，主要包括clpB、clpC、clpE、clpX、clpP等clp蛋白家族基因^[7]，当菌体受到高温胁迫时，CtsR阻遏作用解除，进而调控这类基因的表达。第IV类基因是htpG(high-temperature protein G)；第V类基因是由双组分系统CssRS(control secretion stress regulator and sensor)调控的基因^[8]；第VI类基因包括ftsH、clpX、lon等。这6类基因编码的热休克蛋白在抵御刺激和适应环境中发挥重要作用，可以诱导热休克蛋白基因的转录和表达，进一步调解生理反应和维持细胞稳态。本文综述了热休克转录调控系统的特征和调控功能，并初步概述了转录调控因子的相互作用，为深入构建转录调控网络奠定基础。其中HrcA、σ^B和CtsR可以响应多种胁迫压力，在转录水平上对热休克基因正向调控和逆向调控，对其进行了重点阐述。

1 HrcA-CIRCE调控系统 1.1 hrcA基因及CIRCE反向重复序列

在120余种细菌中，hrcA基因可以编码一种与CIRCE(controlling inverted repeat of chaperone expression)操纵基因相互作用的转录抑制蛋白^[9]，从而发挥下游基因的调控作用，即调控第I类热休克基因，如调控groEL-ES和dnaK操纵子的表达。在细菌中HrcA蛋白的分子质量大小为39~40kDa，序列具有高度的保守性，C端是一个功能特殊的区域^[10]，N端具有两个DNA结合域。然而，在衣原体菌属编码的HrcA蛋白中，C端有附加序列，所以它的分子质量要比其它菌属的大10％。这段额外的C端区域有三个作用：

①降低HrcA与CIRCE操纵基因的结合能力；②抑制衣原体热休克基因的表达；③降低HrcA抑制转录的能力。研究表明，C端还可以被热休克蛋白GroEL调节^[10]。

1989年，在分枝杆菌groEL-ES基因的上游第一次发现CIRCE反向重复序列^[11]。1992年，在丙酮丁醇梭菌groEL-ES和dnaK操纵子及枯草芽孢杆菌groEL-ES操纵子的转录起始位点下游，发现了一个几乎相同的反向重复序列^[12-13]。随后的研究发现，这个反向重复序列存在于多种细菌中，并且高度保守TTAGCACTC-N9-GAGTGCTAA，被命名为CIRCE^[14-15]。同时，CIRCE反向重复序列在40余种真细菌中也确定存在，通常与HrcA转录调控基因相互作用，调控下游热休克操纵子groEL-ES和dnaK的表达。

1.2 HrcA-CIRCE热休克调控系统

HrcA的活性取决于groEL-ES的构象变化^[16]。HrcA-CIRCE热休克调控系统见图 1，在正常情况下，GroEL稳定的构象维持HrcA处于抑制活性状态，阻遏CIRCE调控的groEL-ES操纵子表达。应激状态时，伴侣蛋白groEL-ES修复折叠和变性蛋白质，进而构象改变，HrcA丧失抑制活性导致靶基因的诱导转录^[17]。缺失hrcA基因的链霉菌菌株groES操纵子和groEL基因的转录量增加，对缺失菌株进行hrcA基因回补后发现，转录量减少。HrcA-CIRCE热休克调控系统广泛存在于真核细菌中，它通常调控groES-groEL和dnaK操纵子。但是，最近对李斯特氏菌研究发现，HrcA可以直接调控被groES-groEL操纵子趋异转录的lmo2070基因；间接激活氧化应激的基因(lmo0669、lmo2159和lmo0641)^[18]、冷应激的基因cspD^[19-20]、酸应激的基因gadC/gadB^[21]和渗透压应激的基因cysK^[22]；在肺炎支原体中还调控热休克基因clpC的表达。因此，调控因子HrcA，在氧化、低温、高温、低pH、高渗透压等应激下都能调控相关基因表达，提高菌株耐受性^{[4, 23]}。近年来，随着对HrcA-CIRCE调控系统的解析，HrcA与groEL-ES之间是如何作用的，响应应激信号的调控机制也逐渐被解析，为人们深入了解HrcA-CIRCE的调控机制，进一步改造菌株提供了非常有利的支持。

2 σ^B调控因子 2.1 σ^B调控因子及其伴侣切换机制

σ^B调控因子是sigB基因编码的产物，其活性主要通过一系列rsb基因编码产生的Rsb蛋白来调节^[24]。在热休克调控系统中σ^B调控因子调控的基因最多，在枯草芽孢杆菌中调控200多个基因，这些基因编码不同功能的蛋白质，如氧化应激的保护、适应盐胁迫和水分胁迫、氧化还原平衡、调解细胞膜功能及调节代谢的蛋白质。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌σ^B调控蛋白相似^[5]。在炭疽杆菌中，σ^B因子是一个调控毒力的转录因子，并在稳定生长期和热休克之后被激活^[25]。

在革兰氏阳性菌中σ^B的调控是通过一个所谓的伴侣切换机制实现的^[26]，如图 2所示。在无应激条件下，σ^B处于非激活状态被抗σ因子RsbW(an anti-sigma factor)封存。当面对应激时，一个抗σ因子拮抗剂RsbV和RsbW结合，这导致σ^B从被RsbW封存状态中释放，处于激活状态。随后，激活的σ^B可以与RNA核心酶结合，进而诱导依赖σ^B的基因转录。RsbW不仅是抗σ因子，也是RsbV磷酸化的一种激酶。RsbV磷酸化形式是无法结合RsbW并激活σ^B的，然而，在胁迫条件下，RsbV的磷酸化形式可由PP2C型的磷酸酶作用而脱磷酸，进而形成RsbVRsbW蛋白复合体和激活σ^{B[24, 27]}。在蜡样芽孢杆菌应激条件下，PP2C磷酸rsbY基因似乎是唯一负责σ^B活性的磷酸酶，rsbY基因的缺失导致σ^B调控的热休克系统摧毁^[28]。

2.2 σ^B调控因子响应不同的应激条件

σ^B可以响应不同的应激条件，在枯草芽孢杆菌中有两种不同的途径导致σ^B激活。第一个途径是在环境应激条件下诱发σ^B(如乙醇应激和渗透压应激)，第二个途径是降低细胞内ATP浓度激活σ^B[29]。对蜡样芽孢杆菌30℃升温至42℃后，蛋白质印迹法显示，σ^B的活性提高20.1倍；渗透压和乙醇应激后σ^B的活性同样也提高；暴露蜡样芽胞杆菌于羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)降低细胞内ATP浓度，σ^B的活性只是有限的提高，表明对于蜡样芽胞杆菌降低细胞内ATP浓度，不是激活σ^B的重要因素^[30]。P.McGann等^[31]研究发现，单核细胞增生李斯特菌σ^B基因缺失后，表现出适应高渗透压的能力降低；单核细胞增生李斯特菌野毒株和缺失株分别在高温(T=42℃)、强酸(pH=3) 、强碱(pH=9) 条件下应激，发现缺失菌株耐受能力均弱于野生株；随后发现，σ^B基因的缺失使得单核细胞增生李斯特菌毒力明显下降^[32]。因此，σ^B是对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子。

3 CtsR调控系统 3.1 CtsR

CtsR(class three stress gene repressor)是在枯草芽孢杆菌中最早被发现的高度保守的转录抑制子^[33]，随后也在大部分低GC含量的革兰氏阳性菌中被发现。CtsR通过识别并结合一个保守的重复的七核苷酸操纵子序列(5'-RGTCADN NAN RGTCADN-3')来抑制和调节第III类热休克基因的表达(clpP、clpE和clpC操纵子)^{[6, 34]}。研究表明，CtsR主要调控ClpATP酶和ClpP蛋白酶基因的表达；然而，在葡萄球菌中CtsR也参与调控groEL-ES和dnaK操纵子的表达^[35]。在植物乳杆菌中，CtsR调节clpC操纵子、ftsH的转录^[13-14]，ftsH基因编码一种膜结合的金属蛋白酶，是一种新颖的CtsR应激反应调节子^[36]。在应激状态下，细胞中缺失CtsR基因将导致热敏感和细胞表面形态的改变，因此，CtsR在应激耐受性和参与蛋白质质量控制方面起关键作用^[37]。

3.2 ClpATP酶

ClpATP酶是在原核生物和真核生物中高度保守的的一种酶类，许多Clp蛋白(ClpA、ClpX和ClpC)具有ATP依赖性。在低GC含量的革兰氏阳性菌中CtsR调控Clp基因的表达。CtsR的DNA结合活性是温度依赖性的，调控clp表达的核心问题是CtsR如何监测温度。最近研究发现，ctsR操纵子中的翼状螺旋-转角-螺旋结构域具有四-甘氨酸环钩，可以将DNA钩住^[38]，利用定点诱变技术证实CtsR存在感温位点，该位点可以自身“感受”热量和反映周围环境的温度，造就了蛋白质热失活的易感性^[39]。CtsR与DNA结合抑制其转录时，Clp复合体非常稳定；当外界刺激出现时，Clp复合体则会降解CtsR，稳定状况被破坏。金黄色葡萄球菌中的研究证实了上述研究结果，在正常生长条件下，CtsR抑制了clpP、clpB基因的转录，但热激不久后抑制作用解除^[40-41]。在枯草芽孢杆菌中，应激后，CtsR从DNA上解离，会立即被ClpEP蛋白酶识别，被ClpCP降解^[38]。众多研究证实，ClpCP介导的CtsR降解有助于解除CtsR调控子的阻遏作用^[42-43]。

3.3 CtsR热休克调控系统

CtsR热休克调控系统见图 3，在正常情况下，CtsR和DNA操纵子序列结合抑制其活性。McsB激酶与McsA相互作用并与ClpC结合，处于失活状态^[44]。应激状态时，CtsR由于构象改变丧失与DNA结合的能力，进而与McsB激酶结合，ClpCP降解CtsR，CtsR丧失抑制活性导致靶基因的诱导转录^[45]。McsB和McsA作为衔接蛋白直接参与第III类热休克反应的调节，被称为CtsR的调节剂。McsB^[44]包含一个高度保守的ATP结构域胍磷酸转移激酶(guanidino phospho transferase)，可以抑制CtsR与DNA结合能力，调节ClpCP降解CtsR。McsA作为McsB的抑制剂，两者一旦相互作用，就会防止McsB与失活的CtsR DNA结合^[44]。研究表明，不同菌株CtsR在特殊应激反应中的失活机制完全取决于McsB^[46]。然而，并不是所有的革兰氏阳性菌中都存在应激传感复合体McsA/ McsB，如在金黄色葡萄球菌中这类反应可能是由McsB和McsA的同系物参与的^[47]。另外，在链球菌和乳酸菌中也没有发现特定的mcsB和mcsA基因，CtsR的活性由ClpE伴侣进行调节，表明它们的调控模式不同于生物模式菌株枯草芽孢杆菌^[48]。调控因子CtsR，在高温、低pH、氧化应激、嘌呤霉素、羰基亲电子、不饱和长链游离脂肪酸酸和低温等环境应激后，阻遏作用解除，可以诱导相关耐受基因表达，提高菌株耐受性。

4 其他热休克调控系统

第V类热休克调控系统CssRS双组分系统介导的信号诱导htrA和htrB基因的表达^[49]，在枯草芽孢杆菌中，htrA和htrB基因编码涉及质量控制的丝氨酸型表面蛋白酶，这些蛋白酶的编码严格依赖于CssRS。当外界应激时，细胞膜和细胞壁界面就会聚集错误折叠的蛋白质，CssRS是降解这些蛋白质的一个关键因素^[50]。但是CssRS双组分调控系统的应激信号是如何传递的，如何识别并调控这些基因表达，不同菌株的调控模式是否相同，还有待于进一步研究。第IV类基因是htpG，是热休克90蛋白家族中的一员，参与多种细胞过程，包括蛋白质折叠修复和信号转导。第VI类基因ftsH是作用在膜上的蛋白酶，分解异常的膜蛋白和部分胞质蛋白沉淀。但是这两类具体的调控系统还不明确，还有待于进一步研究。

5 HrcA、σ^B和CtsR的相互调控关系

为适应无穷变幻的环境，微生物演变出非常复杂的调控网络，快速的调解生理反应以恢复细胞稳态。HrcA和σ^B之间存在复杂的相互影响^[18]:σ^B和HrcA都会自动调节各自的转录；σ^B也会直接调控一些HrcA依赖型的基因；σ^B和HrcA两者转录后都会被调节。例如，在枯草芽孢杆菌中，依赖HrcA的groEL-ES操纵子编码的GroE反过来调节HrcA活性^[51]。总体来说，σ^B和HrcA依赖的调节机制在转录和转录后出现交互，在应激反应时，σ^B和HrcA相互作用共同调控相应基因的表达。σ^B和CtsR的调控子也存在相当大一部分重叠，在热应激中扮演很重要角色的clpC、clpP和clpB^[52]，以及在酸应激中扮演很重要角色的gadC和gadB，均被σ^B和CtsR共同调控。σ^B有助于CtsR的转录后调控，在一些应激条件下，σ^B通过mcsA上游的σ^B依赖型启动子调控mcsA-mcsB-clpC的转录^[53]。mcsA-mcsB-clpC编码的蛋白质对CtsR的转录后调控起很重要的作用。HrcA、CtsR之间存在复杂的相互影响，HrcA和CtsR依赖的调节机制在转录和转录后也出现交互。在链球菌类(肺炎链球菌、化脓性链球菌、变形链球菌、无乳链球菌、乳酸乳球菌和唾液链球菌)中，groEL-ES操纵子呈现串联的CtsR靶向位点序列和CIRCE序列^[54]。Chastanet等^[55]的研究表明，HrcA和CtsR协同调控dnaK和groEL-ES操纵子的低水平表达，而HrcA调节子被完全嵌入在CtsR调节子内^。CssRS双组分系统与其他热休克调控系统之间的联系研究较少，有待于进一步研究。

6 结论和展望

面对环境变化所带来的挑战及胁迫，微生物已经进化出错综复杂的调控网络。热休克调控网络是从总体上深入了解热休克调控不可或缺的一部分。李斯特菌HrcA、σ^B和PrfA构成的调控网络，有助于毒力基因和应激基因的转录表达，提高菌株耐受不同应激压力^[55]。谷氨酸棒状杆菌HspR、HrcA和Sigma因子构成的调控网络，应激情况下，157个热休克基因被正向调控和逆向调控^[56]。热休克调控系统的分类现已成熟，但是这些调控系统之间的内在机制联系有待于进一步研究。例如，htpG和ftsH受哪些系统调控；CssRS双组分系统与HrcA-CIRCE等系统之间如何联系，不同应激情况对于各调控系统内在联系有何影响，这些问题解读对构建热休克调控网络具有一定的启示作用。另外，随着系统生物学及代谢工程的发展，在微生物中越来越多的调控因子已经被发现，除了本文所述的调节子外，SOS反应调节子LexA、氧化还原传感器Rex、过氧化物传感器PerR、精氨酸生物合成和代谢调节剂ArgR、组氨酸合成稳压器HisR、半胱氨酸代谢抑制子CymR和嘌呤代谢抑制子PurR等也已被发现^[57]。如果将不同种调控系统集成一个完整的应激调控网络，针对不同的应激条件激活调控因子，将有望进一步提高菌株对胁迫环境的适应能力。