2016, Vol. 36文章信息
- 李晓波, 刘雪, 赵广荣.
- LI Xiao-bo, LIU Xue, ZHAO Guang-rong.
- 微生物合成黄酮糖苷类天然产物研究进展
- Advances on Flavonoid Glycosides Production of Engineered Microorganisms
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(8): 105-112
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(8): 105-112
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160814
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-01
- 修回日期: 2016-02-23
黄酮糖苷类天然产物(flavonoid glycosides)是植物中黄酮类化合物的主要存在形式，通过糖基化修饰，可以改变黄酮的水溶性、稳定性等，产生更多新的生物活性，从而实现重要的生物功能[1]。黄酮的糖基化修饰通常由植物或微生物中的糖基转移酶催化，通过O-糖苷键或C-糖苷键与糖基相连。由于糖的种类、数量、连接位置及连接方式的不同，形成多样化的黄酮糖苷类化合物[2]。黄酮糖苷类天然产物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肝脏毒性和抗抑郁等诸多生物活性[3]，在医药、食品中具有重要功能价值。目前黄酮糖苷类天然产物均是从植物中分离，提取工艺复杂，产率低，大规模制备受到限制。近年来，随着代谢工程以及合成生物学技术的迅速发展，通过生长快速，遗传背景简单，易于操作的模式微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等作为细胞工厂合成天然产物药物成为研究热点[4]。目前，通过对这些模式微生物进行代谢工程改造，合成植物源黄酮糖苷类天然产物已经取得了一定的进展，为今后的深入研究和工业化生产奠定了良好的基础，本文对此进行了综述和展望。
1 黄酮糖苷类天然产物植物合成黄酮糖苷类天然产物属于苯丙烷代谢途径，从苯丙氨酸或酪氨酸出发，经解氨催化、辅酶A活化，以及与丙二酰辅酶A缩合等反应，转化为柚皮素、圣草酚等二氢黄酮。二氢黄酮类是其他黄酮类化合物生物合成的直接前体，经不同修饰酶可以合成多种黄酮类衍生物：黄酮(flavones)、异黄酮(isoflavonoids)、黄酮醇(flavonols)、花色素(anthocyanins)以及黄烷酮(flavanones)[5]。这些黄酮类化合物在糖基转移酶的催化下形成各种糖苷衍生物(以葡萄糖基化修饰为例，如图 1所示)：(1)糖基化在7-OH。如柚皮素-7-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷等二氢黄酮糖苷，芹黄素-7-O-葡萄糖苷、毛地地黄酮-7-O-葡萄糖苷等黄酮糖苷，如染料木素-7-O-葡萄糖苷、大豆苷元-7-O-葡萄糖苷等异黄酮糖苷。(2)糖基化在4’-OH，如毛地地黄酮-4’-O-葡萄糖苷，染料木素-4’-O-葡萄糖苷、大豆苷元-4’-O-葡萄糖苷等。(3)糖基化在3-OH，如山奈酚-3-O-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-鼠李糖苷以及槲皮素-3-O-葡萄糖苷等黄酮醇糖苷，花色素苷、花葵素-3-O-葡萄糖苷以及飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷等花色素糖苷。(4)糖基化在3-OH和5-OH，形成双糖苷，如花色素-3，5-O-双葡萄糖苷等。(5)糖基化在C-6或C-8，如牡荆苷、荭草苷以及异牡荆苷、异荭草苷等。
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| 图 1 黄酮糖苷类化合物生物合成途径 Figure 1 Biosynthesis pathway of flavonoid glycosides |
黄酮的糖基化通常由植物或微生物中的糖基转移酶(glycosyltransferases，GTs，EC 2.4.x.y)催化，糖基转移酶将活性糖基从糖基供体转移到各类黄酮受体，并形成糖苷键，生成多种多样的黄酮糖苷类化合物。糖基活性供体分子大多为尿核苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)活化的含糖基化合物，包括UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-鼠李糖、UDP-戊糖和UDP-半乳糖等。以UDP-葡萄糖为供体，其糖基转移酶称为UDP-葡萄糖基转移酶(UGTs)[6]。
根据底物性质和序列相关性，目前已经有98个GTs被分类鉴定( http://www.cazy.org/GlycosylTransferases.html)，其中GT超家族1中大部分成员在糖基化反应中能够运用UDP活化的糖作为糖基供体，因此大部分属于UGTs。植物中多种多样的UGTs有着多种不同的催化活性，从而可以特异性地修饰不同的次级代谢产物，尤其在黄酮的糖基化修饰中扮演着重要的角色[7]。UGTs中含有相似的结构域，其C-末端都有44个氨基酸的特征性区域，称为PSPG框(Plant Secondary Product Glycosyltransferase Box)，被认为是UDP-葡萄糖的结合区域[8]。而UGTs的N-末端区域具有有限的保守性，可能与特异性结合不同甙元底物有关[9]。
大多数糖基转移酶对底物具有区域选择性和区域特异性特点，根据修饰底物不同位点的特异性，糖基转移酶也可分为O-、N-、C-、S-糖基转移酶[10]。黄酮糖苷类天然产物的形成大部分为O-糖基转移酶催化修饰，部分为C-糖基转移酶催化。通过Clustalx1.83软件对来源于植物和微生物的部分黄酮糖基转移酶的氨基酸序列进行比对，采用邻接法，用Mega 6.05软件构建黄酮类糖基转移酶的系统发育树(图 2)。可以看出，修饰黄酮类的糖基转移酶可以分为两个大类群，处于两个不同分支的分别为植物来源的糖基转移酶和微生物来源的糖基转移酶，表明进化关系较远。
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| 图 2 部分修饰黄酮类化合物的糖基转移酶的系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of selected glycosyltransferase for flavones 图中括号内表示Genbank数据库中的登录号 |
植物源的糖基转移酶，一般具有较高的特异性。根据修饰黄酮类化合物结构的区域不同，可以分为4大类： (1)黄酮3-O-糖基转移酶，例如葡萄(Vitis vinifera)中的糖基转移酶VvGT5、 VvGT6 [11]；(2)黄酮7-O-糖基转移酶，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的AtGT2 [12]；(3)黄酮5-O-糖基转移酶，如Va5GT修饰花青素3-O-葡萄糖苷的5-OH，合成花青素3, 5-O-双葡萄糖苷[13]；(4)黄酮C-糖基转移酶，一般可将C-6和C-8位糖基化，如水稻(Oryza sativa)中C-糖基转移酶OsCGT [14]。除此之外，玉米(maize)中的糖基转移酶UGT708A6具有C-和O-糖基转移酶双功能，既可以催化合成黄酮7-O-糖苷，也可合成黄酮C-糖苷[15]。
与植物源的糖基转移酶作比较，微生物源的糖基转移酶可以催化修饰黄酮类化合物的多个-OH位点，对底物的选择也比较宽泛。如以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的糖基转移酶Yjic为代表的一类酶，可催化黄烷酮类、异黄酮类、查尔酮等七个不同种类，3-OH、5-OH、7-OH等多个位点，合成黄酮-O-糖苷[16]。
3 糖基化修饰工程糖基供体是黄酮糖苷类天然产物生物合成的活性底物，通过代谢工程改造，微生物可以利用葡萄糖、蔗糖等合成多种不同类型的糖基供体，包括UDP-糖，如UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-戊糖等，也可合成TDP-糖，如TDP-葡萄糖、TDP-鼠李糖(图 3)。近几年，已在微生物中实现了多种黄酮类化合物的糖基化修饰，合成了多种黄酮糖苷(表 1)。
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| 图 3 大肠杆菌U(T)DP-糖的代谢途径 Figure 3 Metabolic pathway of U(T)DP-sugars in Escherichia coli pgi:phosphoglucoisomerase; zwf:glucose-6-phosphate dehydrogenase; pgm:phosphoglucomutase; galU:UTP glucose 1-phosphate uridylyltransferase; galE:UDP-glucose 4-epimerase; ugd:UDP-glucose 6-dehydrogenase; MUM4:UDP-rhamnose synthase; UXS:UDP-xylose synthase; UXE:UDP-xylose epimerase; rfbA:TDP-glucpsepyrophosphorylase; rfbB:TDP-glucose4, 6-dehydratase; rfbC:TDP-4-dehydrorhamnose 3, 5-epimerase; rfbD:TDP-4-dehyrorhmnose reductase |
黄酮的葡萄糖基化是目前研究最多的一类，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，在不同特异性糖基转移酶的催化下，可形成黄酮-3-O-葡萄糖苷、黄酮-7-O-葡萄糖苷、黄酮-4′-O-葡萄糖苷以及黄酮-C-葡萄糖苷等葡萄糖基化修饰的产物。Malla等[17]在大肠杆菌中引入大豆(Glycine max)中的糖基转移酶GmUGT78K1，通过增强UDP-葡萄糖合成途径，以柚皮素为底物，合成了山奈酚-3-O-葡萄糖苷。Werner等[18]以酿酒酵母为底盘细胞，表达了来自康乃馨(Dianthus caryophyllus)的黄酮糖基转移酶DicGT4，以柚皮素为底物，合成柚皮素-7-O-葡萄糖苷和柚皮素-4’-O-葡萄糖苷。Brazier-Hicks等[14]在酿酒酵母中共表达了来自甘草(licorice)的黄酮2-羟化酶(F2H)和水稻中的C-糖基转移酶OsCGT，以黄酮为前体，实现了黄酮-C-糖苷类化合物，如甘草苷，牡荆苷，异甘草苷、异牡荆苷以及根皮素-C-糖苷类等。
强化UDP-葡萄糖合成途径，过表达葡萄糖磷酸变位酶基因pgm和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU，可增加UDP-葡萄糖的供给，从而显著增加黄酮-葡萄糖苷的产量[19]。敲除编码UDP-葡萄糖水解酶基因ushA，阻断UDP-葡萄糖降解途径，也是提高其产量的有效方法[18]。
对UDP-葡萄糖途径改造，增加UDP-葡萄糖醛酸供给，进一步可生成黄酮-葡萄糖醛酸苷。Oka等[20]首先在酿酒酵母中引入拟南芥中的UDP-葡萄糖脱氢酶(AtUGD1)，从而在酿酒酵母中实现了从UDP-葡萄糖到UDP-葡萄糖醛酸的合成。Kim等[21]以大肠杆菌为底盘细胞，敲除磷酸葡萄糖异构酶基因pgi和UDP-葡萄醛酸竞争途径关键基因arnA，过表达大肠杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU、棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的UDP-葡萄糖脱氢酶基因cals和金草鱼(Antirrhinum majus)的UDP-葡萄糖醛酸糖基转移酶AmUGT10，合成了300 mg/L木樨草素-7-O-葡萄糖醛酸苷和687 mg/L槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。
3.2 黄酮的鼠李糖基化修饰黄酮-O-鼠李糖苷类通常以UDP-鼠李糖或TDP-鼠李糖作为糖基供体合成。这类化合物展现出良好且多种多样的生物活性，例如，山萘酚-3-O-鼠李糖苷可以抑制乳腺癌细胞增殖[22]，槲皮素-3-O-鼠李糖苷可以抑制酪氨酸酶活性，防护紫外线损伤，从而抑制黑色素细胞合成，美白皮肤等[23]。在植物中，UDP-鼠李糖可以直接通过內源多功能酶催化UDP-葡萄糖获得，然而，在微生物內源途径中则是通过TDP-葡萄糖合成：TDP-葡萄糖在dTDP-葡萄糖4，6-脱水酶(rfbB)，dTDP-4-脱氢鼠李糖3，5-异构酶(rfbC)和dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶(rfbD)的连续催化下合成TDP-鼠李糖，从而作为糖基供体，合成鼠李糖苷类。同时，也可直接引入植物源UDP-鼠李糖合成酶基因，催化UDP-葡萄糖合成UDP-鼠李糖，作为糖基供体(图 1)。
Kim等[24]将拟南芥中糖基转移酶AtUGT78D1引入大肠杆菌中，利用大肠杆菌內源的TDP-鼠李糖，实现了以槲皮素为底物，同时合成槲皮素-3-O-鼠李糖苷(槲皮苷)和山萘酚-3-O-鼠李糖苷。当共同表达鼠李糖合成基因rhm2时，可以将槲皮素-3-O-鼠李糖苷和山萘酚-3-O-鼠李糖苷提升到160%。Bruyn等[25]则直接将拟南芥中UDP-鼠李糖合成酶基因(MUM4)和鼠李糖基转移酶基因RhaGT，经过优化引入大肠杆菌，并加强UDP-葡萄糖合成途径，通过流加蔗糖和槲皮素底物，实现了槲皮苷的生物合成。
在大肠杆菌中表达两个不同的糖基转移酶可生成黄酮双杂糖苷。第一个糖基转移酶AtUGT78D2催化槲皮素3-OH葡萄糖基化，形成槲皮素-3-O-葡萄糖苷；然后在第二个糖基转移酶AtUGT89C1的催化下，将其7-OH鼠李糖基化，最终合成槲皮素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷[26-27]。同样，大肠杆菌中引入糖基转移酶AtUGT78D1和AtUGT89C1，可以实现槲皮素-3, 7-氧-二鼠李糖苷的合成[26]。
3.3 黄酮的戊糖基化修饰植物产生两种黄酮-O-戊糖苷，分别是黄酮-O-木糖苷和黄酮-O-阿拉伯糖苷[28]。在植物中，UDP-葡萄糖醛酸是UDP-木糖合成的直接前体，UDP-葡萄糖在UDP-葡萄糖6-脱氢酶的催化下生成UDP-葡萄糖醛酸，然后再经过UDP-木糖合酶(UXS)催化生成UDP-木糖，UDP-木糖在UDP-木糖异构酶(UXE)的催化下进一步生成UDP-阿拉伯糖。Oka等[20]在酿酒酵母中合成UDP-葡糖醛酸和表达拟南芥UDP-葡糖醛酸脱羧酶(AtUXS3)，实现了UDP-木糖的合成。同样，在大肠杆菌中表达棘孢小单孢菌UDP-葡萄醛酸脱羧酶(calS9)和植物UDP-木糖合酶，合成UDP-木糖，在此基础上表达UDP-木糖异构酶，合成UDP-阿拉伯糖，然后再在糖基转移酶的催化下，实现以UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖作为糖基供体的糖苷类天然产物，如槲皮素-3-氧-木糖苷、槲皮素-3-氧-阿拉伯糖苷的生物合成[28-29]。
| Resource | Sugar donor | UGTs | Product | Yield(mg/L) | Reference |
| Naringenin | UDP-glucose | GmUGT78K1 | Kaempferol 3-O-glucoside | 109.3 | [17] |
| Naringenin | UDP-glucose | DicGT4 | Naringenin 7-O-glucoside | 87.0 | [18] |
| Naringenin 4′-O-glucoside | 82.0 | ||||
| Phloretin | UDP-glucose | OsCGT | Phloretin C-glucoside | 53.4 | [14] |
| Kaempferol | UDP-glucose | BcGT-3 | Kaempferol 3, 7-O-diglucoside | 51.8 | [30] |
| Quercetin | UDP-glucose | PGT3 | Isorhamnetin 3-O-glucoside | 39.7 | [31] |
| Apigenin | UDP-glucose | AtGT | Apigenin 7-O-glucoside | 39.28 | [32] |
| Baicalein A | Baicalein A 7-O-glucoside | 76.82 | |||
| Genistein | UDP-glucose | GmIF7GT | Genistetin 7-O-glucoside | 75.9 | [33] |
| Daidzein | Daidzein 7-O-glucoside | 67.7 | |||
| Quercetin | UDP-glucuronate | AmUGT | Quercetin 3-O-glucuronide | 687.0 | [20] |
| Luteolin | VvUGT | Luteolin 7-O-glucuronide | 300.0 | ||
| Quercetin | TDP-rhamnose | AtUGT78D1 | Quercetin 3-O-rhamnoside | 150.0 | [24] |
| Kaempferol | Kaempferol 3-O-rhamnoside | 200.0 | |||
| Myricetin | TDP-rhamnose | AtUGT78D3 | Myricetin 3-O-rhamnoside | 25.8 | [32] |
| Glucose | UDP-rhamnose | AtUGT78D1 | Kaempferol 3-O-rhamnoside | 57.0 | [34] |
| Quercetin | UDP-rhamnose | RhaGT | Quercetin 3-O-rhamnoside | 1120.0 | [25] |
| Quercetin | UDP-glucoseUDP-rhamnose | AtUGT78D2AtUGT89C1 | Quercetin3-O-glucoside-7-O-rhamnoside | 67.0 | [26] |
| UDP-rhamnose | AtUGT78D1AtUGT89C1 | Quercetin 3, 7-O-bisrhamnoside | 67.4 | ||
| Quercetin | UDP-xylose | AtUGT78D1 | Quercetin 3-O-xyloside | 23.8 | [29] |
| Quercetin | UDP-xylose | AtUGT78D3 | Quercetin 3-O-xyloside | 160.0 | [28] |
| UDP-arabinose | Quercetin 3-O-arabinoside | 160.0 | |||
| Quercetin | UDP-galactose | PhUGT | Quercetin 3-O-galactoside | 280.4 | [21] |
| Quercetin | UDP-galactose | PhF3GT | Quercetin 3-O-galactoside | 940.0 | [25] |
3.4 黄酮的半乳糖基化修饰
大肠杆菌內源UDP-葡萄糖4-异构酶(galE)催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的相互转化，但大肠杆菌BL21(DE3)缺失galE基因。Kim等[21]在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了大肠杆菌DH5α的galE基因和黄酮3-O半乳糖苷转移酶PhUGT，实现了槲皮素3-O-半乳糖苷的合成。水稻OsUGE基因具有galE功能，大肠杆菌BL21(DE3)中表达OsUGE优于galE基因，槲皮素3-O-半乳糖苷产量增加1.9倍，最终经过60小时的生物转化，产量达到280.4mg/L。
4 结论和展望以黄酮类化合物为受体，活性糖为供体，在糖基转移酶的催化下，已经在大肠杆菌和酿酒酵母中人工合成了黄酮糖苷类天然产物，为工业化规模生产展示出良好的前景。合成生物学的研究，不仅可合成天然黄酮糖苷，还可合成非天然的黄酮糖苷，增加了黄酮糖苷的结构和活性文库。UDP-4-脱氧-4-甲酰胺-L-阿拉伯糖(UDP-L-Ara4FN)是UDP-阿拉伯糖的衍生物，Kim等[35]以UDP-阿拉伯糖作为糖基供体，槲皮素为黄酮受体的糖基转移酶AtUGT78D3，在大肠杆菌中合成了槲皮素-3-O-甲酰胺-阿拉伯糖。根据UDP-(N-乙酰)-葡萄糖胺(UDP-NAG)与UDP-葡萄糖结构类似，使用糖基转移酶AtUGT78D2，在大肠杆菌中实现了槲皮素-3-O-NAG的合成[36]。非天然的黄酮糖苷类化合物的合成大大拓展了微生物合成黄酮糖苷类化合物的应用。随着代谢工程以及合成生物学的发展，基因重组编辑技术的突破[37]以及DNA合成技术的推动[38]，还将会有更多新奇的黄酮糖苷类化合物合成。
在微生物中合成黄酮糖苷，由于糖基转移酶对其底物的特异性不强，往往识别多个底物，或对其它位点进行糖基化修饰，导致副产物生成，制约了目标产物的积累。因此，通过生物信息学方法对糖基转移酶结构的分析、预测，并利用蛋白质工程进行改造，是微生物合成黄酮糖苷的一个重要研究方向。一方面，通过提高糖基转移酶的异源催化活性，增强与底物结合的专一性，减少副产物，合成单一糖基化产物；另一方面，对糖基转移酶的结构进行改造，催化新型糖基化产物，包括新型黄酮单糖苷、黄酮双糖苷、黄酮寡糖苷、黄酮多糖苷，甚至不同糖基供体连接到黄酮类化合物的不同位点，形成黄酮杂糖苷类化合物。
UDP-葡萄糖是转化合成多种多样的UDP-糖的枢纽，是黄酮糖苷类化合物合成的关键底物。UDP-葡萄糖用于黄酮糖苷的合成，必然影响细胞的生长和基础代谢，因此，需要兼顾产物合成与细胞的生长。以葡萄糖为合成糖基供体，其他碳源如甘油、果糖以及蔗糖等，可有效提供细胞生长所需的底物。使用生物质的水解液，组合不同碳源，进行混合碳源发酵，也将是未来微生物生产黄酮糖苷类化合物的一个重要的研究方向。
黄酮糖苷比黄酮的结构更复杂[5]，在微生物代谢改造黄酮生物合成途径的同时，还需改造糖基供体途径，不仅极大加重工程细胞的代谢负担，同时也受到优化方法的限制。随着代谢合成途径规模和复杂程度越来越高，越来越多的研究者开始利用混菌体系构建目标产物的合成途径[39-40]，并取得可喜的效果。如果一株工程菌只合成黄酮受体，另一株工程菌只合成糖供体，进行混合培养，将有望实现黄酮糖苷的高效合成。人工合成混菌体系，不同菌株的功能分工，协同完成黄酮糖苷的合成，具有更强的工业适应性和稳定性。
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