2016, Vol. 36文章信息
- 虞晓丹, 吴秀秀, 姚冬生, 刘大岭, 谢春芳.
- YU Xiao-dan, WU Xiu-xiu, YAO Dong-sheng, LIU Da-ling, XIE Chun-fang.
- 基于分子结构评价的Bacillus subtilis β-1, 4-内切木聚糖酶胰蛋白酶抗性的理性设计
- Trypsin-resistant Improvement of Bacillus subtilis β-1, 4-endoxylanase by Rational Design Based on Molecular Structure Evaluation
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(8): 80-88
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(8): 80-88
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160811
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-04
- 修回日期: 2016-03-21
2. 暨南大学微生物技术研究所 广州 510632；
3. 暨南大学生物工程系 广州 510632
2. Institute of Microbial Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China;
3. Department of Bio-engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China
木聚糖是一种多聚五碳糖，由β-D-1, 4木糖苷键连接，并带有多种取代基的多聚糖。木聚糖是植物细胞中半纤维素的主要成分，占植物细胞干重的35%，是一种丰富的生物质资源，是自然界中除纤维素之外含量最丰富的多糖[1]。在自然界中，木聚糖酶分布广泛，很多微生物如细菌、真菌和放线菌都产生木聚糖酶[2]。木聚糖的降解由木聚糖酶系协同完成，其中木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是最为关键的水解酶。
随着木聚糖酶在食品、饲料等领域应用的不断深入，对木聚糖酶的稳定性方面的要求也越来越高。例如在饲料领域，优质的木聚糖酶应该具有高酶活性，还要具有良好的热稳定性，在较宽泛的pH区间具有稳定性，能抵抗动物胃蛋白酶、胰蛋白酶的降解等。饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的，消化道中的蛋白酶对饲用酶的分解是影响饲用酶使用效率的重要原因，因此，具有蛋白酶抗性是饲用酶十分重要的性质。
在木聚糖酶性质的改造上，不论是基于非理性设计的定向进化[3-6]，还是基于理性设计的定点突变[7-12]，目前都集中在热稳定性、耐酸性方向的研究，本课题组报道过对β-甘露聚糖酶的胰蛋白酶的抗性改造[13-14]，但是对木聚糖酶的蛋白酶抗性的改造还未见报道。胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族，它能特异性水解赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧肽链，其活性部位有三个极性残基His57、Asp102、Ser195形成催化三联体，此活性部位位于酶分子表面凹陷的小口袋中，在口袋的底部，有一个负电荷的Asp189，有利于结合正电荷的Arg和Lys残基[15]。本研究是基于胰蛋白酶的酶催化原理结合计算化学的理论方法对Bacillus subtilis 168 β-1, 4-内切木聚糖酶(XynA)进行胰蛋白酶抗性改造，获得了胰蛋白酶抗性提高的突变体，并进行相关的酶学性质分析。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒Bacillus subtilis 168菌株、大肠杆菌DH5α菌株、大肠杆菌BL21 (DE3)菌株以及pET-32a载体均由本室保藏，pMD18-T载体购自TaKaRa公司。
1.2 酶、试剂盒和试剂EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ购自Fermentas公司，T4 DNA Ligase购自NEB公司，高保真KOD酶购自TOYOBO公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自BioTeke公司；木糖、木聚糖和胰蛋白酶购自Sigma公司；DNA Ladder和蛋白质Marker购自Invitrogen公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 生物信息学分析 1.3.1 同源建模通过Discovery Studio 4.1 (DS 4.1)软件的MODELER自动建模程序构建Bacillus subtilis 168 β-1, 4-内切木聚糖酶(XynA)序列的初始3D模型，通过优化模型得到了XynA的最佳构象。
1.3.2 突变位点的选择及突变体的确定用DS 4.1软件分析XynA的三维结构，找出结构中所有胰蛋白酶赖氨酸和精氨酸的水解位点，进行溶剂可及性分析，选择暴露程度大且远离活性中心的赖氨酸和精氨酸作为候选突变位点，并进行模拟突变效应能量筛选，选择最低能量构象所对应的突变体作为突变氨基酸组合。
1.4 Bacillus subtilis 168基因组的提取采用酚氯仿法[16]对Bacillus subtilis 168的基因组DNA进行提取。
1.5 木聚糖酶XynA野生型及突变体全长基因的获得从枯草芽孢杆菌数据库中( http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)获取XynA的DNA序列，用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，序列信息见表 1。以Bacillus subtilis 168的基因组DNA为模板，引物UP和DOWN为上下游引物进行PCR扩增，获得野生型全长DNA XynA。PCR反应体系为：模板1.2 μl, 上游引物UP 1.2μl, 下游引物DOWN 1.2μl, 10×Buffer 4μl, dNTPs (2mmol/L) 4μl, MgSO4 (25mmol/L) 2.4μl, KOD-Plus-酶0.8μl, ddH2O 25.2μl, 反应总体系为40μl。PCR循环程序为：94℃预变性2min; 扩增循环94℃ 30s，56℃ 30s，68℃ 1min，30cycles；68℃ 5min。
以扩增得到的野生型全长基因XynA为模板，正向突变引物(mutant121sense)和反向突变引物(mutant121antisense)见表 1，采用重叠延伸PCR法[17]扩增出单点突变的全长基因XynAR121C。以扩增得到的XynAR121C单点突变体全长基因为模板以及引物mutant98sense和mutant98antisense扩增出两点组合突变的全长基因XynAR121C/K98Q。以扩增得到的野生型全长基因XynA为模板以及引物mutant39sense和mutant39antisense扩增出内部对照全长基因XynAK39I。
| Primer name | Primer sequence (5′-3′) | Size (bp) |
| UP | CGGAATTCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCT | 33 |
| DOWN | CCAAGCTTTTACCACACTGTTACGTTAGA | 29 |
| mutant121sense | CTTCCATTGATGGCGATT*GCACTACTTTTACGC | 33 |
| mutant121antisense | GCGTAAAAGTAGTGCA*ATCGCCATCAATGGAAG | 33 |
| mutant98sense | TATAAAGGTACTGTAC*AAAGTGATGGGGGTAC | 32 |
| mutant98antisense | GTACCCCCATCACTTTG*TACAGTACCTTTATA | 32 |
| mutant39sense | CCGGAAATTTTGTTGTTGGTAT*AGGTTG | 28 |
| mutant39antisense | TCCAACCTA*TACCAACAACAAAATTTC | 27 |
| * Indicate the mutated base | ||
1.6 重组质粒的构建
PCR扩增得到的XynA、XynAR121C、XynAR121C/K98Q、XynAK39I基因经琼脂糖凝胶电泳纯化回收，用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ进行双酶切，载体pET-32a也进行同样的双酶切，并纯化回收DNA凝胶，载体和目的基因以摩尔比1：3~1：10的比例混合，16℃连接过夜。
1.7 重组质粒的转化及鉴定将连接产物转化至CaCl2法制备的E.coli DH5α感受态细胞中，37℃培养12 h。把PCR验证为阳性的菌株取菌液送往Invitrogen公司进行测序。将序列正确的重组质粒转化至CaCl2法制备的E.coli BL21 (DE3)感受态细胞中，挑取单克隆于5ml LB液体培养基中(Amp+) 37℃培养过夜，抽提质粒DNA，EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定重组质粒。
1.8 诱导表达将表达野生酶和突变酶的E.coli BL21 (DE3)于LB液体培养基中(Amp+)，37℃，250r/min培养至OD600分别为1.0时加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37℃ 250r/min振荡培养4 h，5 000 g 4℃离心10 min收集菌体。
1.9 重组蛋白的纯化DEAE阴离子层析平衡缓冲液重悬菌体细胞，使用超声波细胞破碎仪对菌体进行细胞破壁。待菌液破壁完全澄清后，菌液4℃10 000g离心10 min，收集上清即为蛋白样品粗提物，用SDS-PAGE电泳检测。蛋白粗提物经过阴离子层析(DEAE-Sepharose Anion-Exchange Chromatography)和Ni离子层析(Ni-Affinity Chromatography)进行纯化。
1.10 木聚糖酶的酶活力分析与鉴定木聚糖酶活力测定采用DNS法[18]。以1%的燕麦木聚糖为底物，溶解于pH 6.0，0.04 mol/L Na2HPO4-0.02 mol/L柠檬酸缓冲液。酶溶液也用相同的缓冲液适当稀释。取70 μl底物溶液加10μl稀释过的酶溶液，60℃反应10 min，加入200 μl的DNS试剂终止反应，100℃显色10 min，冷却至室温，于540 nm处测量反应液的光吸收值，根据标准曲线计算生成的还原糖的量，同时设定灭活酶为对照组。木聚糖酶的活力单位(U)定义为：在上述测活条件下，每分钟水解木聚糖生成1 μmol木糖所需要的酶量。
1.11 酶学性质分析 1.11.1 最适pH和最适温度经纯化的木聚糖酶在60℃下，分别在不同的pH (其中3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0的0.04 mol/L Na2HPO4-0.02 mol/L柠檬酸和9.0、10.0、11.0的0.05 mol/L甘氨酸-NaOH)缓冲液条件下进行酶促反应以测定其最适pH。按上述方法分别测定木聚糖酶的酶活力，以活性最高的组为100%，计算各pH条件下酶的相对活力。
将纯化后的木聚糖酶与底物混合后分别在不同温度下(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)按上述测活方法测定酶活力，以活性最高组为100%，计算各温度条件下酶的相对活力，并作图分析。
1.11.2 胰蛋白酶溶液中抗性分析纯化后酶液与人工模拟肠液(pH 6.8, 10 mg/ml胰蛋白酶溶液)按照质量比10：1混合，于40℃保温，每隔30 min取样，按上述测活方法测定酶活力，以未经胰蛋白酶溶液消化处理的酶液活力为100%，计算野生型酶和各突变体酶经胰蛋白酶溶液处理后残留相对酶活力。
2 结果与分析 2.1 生物信息学分析 2.1.1 同源建模使用DS 4.1软件中的MODELER模块进行XynA的同源建模及优化操作。以与目标序列一致性为99%的Bacillus subtilis 168 β-1, 4-内切木聚糖酶(PDB ID:2Z79_B)为模板建模。优化处理后的XynA用Profile-3D进行氨基酸残基的兼容性测评，优势构象结构兼容性得分为103.33，远高于临界分37.53。如图 1所示，经拉氏图(Ramachandran plot)评估，模拟结构中98.7%的二面角(Φ, ψ)落在一般允许区，1.3%的二面角(Φ, ψ)落在边缘区，分别为Asn113和Ala164，它们不是胰蛋白酶水解位点故不影响后续模拟突变实验。以上评估结果说明建模结构的可信度高，可用于后续实验。图 2a为XynA模拟三维结构图。
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| 图 1 B. subtilis 168 β-1, 4-内切木聚糖酶(XynA)优化模型的拉氏图评估结果 Figure 1 The Ramachandran plot of XynA after optimization |
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| 图 2 XynA及其突变体的三维结构模型 Figure 2 The three-dimensional structure of XynA and mutants Highlighted in red is a mutation amino acid(a)XynA (wild type) (b)XynAR121C (c) XynAR121C/K98Q (d) XynAK39I |
用DS 4.1分析XynA的模拟三维结构模型得到12个胰蛋白酶的水解位点。溶剂可及性分析结果如表 2所示，按照胰蛋白酶水解位点暴露程度的降序排列。最终将暴露程度最高的两个氨基酸位点R121和K98作为突变位点，以及K39作为内部突变对照位点。用DS 4.1软件对各个突变位点模拟突变，选择能够使突变体与野生型结构稳定性相近或是稳定性更好的氨基酸作为更替氨基酸。通过氨基酸虚拟突变后最终确定了单点突变体XynAR121C和两点突变体XynAR121C/K98Q作比较，单点突变体XynAK39I作为内部突变对照。图 2b、图 2c和图 2d分别为三个突变体的三维结构图。以50ns的模拟步长对XynA和各个突变体通过分子动力学模拟进行结构匹配性评价，结果如图 3所示，在最初的30ns的动力学模拟过后，XynA及其三个突变体的碳原子骨架的RMSD值保持稳定，突变体XynAR121C的RMSD值与野生型更接近。
| No. | Amino acid residue | Solvent accessibility |
| 1 | Arg121 | 189.144 |
| 2 | Lys98 | 157.813 |
| 3 | Lys153 | 114.047 |
| 4 | Arg111 | 96.876 |
| 5 | Arg134 | 95.731 |
| 6 | Arg94 | 84.688 |
| 7 | Arg72 | 75.296 |
| 8 | Arg48 | 57.862 |
| 9 | Arg88 | 51.149 |
| 10 | Arg135 | 29.602 |
| 11 | Arg131 | 23.883 |
| 12 | Lys39 | 8.019 |
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| 图 3 XynA野生型及突变体Cα骨架原子RMSD值随时间变化曲线 Figure 3 The RMSD versus time of Cα backbone atom of XynA and mutants |
以酚氯仿法提取的B.subtilis 168基因组DNA为模板，以上游引物UP和下游引物DOWN为引物扩增出约660bp的片段，全长命名为XynA，如图 4所示。
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| 图 4 野生型全长目的基因PCR扩增结果 Figure 4 The overall length of the wild type by PCR M:DNA Ladder; 1:654bp fragment |
以野生型基因XynA为模板，以上游引物UP和反向引物mutant121antisense进行第一轮PCR扩增出上游约465bp的片段；以下游引物DOWN和正向引物mutant121sense进行第二轮PCR扩增出下游约214bp的片段，如图 5。再以上下游片段为模板，以上下游引物UP和DOWN为引物，扩增出含有突变位点的全长目的基因，命名为XynAR121C，如图 6。同理，运用重叠延伸PCR法获得突变体全长基因XynAK39I和XynAR121C/K98Q。
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| 图 5 重叠延伸PCR获得XynAR121C上下游片段 Figure 5 Obtaining the upstream and downstream segments of XynAR121C by overlapping PCR M:DNA Ladder; 1:465bp fragment; 2:214bp fragment |
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| 图 6 重叠延伸PCR获得突变体全长基因XynAR121C Figure 6 Obtaining of the full-length gene of mutant XynAR121C by overlapping PCR M:DNA Ladder; 1:The mutated gene |
将PCR纯化回收后的含目的基因XynAR121C的重组质粒pET-32a转入E.coli DH5α中，挑取阳性克隆进行双酶切鉴定，如图 7所示。测序结果也显示突变基因序列正确。将序列正确的重组质粒转化至CaCl2法制备的E.coli BL21 (DE3)感受态细胞中，构建XynAR121C表达系统。同时构建XynA、XynAK39I和XynAR121C/K98Q表达系统。
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| 图 7 重组子双酶切鉴定 Figure 7 The identification of recombinant by EcoR Ⅰ +Hind Ⅲ digestion M:DNA Ladder; 1:Negative control; 2:Target fragment |
对含有XynA及其突变基因的宿主菌E.coli BL21 (DE3)进行诱导培养4h后，超声破碎细胞，取破碎液上清进行DEAE阴离子层析以及Ni离子亲和层析后，在20.4 kDa处得到较纯的目的条带。如图 8为野生型XynA的纯化结果。
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| 图 8 DEAE-阴离子层析，Ni离子层析纯化XynA蛋白 Figure 8 Purification of XynA using DEAE-anionic chromatography and Ni ion chromatography M:Protein marker; 1:Crude enzyme; 2:DEAE-elution peak; 3:Ni-elution peak |
在最适温度下，分别测定不同pH值对野生型及突变体酶的酶活力影响，如图 9所示，野生型与突变体的酶活力相近，野生型酶和突变体酶在pH 6.0时均表现出最大酶活力，它们的最适反应pH为6.0。
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| 图 9 pH对野生型和突变体酶活性的影响 Figure 9 Effects of pH on the activity of the wild type and the mutated enzymes |
在不同温度条件下测定XynA及各突变体的酶活力，结果如图 10所示，XynA、XynAR121C、XynAR121C/K98Q在60℃时表现出最大酶活力，即反应的最适温度为60℃；而XynAK39I在40℃时表现出最大的酶活力。对于XynA、XynAR121C和XynAR121C/K98Q，在60℃之前，随着温度的升高，酶活力逐渐增加；当反应温度超过90℃时，酶活力急剧下降；在100℃时，XynAR121C、XynAR121C/K98Q突变体残留相对酶活力仍有35%。对于XynAK39I，在25℃时，酶活力为最适温度的50%，随着温度的升高，酶活力逐渐增加；当反应温度超过40℃时，酶活力急剧下降，超过80℃时，残余酶活力不到15%。
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| 图 10 温度对野生型和突变体酶活性的影响 Figure 10 Effects of temperature on the activity of the wild type and the mutated enzymes |
用人工模拟肠液处理野生型酶和突变体酶，每隔30 min取样测活，结果表明突变体酶XynAR121C/K98Q的残留酶活力明显比野生型酶高，如图 11所示。对野生型酶及突变体酶在胰蛋白酶溶液中稳定性的半衰期分别为：XynA的半衰期为127 min；突变体XynAR121C的半衰期为193 min，是野生型的1.52倍；XynAR121C/K98Q的半衰期为257 min，是野生型的2.02倍；XynAK39I的半衰期为90 min，比野生型缩短了37 min，结果如图 12所示。结果表明除在分子内部突变体(XynAK39I)对胰蛋白酶抗性没有提高外，其他的突变体(XynAR121C，XynAR121C/K98Q)的胰蛋白酶抗性都得到明显的提高。
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| 图 11 野生型及其突变体在胰蛋白酶溶液中的稳定性 Figure 11 Effect of trypsin treatment on stability of the XynA and mutants |
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| 图 12 野生型及其突变体在胰蛋白酶溶液中的半衰期 Figure 12 Effect of trypsin treatment on half-life period of the XynA and mutants |
蛋白质的理性设计，通常需要依赖蛋白分子结构与其功能相关方面的信息积累(如序列、结构功能区或相关的突变研究的结果)，才能有目标地选取突变位点进行改造，对于某些缺乏研究积累的蛋白分子的性质改造，如蛋白酶抗性的改造，在选择所需要的突变位点时，通常所采用的理性改造方法设计无法解决突变点的选择。本研究的目的是对木聚糖酶进行胰蛋白酶抗性的改造，我们尝试基于酶促反应与分子结构评价，选择理性设计的突变位点。突变位点主要选择胰蛋白酶的水解作用位点；尽量远离蛋白质的活性中心；而且应尽量暴露在蛋白分子的外表面。通过借助同源建模、虚拟突变、分子动力学模拟等计算机辅助手段选取了XynA的R121和K98两个氨基酸位点进行单点和两点组合突变，并选择了位于分子内部的K39为对照突变位点。
在确定突变体组合类型时，主要考虑在不影响蛋白整体结构稳定的同时，尽量提高酶的胰蛋白酶抗性。为此，在进行生物学实验验证之前，借助于计算机辅助手段，同时评价野生型与突变体整体结构的稳定性和相似性，确定待突变的氨基酸位点和突变氨基酸的组合类型：单点突变类型为XynAR121C，两点组合突变类型为XynAR121C/K98Q，对照组突变类型为XynAK39I。
单点突变体XynAR121C由于只突变了远离酶活性中心的一个位点，酶蛋白的大部分理化性质没有改变，突变酶XynAR121C和野生型酶的基础酶学性质类似，它们的最适温度都是60℃，最适pH都是6.0。两点突变体XynAR121C/K98Q也与野生型酶酶学性质类似。对照突变体XynAK39I的最适温度和最适pH虽然与野生型相似，但其温度稳定性较野生型差，当温度高于40℃时，酶失活的速度明显加快，且XynAK39I的最适温度为40℃，与野生型相比也发生了较大改变。导致XynAK39I热稳定性差及最适温度发生显著变化的原因可能是K39与周围氨基酸残基形成了八对氢键，而突变为I39后其与周围氨基酸残基生成的氢键只有四对。氢键数目的减少使得XynAK39I的热稳定性减弱。推测突变成的氨基酸Ile与原残基Lys极性的差异导致酶蛋白结构的微小变化，从而影响了酶蛋白最适温度。另外待突变氨基酸Lys是一个温度敏感性残基，当将其突变为中性氨基酸Ile时，导致了内部对照突变体最适温度的变化。
理论上K39I是内部突变，不影响分子表面的胰蛋白酶水解位点，但其胰蛋白酶抗性却比野生型更低，这表明分子理性设计必须经过生物学实验验证才能得到最终的结果。本研究基于酶促反应与分子结构评价成功改造并使β-1, 4-内切木聚糖酶对胰蛋白酶的抗性提高了2.02倍和1.52倍。
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