基因工程的一项基础技术是功能序列(DNA)的改造。功能序列改造的目的，是改变原有序列的功能，减少其部分功能或赋予新的功能。从一段DNA序列看，改造的方式主要有缺失(deletion)、插入(insertion)、替换(substitution)或者这三种方式间的组合。在一段DNA中缺失、插入或替换单个或少数几个碱基时，我们可以利用多种方法来完成^[1-3]。当需要插入或替换较大片段时，以往多利用限制性核酸内切酶酶切和连接反应来实现。然而，由于待改造序列的多样性，往往不一定有合适的酶切位点可以利用，尤其是当我们需要对一段序列进行扫描式插入或替换改造，以寻找最佳的插入或替换方式时，传统的酶切+连接方式将变得复杂，甚至难以实现。例如，我们要在一段长1kb的序列中(已被克隆到某个载体上)，每间隔100bp，分别插入一段特定的外源序列，以考察不同插入位置对功能的影响。此时，试图直接在该片段上选择合适的酶切位点可能构成挑战。不依赖酶切连接的方法^[4-7]，虽然不受酶切位点的限制，但有时有效率偏低和意外重组的问题。

Golden gate克隆是近年发展起来的一种方法，其核心是利用IIS型核酸内切酶而不是常用的II型限制性核酸内切酶。由于IIS型的切割位点在其识别位点之外，因此可以方便地设计粘性末端，所以非常灵活，可以同时对多个片段进行无缝连接^[8-12]，并且，由于酶切连接后的序列不含有识别序列(已被切除)，因此可将酶切和连接反应在同一个反应管中进行，从而简化操作。

本文中，我们利用Golden gate方法结合混合克隆策略(简称Gmix)，以乙肝病毒基因组DNA为改造对象，将Gaussia荧光素酶(Gluc)基因^[13]，用替换、插入和替换+插入三种方式，扫描式插入乙肝病毒基因组DNA的特定区域。我们认为，相对传统方法，本方法更高效简便，成本更低，非常适合于其他DNA序列的类似改造工作。

1 材料与方法 1.1 材料

质粒PCH9/3091由德国弗莱堡大学Nassal实验室构建^[14], 中国人民解放军第三军医大学西南医院兰林博士赠送。质粒PCH9 d200-1000为在PCH9/3091基础上，删除其中HBVnt200-1000片段。质粒pG4S-Gluc为本实验室构建，含有Gaussia荧光素酶基因片段，且其N端带有长度为47aa的甘氨酸-丝氨酸(G4S)接头，其结构见图 1E。2XPrimeSTAR HS Mix为TaKaRa公司产品; Es Taq mix为康为世纪产品；胶回收试剂盒为QIAGEN公司产品; BsmBI为Thermo scientific公司产品; T7 DNA ligase为Enzymatics公司产品；Gluc荧光素酶检测试剂盒为NEB公司产品。本文所用PCR引物序列见表 1。

1.2 方法

1.2.1 G4S-Gluc片段扩增

G4S-Gluc片段的扩增体系：10 ng pG4S-Gluc模板，引物F g4s GG(10μmol/L)及R gluc(10μmol/L)各0.4μl，2×PrimeSTAR HS Mix 10μl，灭菌超纯水补齐体积至20μl。反应条件：95℃预变性3 min，95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 45s，35个循环。

1.2.2 载体+HBV DNA片段扩增

各个载体+HBV DNA片段的扩增体系：10 ng模板(PCH9/3091或者PCH9 d200-1000)，上下游引物各0.4μl(各片段扩增的引物组合见表 2)，2XPrimeSTAR HS Mix 10μl，灭菌超纯水补齐体积至20μl。反应条件：95℃预变性3 min，95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 3min，35个循环。

1.2.3 扩增片段胶回收纯化

G4S-Gluc片段直接胶回收。各个载体+HBV DNA片段中PCR扩增效果较好的做组内等体积混合胶回收，共有4组混合方式：3+4+5，7+8+9+10，12+13+14+15，17+18+19+20(数字分别对应表 2中的电泳编号)。扩增效果较差的，另外分为两个片段扩增，后面单独做3个片段克隆。胶回收操作按厂商说明书进行。

1.2.4 Golden gate混合克隆

上述各组混合胶回收产物，分别与G4S-Gluc片段做Golden gate反应。反应体系：BsmB I 0.75μl，T7 ligase 0.25μl，Tango buffer 1μl，DTT(10mmol/L)1μl，ATP(10mmol/L) 1μl，G4S-Gluc 1μl(50ng)，混合片段1μl(60ng/μl)，灭菌超纯水补齐体积至10μl。反应条件：37℃ 5min，20℃ 5min，循环25次。80℃ 20min灭活反应。Golden gate产物转化DH5ɑ感受态细菌，涂板。

1.2.5 克隆鉴定

挑取平板上过夜培养的菌落至96孔板中，在含氨苄青霉素的液体LB培养基中37℃培养3h，直接取菌液做PCR鉴定。反应体系：菌液0.2μl，引物F HBV1871(10μmol/L)及R Gluc26(10μmol/L)各0.4μl，2×Es Taq Mix 10μl，灭菌超纯水补齐体积至20μl。反应条件：95℃预变性5 min，95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20s，35个循环。PCR产物做2%琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小判断克隆是否正确，经PCR鉴定正确的克隆通过测序进行最终确认。

2 结果 2.1 克隆策略

PCH9/3091是含有HBV1.1×基因组DNA的质粒(图 1A)，能表达HBV复制所需的各种成分，包括核心蛋白，聚合酶和前基因组RNA(pgRNA)。根据前人的研究结果，我们知道位于核心蛋白基因内的一段序列被去除后，不会显著影响HBV DNA复制(在反式提供核心蛋白的情况下)^[15]。我们的目的，是希望研究一个外源DNA片段插入到这段区域后，是否影响HBV DNA复制。由于该区域长度约800bp，我们希望知道该外源片段插入到该区域的何种具体部位，以何种方式插入时，可以最少地干扰HBVDNA的复制。

由于以往报道中，除了片段缺失结果以外，缺少更多有助于进一步分析的信息^[15-16]，因此我们需要采用无偏见的扫描方式来进行测试。如图 1所示，我们将采用三种方式进行等分扫描。(1)替换：即将Gluc片段每间隔大约45bp，替换HBV DNA的相应区域，被替换的区域与Gluc片段等长(图 1A)；(2)插入：即将Gluc每间隔大约100bp，插入到HBV DNA相应位置，原有HBV DNA序列不变(图 1B)；(3)部分替换(或者缺失+插入)：即将Gluc间隔大约100bp，插入到HBV DNA相应位置，原有HBV DNA序列被去除500bp(图 1C)或者200bp(图 1D)。

以上四种方式共计需构建20种克隆。为了使克隆过程更快速简便，我们采用了Golden gate结合混合克隆的策略。这些克隆的插入片段序列相同，都是Gluc基因，所不同的是外源片段与HBV DNA序列的连接位置。以替换的情况为例，插入片段有一种，载体序列有5种，首先分别扩增Gluc和5种载体片段(图 2)，扩增载体所用引物的5′末端均带上BsmB1识别序列，并使得其被切割后，形成同样的粘性末端，扩增Gluc的引物上，亦带有BsmB1识别序列，在其被切割后，所形成的粘性末端与载体片段上的粘性末端互补(图 2)。其次，为了简化后续操作，我们将载体扩增片段的PCR产物混合起来(实际操作中，根据PCR扩增效果，可能是3种或4种产物混合。见后文)，进行一次胶回收纯化(图 2a)，然后将这个纯化的混合物与同一个插入片段做Golden gate反应(图 2b)。最后，为了便于克隆鉴定，我们设计了一对引物，上游引物位于1922附近，下游引物位于Gluc片段的5′末端，这样，就可以用同一个PCR反应体系和条件，对所挑取的克隆同时鉴定，然后依据PCR产物的分子量大小，确定这些克隆分别是在何种位置含有替换的Gluc片段(图 2c)。

2.2 片段与载体的扩增及混合胶回收

载体与Gluc片段PCR扩增所用的引物和模板如表 2所示。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，图 3显示了检测结果(由于电泳上样时用8通道移液器，故泳道编号为间隔排列)。预期各载体扩增片段的大小应约为6kb，从图 3可见，用于替换突变的1、2号，用于插入突变的6号，用于替换Δ500+插入的11号，以及用于替换Δ200+插入的16号，均没有扩增出预期大小的条带或者目标条带很弱，其原因是载体片段上的HBV序列为重复序列(图 1)，若引物可与重复部分退火，则优先扩增较短的片段(1、2、6、11、16号中较短的明亮条带)。其余载体片段均能被扩增，但仍可见非特异性条带。Gluc扩增片段大小约700bp，与预期相符。

对于扩增效果较好的片段，由于各组内的载体片段大小一致，我们将各片段以等体积(各20μl)混合，然后进行胶回收，目的是减少工作量。混合方式分别为，3+4+5，7+8+9+10，12+13+14+15，17+18+19+20。这几组混合物胶回收纯化后，所得产物DNA浓度约60~70ng/μl。分别取1μl胶回收产物及1μl纯化后的Gluc片段做Golden gate反应。由于1、2、6、11、16号直接扩增效果较差，我们将这几个片段分别分成两个片段进行扩增，然后分别与Gluc各自进行3个片段的Golden gate反应。

2.3 混合克隆鉴定

四组混合Golden gate产物电转化DH5ɑ感受态细菌后，均长出数百个克隆。我们从每组平板分别挑取16个克隆至96孔板中培养3h，然后取0.5μl菌液做PCR鉴定。各组内的混合克隆中，Gluc的插入位置不同，利用这一点，我们设计了一对引物(图 2)，以快速鉴定和区分这些克隆。图 4所示为各组的混合克隆鉴定情况。以替换组为例，该组为3+4+5与Gluc连接组，预期应产生3种克隆，用上述鉴定引物扩增，应可扩增出3种片段，且这3种片段的大小依次相差约45bp。如图 4A左侧部分(sub3-5)所示，可见两种大小明显不同的扩增条带，较小者应为sub3(5个)，较大者应为sub4(3个)。图 4B的右侧部分(sub3-5)是另外一些克隆的鉴定结果，可见有3种大小不同的条带，其中最大者为sub5(共4个)，其余两种为sub3(1个)和sub4(3个)。类似地，我们可以看到，插入组中，PCR鉴定出4种克隆，每种克隆至少有3个，缺失Δ500+插入组和缺失Δ200+插入组亦分别鉴定出所有预期克隆，但delins4和delins8各仅有1个阳性克隆，而delins5则有9个阳性克隆(表 3)，表现出一定的偏性。这种偏性似乎难以用delins5的载体片段(15号)的量较多来解释，因为15号片段并不比12~14号的扩增效果更好(图 3)。我们在各组中，选取了1~2个经PCR鉴定正确的克隆做测序确认，结果显示这些克隆全部含有Gluc插入片段，并且全部以符合预期的方式重组于HBV DNA序列中。因测序结果较多，在此仅展示了sub3的测序结果，见图 5。图 4中还显示了其他3种(sub1，ins1, delins1)因PCR扩增效果较差而改为3个片段连接的鉴定情况，PCR及测序结果均显示这些克隆是成功的。

我们将测序正确的克隆分别转染HepG2细胞，48h后检测其Gluc荧光素酶活性以鉴定其功能。如图 6所示，所有克隆均可表达具有Gluc活性的产物，但不同克隆之间有差异，且这种差异似主要与替换/插入位置有关。各种模式下的1号位置均表现出较强的Gluc活性，包括Sub1、Ins1、Delins1和Delins6，而第2、3、4种模式的第4、5号位插入克隆的Gluc活性相对较低。我们推测，这种趋势可能与Gluc基因的N端融合序列长度有关，因为1号位插入时，Gluc N端所融合的HBV序列较短，而5号位插入时则HBV序列较长，可能对Gluc活性有负面影响。

3 讨论

本文介绍了一种克隆策略，该策略结合了Golden gate反应和混合克隆方式，具有简便、快速、低成本的特点，很适合用来进行片段的插入/替换突变扫描。简便快速主要体现在：(1)PCR产物胶回收混合进行。由于扩增片段大小一致，使得电泳时的迁移速率相同，因此可以合并在一个上样孔中电泳和胶回收。这样虽然导致混合物中每种片段的量和浓度减少，但由于后续Golden gate反应效率较高，因而不会对克隆成功率造成明显影响；(2)Golden gate反应混合进行。由于Golden gate酶切连接反应效率较高，且载体片段之间或插入片段之间不能连接，因而可将多个酶切连接反应合并在一管中进行。对于混合的Golden gate反应，我们并未增加BsmB1和T7 DNA连接酶的量，而是与单个反应相同；(3)用同一套PCR反应体系鉴定所有克隆。由于插入片段相同，但插入位置不同，因此可以用分别位于载体和片段上的引物来鉴定不同的克隆。由于胶回收、Golden gate反应和转化都混合进行，也将使整体的成本降低。本文中采用混合克隆策略所构建的4组克隆，若分开进行的话，则需要进行14次，无疑，前者的时间和金钱成本更低。

Gmix策略的主要限制，在于PCR的扩增效果，以及PCR反应可能带来的突变。有时由于载体较大，或者序列复杂，可能导致PCR扩增效果不佳，因此克隆难以进行。如本文中1、2、6、11、16号的情况，由于重复序列的存在，导致直接扩增整个载体片段效果较差，我们的解决方案，是将载体片段进一步分成两个片段来扩增，然后与插入片段一起进行3个片段的Golden gate反应。另外，由于Taq酶的错误掺入，可能导致PCR产物突变。若突变出现在载体骨架上，则可能在抗性筛选中被去除，若出现在目标序列上，则可能对后续研究造成影响。为了减少和避免这些情况，我们采用了保真性较高的聚合酶，并且通过测序来最终确认所需的克隆。

对于混合克隆数量的上限，我们还没有相关数据来评估。本文中的两组4种克隆混合，转化后均长出数百个克隆，我们各挑取16个，PCR鉴定阳性率分别达到100%和81%，因此我们认为，再增加混合克隆的数量是可能的。增加混合克隆数量，除了连接和转化效率方面的影响外，还需考虑鉴定的便利性，若扩增片段长度差异过小，可能难以通过电泳分辨，本文所设计的鉴定引物，保证相近克隆间的扩增片段长度差异在20%或以上，容易通过较高浓度的琼脂糖凝胶(2%)分辨。若替换/插入扫描密度高，可以考虑采用交叉分组克隆的方式，或者利用分辨率更高的PAGE电泳来鉴定。