2016, Vol. 36文章信息
- 郭超, 王志彦, 甘一如, 李丹, 邓勇, 于浩然, 黄鹤.
- GUO Chao, WANG Zhi-yan, GAN Yi-ru, LI Dan, DENG Yong, YU Hao-ran, HUANG He.
- 技术与方法理性设计改造牛肠激酶的热稳定性
- Engineering Thermostability of Bovine Enterokinase by Rational Design Method
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(8): 46-54
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(8): 46-54
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160807
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文章历史
- 收稿日期: 2016-01-06
- 修回日期: 2016-01-25
2. 系统生物工程教育部重点实验室 天津 300072；
3. 天津化学化工协同创新中心 天津 300072
2. Key Laboratory of System Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072, China;
3. Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering, Tianjin 300072, China
与传统化学催化剂相比，生物催化剂因其具有较高的化学选择性，活性及环境友好等优势，目前正广泛地应用于工业化生产[1]。然而，作为生物催化剂的主体-蛋白酶，在长期的自然进化中，许多蛋白酶已经适应了生物体内的环境，在工业生产苛刻的条件下(如：高温，强酸等)，大部分生物酶不能保持很高的活性，从而极大地限制了其在工业生产中的应用。开发具有高热稳定性的生物催化剂则具有很高的应用前景。在高温下进行的催化反应不但能够提高化学反应速率，同时，能够降低微生物污染的风险，降低反应体系的黏度及增加反应底物或产物的溶解度[2]。
目前，通过蛋白质工程的手段提高生物催化剂热稳定性主要包括定向进化及理性设计两类[3]。理性设计通过分析蛋白质的结构信息及生物化学数据提出一种可能有效的突变策略，然后利用定点突变手段引入突变位点，检测效果。较之定向进化，其具有高效性及普适性强的特点，并有潜力发展成为定量预测蛋白稳定性的算法[4]。在理性设计中，根据蛋白质结构及功能信息分析出对蛋白热稳定性有关键作用的区域(“weak spots”)，是提高蛋白质热稳定性的关键所在[2, 5]，一旦柔性区被确定，就可以通过刚化柔性区来进一步提高蛋白的热稳定性。
蛋白质结构柔性区的预测可以通过实验方法如：核磁共振光谱，氢氘置换实验获得[6]。随着计算机算法的发展，多种生物信息学软件被开发，用以分析蛋白结构从而获得其灵活性数据[7-8]。然而，每种方法都有其优势和劣势。如：从蛋白质的X光衍射晶体结构中获取的B-Factor值可以很好地反映氨基酸残基的灵活性，但是，B-factor值的获取受限于蛋白质的结晶质量、结构分辨率等信息[9]。分子动力学模拟能够在原子水平分析蛋白质的运动性质，但是，它对计算机的运算能力要求很高[10]。通过多种软件结合使用可以更加准确地预测出蛋白的灵活区。
研究表明，脯氨酸具有较强的刚性，由于吡咯环的存在，脯氨酸束缚了Cα-N的旋转并将主链的二面角Φ限制在－63±15°，使得蛋白构象具有较小的自由度[11]。在蛋白质解折叠的过程中，吡咯环对主链进行限制，这将减少蛋白质解折叠构象的数量，增强蛋白质结构的刚性。然而，由于脯氨酸的氨基上不存在氢原子，不能参与氢键的形成，如果脯氨酸的引入位点原有的氨基酸参与氢键的形成，将会破坏氢键，导致蛋白质灵活性的增加[12]。
β-转角是最小的蛋白二级结构，由于其不存在复杂的相互作用力，通常处于蛋白柔性较高的loop内。Watanabe等[13]研究表明，在β-转角或无规卷曲位置引入脯氨酸可以降低蛋白质去折叠时的骨架熵提高蛋白质的热稳定性。此外，Guruprasad等[14]对PDB数据库中的蛋白β-转角序列进行统计分析后，发现熵驱动导致脯氨酸更倾向于存在Ⅰ型和Ⅱ型β-转角的i+1以及Ⅰ型转角的i位置。结合Guruprasad等人研究成果，将脯氨酸引入β-转角的特定位置后显著提高了蛋白质构象的稳定性[15-16]。
基于上述知识，我们尝试在牛肠激酶柔性区内的β-转角中引入脯氨酸以提高其热稳定性。肠激酶(enterokinase, EK)作为一种Ⅱ型丝氨酸蛋白酶，目前，广泛地应用于生物医疗行业。由于天然肠激酶来源有限，近年来，国内外研究多集中在重组肠激酶的表达与纯化[17-20]，但对于肠激酶稳定性改造的研究却不甚了了。相关研究表明[21-23]，通过酶固定化及增加蛋白表面电荷的方法，可以提高肠激酶的稳定性。然而，利用理性设计提高牛肠激酶稳定性的研究则未见报道。在本研究中，不但实现了重组型牛肠激酶在毕赤酵母中的可溶性表达，同时，利用理性设计的方法，对牛肠激酶进行改造，获得了热稳定性提高的牛肠激酶，拓宽了其在工业生产中的应用。
1 材料与方法 1.1 菌株、质粒及试剂质粒pPIC9K及毕赤酵母GS115购自Invitrogen公司，大肠杆菌TOP10为本实验室保存。Phusion® High-Fidelity DNA聚合酶购自Thermo-Fisher Scientific公司。限制性内切酶Sal I及Dpn I购自大连宝生物工程有限公司。Ni SepharoseTM High performance预装柱购自GE Healthcare公司。BCA蛋白定量试剂盒购自北京鼎国昌盛有限公司。其余试剂为进口或国产分析纯。
1.2 突变体菌株的构建利用Quik ChangeTM定点突变的方法构建突变体肠激酶[24]。引物的设计参照TransGen Fast Mutagenesis System试剂盒引物设计原则。突变位点及设计的引物见表 1。PCR反应产物经Dpn I酶切处理以消除亲本模板后，通过热激转化法导入大肠杆菌TOP10感受态中，转化液涂布至含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。从LB平板上挑取单克隆，提取质粒，进行测序鉴定。经测序鉴定正确的重组质粒经Sal I酶切线性化处理后，通过电转化的方法导入毕赤酵母GS115菌株，转化液涂布至含G418抗生素的YPD平板上进行多拷贝子的筛选。
| Mutations | Primers sequence(5′-3′)* | Size(bp) |
| S67P | 5′-CCTCCACAAATTGAAACTAGACTAATTGATCAAATTG-3′(forward) | 37 |
| 5′-AGTTTCAATTTGTGGAGGTGTAAGGTTAGAGGC-3′(reverse) | 33 | |
| R87P | 5′-CTAGGAAAAACAATGACATAGCAATGATGCACTT-3′(forward) | 34 |
| 5′-GTCATTGTTTTTCCTAGGCTTATTGTAATGAGGATT-3′ (reverse) | 36 | |
| Y136P | 5′-CCTCAAGGATCTACCGCTGACGTATTACAAGAG-3′ (forward) | 33 |
| 5′-GTAGATCCTTGAGGGATCAGGGCTCCC-3′ (reverse) | 27 | |
| * Nucleotides that were changed to encode Pro are shown as the underlined sequence | ||
1.3 突变体蛋白的表达与纯化
挑取多拷贝菌株，接种于25 ml BMGY培养基培养至OD600=2~6，3 000 g离心5 min，收集菌体，重悬于25 ml BMMY培养基中进行蛋白的诱导表达。每隔24 h补加甲醇至终浓度为1%(V：V)，30℃，250r/min培养72 h后，8 000r/min离心20 min回收发酵上清液。利用镍离子亲和色谱的方法对蛋白进行纯化。用平衡缓冲液(20 mmol/L sodium phosphate，0.3mol/L NaCl，pH 8.0)平衡Ni SepharoseTM High performance预装柱后，将过夜透析后的培养液上样，分别用平衡缓冲液和洗涤缓冲液(20 mmol/L sodium phosphate，0.3mol/L NaCl，40mmol/L咪唑，pH 8.0)充分洗涤后，再用洗脱缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，0.3mol/L NaCl，300mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱，并收集蛋白峰。SDS-PAGE及BCA法检测纯化后蛋白的纯度及浓度。
1.4 肠激酶动力学参数的测定分别采用肠激酶水解荧光底物Gly-(Asp)4-Lys-β-naphtylamide (GD4K-NA)及对胰蛋白酶原的激活两种方法来测定肠激酶动力学参数。在37℃下，将10 μl纯化后蛋白分别加入到2 ml 0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 mmol/L的GD4K-NA荧光底物中(25 mmol/L Tris-HCl pH8.4, 10 mmol/L CaCl2, 10% DMSO)，酶切反应开始，设定激发光λex=337 nm和发射光λem=420 nm，狭缝宽为10 nm，响应时间为0.08 s，PMT为400 V，测定5 min内荧光吸光度的变化量，将每分钟1个荧光吸光值的增加定义为1AU。
同时，以胰蛋白酶原为底物，测定肠激酶的动力学参数。在25℃下，将1μl纯化后肠激酶酶溶液分别加入到1 ml 8.32、20.8、33.28、41.6、62.4 mmol/L胰酶原底物溶液中，不同时间内，取50 μl酶切反应后样品，加入到1.55ml 0.25mmol/L BAEE底物缓冲液中(67 mmol/L NaH2PO4，pH 7.6)，室温下，以未加肠激酶的胰酶原样品作为空白对照，测定反应液在253 nm处的每分钟吸光值的变化量。依据胰蛋白酶与BAEE标准曲线测得反应液中胰蛋白酶浓度，并求得胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶速率。肠激酶活性单位定义为在25℃, pH 5.6条件下, 每分钟将1 nmol的胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶所需的酶量。
1.5 野生型与突变型肠激酶动力学稳定性测定将纯化后的肠激酶置于60℃水浴中，每隔10 min取出一定量样品冰浴5 min，在25℃下，以胰蛋白酶原为底物测定肠激酶酶活，重复测定3次，取平均值后计算酶的残留活性。肠激酶失活速率常数(td)以酶的残留活性的自然对数为纵坐标，时间t为橫坐标，通过对数据点的线性拟合获得，其酶的失活半衰期(t1/2)计算公式如下：
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(1) |
此外，考察蛋白动力学稳定性的另一指标半失活温度(T50)。将肠激酶置于不同的温度下(25℃~90℃)热处理10 min，冰浴5min后，测定其残留活性，并以酶的残留活性为纵坐标，温度为横坐标作图，计算半失活温度参数T5010。
1.6 肠激酶柔性区的预测从PDB数据库(Protein Data Bank)中获取野生型肠激酶的三维晶体结构文件(PDB ID：1EKB)，利用MODELLER v9.11软件补全结构中缺失的残基。通过GROMACS v4.5.5软件进行分子动力学模拟，力场选定Gromos96.1 (53A6)[25]，溶剂模型为SPC 216，温度设定300 K，常压下进行。体系先后采用最陡下降法(steep descent method)及共轭梯度法(conjugate gradient method)进行能量最小化优化；然后固定蛋白，进行10 000步的约束分子动力学模拟，其中静电相互作用力采用Particle Mesh Ewald (PME)算法，范德华力约束截取半径为1 nm；最后进行5 000 000步的自由分子动力学模拟。利用GROMACS自带的计算工具分析模拟轨迹，g_rmsd程序计算轨迹的均方根方差(root mean square deviation，RMSD)值；g_rmsf程序计算每个残基的均方根涨落(root mean square fluctuation，RMSF)值。
此外，利用B-FITTER软件提取PDB文件中的B-factor值，通过平均一个氨基酸残基内原子的B-factor值来获得每个氨基酸残基的B-factor值，用以衡量蛋白结构的灵活性。通过上传PDB文件至FlexSer服务平台( http://mmb.pcb.ub.es/FlexServ/)，生成Cα模型文件，并结合离散动力学(DMD)[26]，常规模型分析(NMA)[27]以及布朗运动学(BD)[28]中的相关算法对Cα模型文件进行分析，导出对目的蛋白灵活区的预测结果。
2 结果与分析 2.1 肠激酶柔性区的预测利用GROMACS v4.5.5进行的分子动力学模拟，通过计算蛋白质中每个残基的RMSF值来反映构象的灵活度，结构越灵活，柔性越大，相应的RMSF值越高。而利用B-FITTER软件提取的B-factor值，主要体现原子构象状态的一种“模糊度”，B-Factor值越高，模糊度越大，相应部位构象越不稳定。FlexSer服务平台则主要结合了常规模型分析及离散动力学等相关算法，以此来计算氨基酸残基之间的相互作用力，进而得出蛋白结构的灵活区。在本研究中，为了保证预测的准确性，同时利用以上三种软件对肠激酶结构灵活区进行了预测，其结果如图 1所示。比较三种方法预测结果后发现，不同软件预测出的蛋白灵活区略有差异，但Fragment 64~69及Fragment 85~90是三种软件一致确定的结构灵活区，故选定为待刚化的区域。此外，Fragment 135~139是分子动力学模拟预测出的灵活性最高的区域，FlexSer预测结果也显示此区域具有较高的灵活性，最终选定以上三个区域为待突变的灵活区。
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| 图 1 牛肠激酶轻链灵活区的预测 Figure 1 Identification of the flexible regions of bovine enterokinase light chain |
从PDBsum数据库中获取肠激酶的三个柔性区内β-转角信息，其结果见表 2。分析结果后发现，三个柔性区内都存在Ⅳ型β-转角。由于Ⅳ型转角内存在氢键，脯氨酸的引入会破坏原有氨基酸的作用力，因此，排除Ⅳ型β-转角内的氨基酸。此外，结合Guruprasad等[14]研究成果，脯氨酸更倾向存在于Ⅰ型和Ⅱ型β-转角的i+1以及Ⅰ型转角的i位置，且其转角内氨基酸并未参与形成氢键，故选定S67、R87及Y136作为待突变的位点(图 2)。
| Flexible regions | β-turn | Turn type | Position | H-bond | Chsen site |
| 62-ASNL-65 | Ⅳ | Yes | |||
| Fragment 63-69 | 64-NLTS-67 | Ⅳ | Yes | ||
| 67-SPQI-70 | Ⅰ | i | NO | 67S | |
| 85-NKRR-88 | Ⅳ | Yes | |||
| Fragment 85-93 | 86-KRRK-89 | Ⅰ | i+1 | NO | 87R |
| Fragment 135-139 | 133-ALIY-136 | Ⅳ | Yes | ||
| 135-IYQE-138 | Ⅱ | i+1 | NO | 136Y |
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| 图 2 灵活区内引入脯氨酸结构图 Figure 2 Introduction of proline in the flexible regions |
以野生型1EKB结构序列为模板，利用MODELLER 9.11软件生成S67P、R87P及Y136P突变体蛋白的PDB文件，并利用GROMACS软件进行分子动力学模拟，通过计算均方根方差RMSD值，来比较野生型与突变型蛋白整体的稳定性，其结果见图 3。从图 3可知，蛋白质分子结构在轨迹文件中6 ns后都趋于稳定，最终计算10 ns野生型肠激酶的平均RMSD值为0.240 nm，突变株S67P、R87P及Y136P平均RMSD值分别为0.175 nm、0.202 nm及0.265 nm。结果表明，S67P和R87P突变型较野生型具有较低的灵活度，脯氨酸的引入增加了肠激酶整体的稳定性，而将136位酪氨酸突变为脯氨酸后，导致了蛋白分子结构的破坏，肠激酶整体灵活性增加。
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| 图 3 野生型与突变型肠激酶RMSD值比较 Figure 3 Comparison of RMSD values of wide-type and enterokinase mutants |
利用Quik ChangeTM定点突变的方法构建突变体质粒，并导入毕赤酵母GS115中进行突变体蛋白的诱导表达，粗酶液经Ni柱亲和纯化后，每1L发酵液获得5.7 mg具有活性的R87P突变体酶。SDS-PAGE电泳分析发现，突变体R87P蛋白的分子量约为43 kDa，而其理论分子量约为26 kDa。分析肠激酶的一级结构序列发现，其含有3个潜在的N-糖基化修饰位点，利用Endo H (NEB)进行去糖基化处理后，其蛋白表观分子量降低(图 4)。结果表明，利用毕赤酵母GS115诱导表达的重组型肠激酶为N-糖基化修饰的蛋白，其糖基化修饰程度约为20.9%。
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| 图 4 R87P突变体R87P的表达纯化与去糖基化验证 Figure 4 Expression of R87P mutant and deglycosylation results M:Molecular weight marker; 1~2:The purified R87P mutant and R87P deglycosylated by Endo H, respectively |
将纯化后的野生型及突变型肠激酶置于60℃下，每隔一定时间测量其残留活性，并以热处理前的酶活为100%，计算热处理后与热处理前酶活的比值，得到其突变体酶失活曲线(图 5)。由图 5可知，突变型R87P失活速度最慢，在60℃下放置20 min后，仍保持有55.2%的残留活性；与之相比，S67P及野生型肠激酶保持约38.9%及28.8%的残留活性。以酶的残留活性的自然对数为纵坐标，时间t为橫坐标作图 6，并根据公式(1)计算野生型及突变型肠激酶失活半衰期(表 3)。结果表明，R87P及S67P突变型在60℃下的酶失活半衰期(t1/2)与野生型相比分别增加了3.1 min及2.5min，而Y136P的失活半衰期则表现出相应的降低。
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| 图 5 野生型与突变型肠激酶失活曲线比较 Figure 5 The comparision of thermal activition for wild-type and enterokinase mutants |
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| 图 6 野生型与突变型肠激酶失活半衰期测定 Figure 6 The investigation of half-life for the wild-type and enterokinase mutants |
| Enterokinase | t1/2(min) | T5010(℃) |
| Wild type | 20.9 | 58.2 |
| S67P | 23.4 | 58.3 |
| R87P | 24.0 | 70.0 |
| Y136P | 13.9 | 53.6 |
同样地，以热处理前的酶活为100%，计算热处理后与热处理前酶活的比值，可得突变体酶在不同温度下保温10 min后残留酶活力变化曲线(图 7)。由图 7可见，90℃高温条件下，野生型及Y136P突变体酶活几乎全部丧失，而R87P及S67P突变体仍能保持41.1%及25%的残留活性。半失活温度(T5010)测定结果显示(表 3)，R87P较野生型提高了约11.2 ℃。
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| 图 7 野生型与突变型肠激酶热耐受力比较 Figure 7 Comparision of thermal tolerance for wide-type and enterokinase mutants |
综合酶失活半衰期及半失活温度测定结果表明，在67位及87位引入脯氨酸后，蛋白质结构的刚性得到了增强，使得突变体酶可以耐受更高的温度而不丧失活力。其中R87P突变体酶的热稳定性较野生型得到了显著提高。与野生型相比，Y136P突变体热稳定性并未提高，可能由于136位引入脯氨酸后，破坏了蛋白原有的结构进而影响了其活性。
2.6 突变体酶动力学性质由上述结果可以发现，突变体R87P成功提高了肠激酶的热稳定性。为了进一步考察突变体R87P的酶活是否受到影响，我们对酶动力学常数进行了测定，并与野生型进行了比较。在室温下，分别以GD4K-NA和胰蛋白酶原为底物，采用Lineweaver-Burk做图法计算酶动力学参数，结果如表 4所示。测定结果显示，R87P突变型的动力学常数Km及kcat与野生型酶之间没有很明显的差别，表明R87P突变体酶的活性未受影响。
| Enterokinase | GD4K-NA, pH 8.4 | Trypsinogen, pH 5.6 | ||||
| Km(mM) | kcat(S-1) | kcat/Km | Km(μM) | kcat(S-1) | kcat/Km | |
| WT | 0.59 | 45.1 | 76.4 | 140.8 | 0.11 | 7.8×10-4 |
| R87P | 0.56 | 46.5 | 83.0 | 139.2 | 0.13 | 9.3×10-4 |
3 讨论
在蛋白质理性设计的方法中，突变位点的选定是其关键的一步。不适宜突变位点的引入会导致蛋白质结构的破坏及酶活的丧失。所以，在选定突变位点的过程中，需综合考虑蛋白质的活性，稳定性及灵活性之间的关系[29]。适度的灵活性确保了蛋白质能够完成配体的结合，底物的催化修饰以及大分子间的对接等功能。对于某些嗜热酶，在室温条件下，蛋白结构灵活性的降低伴随其催化活性的下降[30-31]。蛋白质结构的刚性则保证了蛋白构象处于正常的折叠状态，但过度的刚性却会导致其酶活的降低。基于此，在理性设计的过程中，首先要保证其突变位点远离酶的催化活性中心，使酶活不受影响。在此基础上，将突变位点选定在蛋白的结构柔性区，以增强结构的稳定性。在本研究中，为了准确地预测出蛋白的柔性区，综合了常用的三种不同软件的预测结果，并结合定点突变实验验证了Fragment 64~69及Fragment 85~90为肠激酶的结构灵活区，通过刚化上述区域可以提高肠激酶的热稳定性。
尽管引入脯氨酸提高蛋白的稳定性已经在众多实验中得到验证[32-34]，但是将脯氨酸引入不合适的位点同样会降低蛋白的稳定性，其中很重要的一个原因在于破坏了原有蛋白内的氢键[12]。因此，在本研究中着重分析了野生型β-转角内氢键的形成情况，确定了三个突变体S67P、R87P及Y136P，并利用Discovery Studio 2.5分析了突变体蛋白的氢键数量。与野生型相比，87位及136位脯氨酸的引入并未导致局部构象氢键数目的改变，而67位脯氨酸的引入则造成局部氨基酸空间位置的重新调整，使得N64与T66形成N64：ND2-T66：OG1及T66： OG1-N64：OD1两对氢键，较野生型多出1对，从而更有利于蛋白结构的稳定。此外，分子动力学模拟及突变体蛋白热稳定性分析实验表明，S67P及R87P突变体较野生型肠激酶热稳定性得到了提高，而Y136P突变体热稳定性则未见提高。为了进一步解释突变位点对于蛋白构象的影响，通过计算野生型及突变型肠激酶分子动力学模拟轨迹中均方根涨落值(RMSF)，来比较野生型与突变型局部区域的灵活性。如图 8a、图 8b显示，67位及87位脯氨酸的引入不但刚化了Fragment 64~69及Fragment 85~90区域的灵活区，也稳定了其前后区域的二级结构。结果表明，脯氨酸侧链的吡咯环结构不仅能够限制脯氨酸主链的转动，同时也能够降低脯氨酸前后位置氨基酸的运动，从而提高了蛋白区域的稳定性进而增强了其整体的热稳定性。同样地，我们对野生型及Y136P突变型肠激酶RMSF值进行了比较，如图 8c所示。结果显示，Fragment 135~139及前后区域的稳定性并没有得到显著的提高，这与在实验中测得的Y136P的热稳定性没有提高的结果相吻合。
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| 图 8 野生型及突变型肠激酶灵活性比较 Figure 8 The residual flexibility of wild-type and enterokinase mutants |
相关研究报道[35]，突变位点的引入，在提高酶热稳定性的同时，可能会降低其催化活性。因而，我们测定了R87P突变体酶的相关动力学常数。结果显示，米氏常数Km及kcat较野生型并没有很明显的差别，这说明肠激酶热稳定性提高的同时酶活没有发生改变。因而，本研究提出的理性设计方法，将柔性区确定为改造蛋白热稳定性的相关区域，并结合β-转角序列统计信息及原有氨基酸位点不参与形成氢键的原则引入脯氨酸，以刚化蛋白的柔性区。将该策略首次应用于肠激酶的热稳定性的改造，成功提高了其热稳定性的同时保持其酶活不受影响，并为其他工业用酶的热稳定性改造提供了可借鉴的思路。
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