文章信息
- 翟兵兵, 马倩, 丁明珠, 元英进.
- ZHAI Bing-bing, MA Qian, DING Ming-zhu, YUANG Ying-jin.
- 谷胱甘肽对VC一步发酵作用的研究
- Study on the VC One Step Fermentation Under Glutathione
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(8): 38-45
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(8): 38-45
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160806
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文章历史
- 收稿日期: 2016-01-28
- 修回日期: 2016-02-26
GSH是一种重要的抗氧化剂,可以防止细胞重要成分的损坏[1-2]。它一旦被氧化,可以利用NADPH为电子供体,在谷胱甘肽还原酶的作用下转变为还原型谷胱甘肽,在细胞内的氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的比例经常被用来作为衡量细胞毒性的依据[3]。这是细胞所产生的主要的内源性抗氧化剂,直接参与中和自由基和活性氧化合物的反应,以及以还原形式维持外源抗氧化剂如维生素C和E的还原状态[4-5]。GSH被用在如DNA的合成和维修,蛋白质的合成,前列腺素的合成,氨基酸转运,酶的活化等的代谢及生化相关的反应,因此,每个系统几乎都受到它的影响[6-7]。
二步发酵法是目前VC发酵的主要方法。目前,氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的改进[8]和酮古龙酸杆菌(Ketogulonicigenium vulgare)的基因组信息[9-10],生长所需营养成分[11]及其与伴生菌的关系[12-13]已经进行了大量深入的研究。但由于二步发酵的产酸效率已经较高,在产量的进一步提高方面存在困难。与此同时,二步发酵步骤繁琐,能耗较高,如能将二步发酵工艺改进为一步发酵,可显著节约能耗,降低污染,显著提高经济效益。Sugisawa等[14]从普通古龙酸菌DSM4025发现了催化L-山梨糖转化为KGA的醇醛脱氢酶,确认了山梨醇脱氢酶基因,将其导入DSM4025,实现了从D-山梨醇一步发酵生成2-KGA。Sonoyama等[15]提出应用G.oxydans实现山梨醇到古龙酸的发酵。江南大学Gao等[16]通过在G.oxydans内过表达山梨糖脱氢酶、山梨酮脱氢酶及辅酶PQQ,在该菌中实现了由山梨糖到2-KGA的一步转化,发酵周期为168h。若去掉二步发酵中的伴生菌巨大芽孢杆菌,将两步发酵合成为一步发酵,混合培养G.oxydans与K.vulgare,可以显著降低能耗,缩短发酵周期,降低成本,减少污染,具有非常重要的研究价值。
K.vulgare的单独生长能力很低,Zhou等[17]发现硫酸盐代谢途径缺陷是制约K.vulgare生长的一个原因,其损害了如L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、辅酶A、GSH的合成。Ma等[18]单独在K.vulgare中加入GSH发现K.vulgare的生长提高了4~6倍。Huang[19]等在含K.vulgare及巨大芽孢杆菌的7L的发酵罐中加入GSH,2-KGA提高了20.9%。可见,GSH对K.vulgare有明显的生长促进作用,其在K.vulgare和G. oxydans混菌中的作用尚无人研究。为了探究GSH添加对G. oxydans与K.vulgare的混菌发酵作用,本研究尝试在混菌体系添加GSH,并利用代谢组分析方法研究了GSH在混菌中的作用机制,为进一步改造菌株提供了丰富的信息基础。
1 材料与方法 1.1 菌株产酸菌为产酮古龙酸杆菌(K.vulgare HB602),一步菌为氧化葡萄糖酸酐菌(G.oxydans)。由河北科技大学生物与工程院仪宏教授惠赠。
1.2 试剂与培养基GSH购自Solon Industrial Pkwy Company;D-山梨醇来自华北制药华盈有限公司。
种子培养基:每100ml含2g D-山梨醇,0.3g酵母膏,0.3g牛肉膏,0.6g玉米浆粉,1g蛋白胨,0.1g尿素,0.1g碳酸钙,0.1g磷酸二氢钾。0.02g硫酸镁。
发酵培养基:每100ml含8g D-山梨醇,1g玉米浆粉,1g尿素,0.1g碳酸钙,0.1g磷酸二氢钾,0.05g硫酸镁。
发酵罐(5L)培养基:基础料2L中含40g D-山梨醇,30g玉米浆粉,0.6g磷酸二氢钾,3g硫酸镁,3ml消泡剂;补料700ml中含200g D-山梨醇,15g酵母膏,3gGSH,2ml消泡剂。
1.3 细胞培养与生长条件分别接种K.vulgare和G.oxydans时,吸取1ml无菌水于培养48h的平板上,用接种环将菌刮下溶于水中,吸取菌液注入50ml(种子培养基)/250ml摇瓶中,培养48h,作为二级种子。按10%接种量将一定种子液接入摇瓶发酵液中,30℃,250r/min摇床振荡培养,发酵72h左右。可在发酵过程中,取样进行各种参数的检测,如OD,胞外2-KGA及残余L-山梨糖浓度测定,胞内代谢物提取及分析。
发酵罐中,按接种量为10%确定所接入的菌的总量为300ml,然后按OD(K.vulgare)∶OD(G.oxydans)为4∶1的比例将二代种子接入到5L的发酵罐中,大约发酵35h左右。可在发酵过程中,取样进行各种参数的检测,如OD,胞外2-KGA及残余L-山梨糖浓度测定,胞内代谢物提取及分析。
1.4 发酵条件与菌种比例发酵罐总体积为5L,装液量3L,接种量采用10%,接入的K.vulgare和G.oxydans总体积为300 ml,控制pH为7.0,通气量0.5vvm,转速设定600r/min。当培养体系中有山梨醇存在时,G.oxydans优先转化山梨醇为山梨糖,对山梨糖的消耗较少。故采用流加山梨醇培养基的方式进行两菌的一步发酵。补料于发酵开始后6h连续恒速流加,流加时间为9h。为了更高效的产酸,两菌比例关系尝试如表 1所示。
1.5 2-KGA、L-山梨糖和D-山梨醇的测定
采用高效液相色谱法(HPLC),利用标品做标准曲线,根据标准曲线以及HPLC测定的2-KGA、L-山梨糖和D-山梨醇峰面积,计算出二者实际浓度。
1.6 代谢物检测代谢物的前处理、衍生化及检测方法参照本实验室前期的研究[20-21],取测定2-KGA含量用的小菌胞外液10μl于1.5ml离心管中,加入内标(0.1mg/ml)20μl(乙二酸),冷冻干燥。,加入20mg/ml的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液50μl于40℃水浴中反应90min(肟化)。反应结束后再加入80μl MSTFA于40℃水浴再反应30min。然后将溶液转移到样品瓶里,进行GC-TOF-MS测定。代谢物的定性和定量是借助Masslynx(version 4.1)软件完成的[22]。
1.7 菌种数目的测定采用16S rDNA荧光定量PCR法定菌数。使用TIANGEN的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型),进行DNA提取。
引物设计为K.vulgare:F:5′-AATGCCAGTCGTCAGGTTGCTT-3′; R:5′-CTAGGCCGGTC-CTGTAATGTCA-3′。G.oxydans:F:5′-TGTGC-TGGATGTTGGGAAA-3′; R:5′-AGGTCCGAAGAAAGGTCCA-3′。
荧光定量PCR反应体系为20μl。包括2μl的DNA模板,0.25μl的上引物(20μmol/L),0.25μl的下引物(20μmol/L),8.5μl的ddH2O,9μl的RealMaster Mix缓冲液。
荧光定量PCR程序设定为:热启动:95℃ 2min;变性:94℃ 20s;退火:(tm+2℃) 30s(K. vulgare设定64℃,G.oxydans设定53℃);延伸:68℃ 30s;循环:40个cycle;95℃ 5s;60℃ 1min(溶解曲线);40℃ 30s。
2 结果与讨论 2.1 菌种接种比例优化K.vulgare和G.oxydans两菌分别在摇瓶发酵培养基条件下培养,底物消耗、中间体生成随时间的变化如图 1所示。图 1a表明在以山梨醇为底物的条件下,混菌和G.oxydans单菌消耗底物速率比K.vulgare单菌更快且效率更高,但G.oxydans在快速生成L-山梨糖的后期又以其为底物不断消耗,且仅生成少量的古龙酸,如图 1b、图 1c所示。混菌条件下能在保证消耗山梨醇生成山梨糖的同时不断以山梨糖做底物高效生成VC前体2-KGA。为找到产酸量最高的K.vulgare和G.oxydans的比例关系,在5L发酵罐中调整K.vulgare和G.oxydans的接种量,首先以OD600(K.vulgare)∶OD600(G.oxydans)为1∶2和2∶1为例,发现酮古龙酸杆菌的比例高时,醇酸转化率高,如图 2所示,这与其在单菌状态下长势弱相符。
当K.vulgare与G.oxydans的OD600值之比为4∶1时,即K.vulgare体积为275 ml,G.oxydans体积为25 ml时,醇酸转化率最高。增加K.vulgare与G.oxydans比例至6∶1时,一方面由于伴生菌G.oxydans相对比例减少,不能提供足够的营养物质供产酸菌生长;另一方面,G.oxydans比例的减少导致D-sorbitol不能被及时转化,进而影响醇酸转化率,使其显著下降。故选择K.vulgare与G.oxydans的比值为4∶1作为后续发酵罐培养的最优比例。实验中发现,G.oxydans具有突出的生长优势,可以很快地增殖,后期会大量利用山梨糖,最终导致2-KGA的产量降低。如何能够在保证底物转化的前提下,适当抑制G.oxydans的生长,设法提高K.vulgare的生长,是提高两菌一步发酵的关键。
2.2 GSH添加条件下单菌的生长状态由Ma等[18]研究所知,K.vulgare在GSH添加浓度为1mg/ml的条件下生长最快,其生长量可达到对照组的4~6倍;对G.oxydans采用相同的方法进行研究,将已经称好的GSH按浓度从低到高的顺序在0h依次加入到4个批次的种子培养基,在GSH浓度为0,0.1,0.5,0.8,1,2,5mg/ml的7种不同条件下,250ml锥形瓶中G.oxydans的OD600值随时间的变化如图 3所示。
G.oxydans的OD600值随GSH浓度的提高呈现增长缓慢的趋势,说明GSH可减缓G.oxydans的生长,为在混菌体系中减缓其对L-山梨糖的过多消耗提供依据。而在Ma等[18]研究中可知K.vulgare在GSH为1mg/ml条件下,其生长可以得到最大的促进,为了保证在可以减缓G.oxydans对L-山梨糖的过多消耗的基础上最大地发挥K.vulgare的生长产酸优势,以添加1mg/ml的GSH为最佳添加浓度。
2.3 GSH添加条件下混菌生长在G.oxydans-K.vulgare混菌一步发酵体系中添加1mg/ml的GSH,以山梨醇为碳源进行混菌发酵。底物转化过程中,山梨糖、山梨醇和2-KGA的浓度随时间的变化如图 4所示。由图 4可知,添加GSH后,发酵前30h 2-KGA的生产速度较未添加GSH的情况区别不大,但是最终的产量为56.7g/L,醇酸转化率达到了66.9%,相比对照组(产量46.2 g/L,醇酸转化率54.5%),GSH的添加使其醇酸转化率提高了22.8%,但转化周期由30h延长到36h;山梨醇的消耗曲线,二者区别不大,但添加GSH后,混菌体系中的山梨糖消耗速度变缓,结合醇酸转化率的提高可得知更多的山梨糖得以用于2-KGA的转化,这种结果可能是由于G.oxydans对山梨糖的竞争消耗减少。从图 5混菌中G.oxydans的数量可以看出,添加GSH的混菌体系中,稳定期(约12~24h)G.oxydans的生物量平均为3.3×1011 CFU/ml,对照组为5.1×1011 CFU/ml,在GSH条件下,G.oxydans生物量下降到对照组的61%。由此可推论,添加GSH后,G.oxydans的生长变缓,由于GSH强大的氧化能力,对山梨醇向山梨糖的转化影响不大,但是G.oxydans利用山梨糖进行生长的程度减弱,进而可以有更多的山梨糖供K.vulgare进行2-KGA的生产。添加GSH的混菌体系中,利用RT-RCR测得的稳定期(约12~24h)K.vulgare生物量平均为3.1×1010 CFU/ml,比对照组的2.1×1011 CFU/ml,提高到148%,并没有表现出Ma等[18]研究中4~6倍的提高,这与图 4中表现出的2-KGA相似的生成速度相一致。造成这种现象的原因可能是由于混菌体系中,G.oxydans具有比K.vulgare更强大的物质转运能力,G.oxydans比K.vulgare具有更强的生长优势,GSH能被G.oxydans更多地利用,同时对G.oxydans的影响更大。
2.4 GSH对两菌营养环境变化分析对两菌一步发酵体系添加GSH前后的胞外营养环境进行GC-TOF-MS测定,并进行定量分析。根据各物质随发酵时间的变化及其在体系添加GSH前后的差异进行了聚类分析,基本可以分为三大类,如图 6所示。
第一类为不断消耗的代谢物,如L-丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甘油、γ-氨基丁酸等代谢物,它们的特点是随着发酵的进行,物质浓度在不断地减少,这些物质作为K.vuglare和G.oxydans的营养物质,逐渐被分解或者被细胞直接利用,为两菌的生长提供物质基础。比较添加GSH前后这些物质的变化,其区别在于被细胞利用速度的差异,例如L-丙氨酸,乳酸,L-亮氨酸,脯氨酸,磷酸,L-缬氨酸消耗的速率在GSH添加条件下要更高(图 7a,7b);而γ-氨基丁酸,丝氨酸,甲苯基乙胺,L-天冬氨酸,甘油,5-氧-脯氨酸,L-苏氨酸,1, 4-丁二胺,木糖醇,赤藓糖醇,甘氨酸的消耗速率在不添加GSH的情况下更高(图 7c,7d);山梨醇和苯丙氨酸的量与是否添加GSH变化甚微,如图 7e所示。GSH的添加导致的氨基酸等代谢物消耗速率变低的种类和浓度要远高于未添加的对照组,推测可能添加的GSH对混菌体系中G.oxydans的影响要高于K.vuglare。
第二类为先积累随后又被消耗的物质,主要包括丙酮酸,2-酮基异己酸,阿洛糖,木酮糖,半乳糖,3-甲基-2-酮基戊酸,3-甲基-2-酮基丁酸,三乙胺,肌醇,果糖,山梨糖。代谢物的生成大约在发酵6~12 h之间,此阶段正为两菌快速生长时期,这些物质随着细胞的生长代谢产生,在发酵后期又被细胞吸收利用。添加GSH后,胞外的肌醇、三乙胺、山梨糖、果糖的积累要少于对照组,如图 7f所示。Zhou等[17]的研究表明,K.vulgare可以消耗B.megaterium为其提供的肌醇,说明K.vulgare的生长需要补充额外的肌醇。本研究添加GSH后,肌醇在胞外的积累减少,而在未添加GSH时,胞外有大量肌醇存在,说明添加GSH后,肌醇主要被K.vulgare利用。肌醇可以用来合成磷脂酰肌醇,磷脂酰肌醇在细胞抵抗环境不利因素方面有重要的作用,此外,磷脂含量的变化也会进一步影响细胞膜的流动性等一系列细胞活动,此类物质胞外积累的减少正说明GSH的添加对混菌中的K.vulgare的生长起到了促进作用。
第三类物质在发酵前期几乎检测不到,大约在12 h以后才出现,随后含量逐渐增多,它们主要包括各种氧化产物,如2-KGA、2-酮-葡萄糖酸、葡萄糖酸、甘油酸等。葡萄糖酸、甘油酸作为氧化产物,是G.oxydans与K.vulgare氧化能力的体现,从图 7g、h看出,在添加GSH后,这些物质在胞外积累减少,说明此混菌体系的氧化能力减弱。而由实验得知,GSH的添加能够使得混菌中K.vulgare的生长增强,而G.oxydans的生长减弱,推测可能是大部分GSH被混菌体系中的G.oxydans更快速利用,而少部分的GSH被K.vulgare吸收以促进其生长。
2.5 GSH对混菌的作用机制分析江南大学的Huang等[19]认为,在K.vulgare的生长中,硫酸盐代谢的缺陷是其生长缓慢的原因之一。他们利用Kv iWZ663,通过进行的单反应的缺失以及代谢平衡分析法发现,K.vulgare需要吸收含硫物质保证其生长,通过基因序列的分析,发现其菌体中存在着L-半胱氨酸、GSH、泛酸盐、硫酸盐和亚硫酸盐的转运蛋白,K.vulgare可以利用这些化学物质获得充足的硫或者辅酶A。添加GSH后,丝氨酸,半胱氨酸,甘氨酸等氨基酸在胞外的积累增多,说明它们在GSH的代谢中发挥着重要的作用。同时间接说明GSH在添加入发酵罐后,完善了K.vulgare对硫酸盐的代谢,发挥了促进K.vulgare的作用。脯氨酸、5-酮脯氨酸在单独培养的K.vulgare和混菌培养体系其相对含量都有不同程度的降低,可能是这些氨基酸成分被利用于胞内蛋白的合成。5-酮脯氨酸还可以通过谷氨酸转化成GSH,GSH的巯基可以结合脱氢酶。添加GSH的发酵罐5-酮脯氨酸要比空白罐代谢缓慢,可能是由于添加的GSH减缓了对5-酮脯氨酸的需求,侧面证明了GSH在发酵中起到了重要作用。
添加GSH的发酵罐中酮戊二酸、琥珀酸、丙酮酸等代谢物的含量较对照组降低,即胞外液中的代谢物较少。可能是由于各代谢物进入细菌中参与三羧酸循环代谢。而在发酵的过程中,添加GSH能够促进K.vulgare的生长,但同时又能够减缓G.oxydans代谢,所以可以推测在发酵后期K.vulgare具有很大的生长优势,三羧酸循环的代谢增强。有研究表明,发酵中后期,G.oxydans可以利用山梨糖,将其转化为果糖,赤藓糖进入PPP途径[23]。添加GSH的发酵罐中赤藓糖、果糖较空白对照组含量增加,原因可能是代谢物进入细菌中参与磷酸戊糖代谢缓慢,所以推测添加GSH的发酵罐中G.oxydans减缓了对山梨糖的代谢。
由研究所得结果推测,1mg/L的GSH加入K.vulgare和G.oxydans的混菌体系,可能大部分的GSH被G.oxydans吸收利用,而小部分的GSH被K.vulgare吸收。初步推测GSH在混菌中的作用机制如图 8所示,被K.vulgare吸收的GSH参与了其在K.vulgare中的分解代谢,从而使得胞外丝氨酸,半胱氨酸,甘氨酸等氨基酸的含量增多,同时GSH的加入使得胞外肌醇、硫酸盐等能促进K.vulgare生长的代谢物含量增多,而参与三羧酸循环的酮戊二酸、琥珀酸、丙酮酸等代谢物含量减少,同时5-酮脯氨酸的含量不断降低,可能用于胞内蛋白的合成,最终使得K.vulgare生长增强的同时,2-KGA的产率也增大。而大部分GSH被G.oxydans吸收导致胞外赤藓糖、果糖等代谢物的含量增多,同时可能磷酸戊糖途径产生的还原力不断地用于消耗GSH和GSSG的变化,使得磷酸戊糖途径的减弱,进而减少了山梨糖向果糖等杂糖的转化,减缓了G.oxydans生长的同时提高了K.vulgare对山梨糖的利用率。添加GSH所产生的多种作用效果最终导致了一步发酵混菌体系2-KGA的产量增多,醇酸转化率增大。
3 展望虽然我们在研究维生素C一步发酵中的氧化葡萄糖酸杆菌与酮古龙酸杆菌混合发酵方面,找到了GSH在代谢水平对氧化葡萄糖酸杆菌和酮古龙酸杆菌的作用影响,但还需要进一步通过基因组学和蛋白质组学等方法更加系统地了解GSH的作用,深入研究其对两菌关系的作用机制。同时,还可根据本研究获得的GSH对两菌关系的影响靶点,对菌株进行工程改造,进而提高一步发酵体系的发酵水平。
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