2016, Vol. 36文章信息
- 史利平, 季静, 王罡, 金超, 谢超, 杜希龙, 关春峰, 张烈, 李辰.
- SHI Li-ping, JI Jing, WANG Gang, JIN Chao, XIE Chao, DU Xi-long, GUAN Chung-feng, ZHANG Lie, LI Chen.
- 盐胁迫条件下玉米萜类合成相关基因的表达分析
- The Expression and Analysis of Terpene Synthesis Related Genes in Maize under the Condition of Salt Stress
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(8): 31-37
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(8): 31-37
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160805
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-25
- 修回日期: 2016-03-22
2. 天津大学化工学院 天津 300072；
3. 天津科润津丰种业有限责任公司 天津 300384
2. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China;
3. Company of Tianjin Kerun Jinfeng Seed Industry, Tianjin 300384, China
土壤盐渍化是严重的生态问题之一，目前全球约20%的灌溉土地受到盐渍化危害[1]，预计2050年50%的耕地将被盐渍化吞噬[2]。为解决土壤盐渍化问题，人们尝试了多种物理化学方法，如淡水压碱、挖沟排碱及添加CaCO3等，但耗资巨大、收效甚微，甚至加重了土壤的次生盐渍化。因此提高植物自身耐盐性是改良和利用盐渍化土壤的有效途径。
萜类化合物是植物体内重要的次生代谢产物，在植物生长发育和抵御非生物胁迫方面起重要作用。萜类化合物在植物体内有两条生物合成途径：分别是位于细胞质中的甲羟戊酸(mevalonate pathway, MVA)途径和位于细胞器质体中的2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP)途径。所有萜类合成的最初底物均是异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP, C5)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP, C5)。IPP和DMAPP在不同异戊二烯基转移酶的作用下分别合成萜类的直接前体物质牻牛儿基焦磷酸(geranyl diphosphate, GPP, C10)，法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP, C15)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGPP, C20)。GPP、FPP、GGPP在萜烯合酶(terpene synthase, TPS)作用下，分别生成单萜、倍半萜和二萜及多萜[3-4]。
GGPS是一个多基因家族，催化合成GGPP。GGPP是多种初生和次生代谢物的共同前体，是多种异戊烯衍生物的合成前体，例如二萜、色素(类胡萝卜素和叶绿素等)、植物激素和泛素。因此GGPS可以调节碳流，从而成为初生代谢和次生代谢的关键酶之一[5]。在拟南芥中发现5个亚型的GGPS基因，GGPS1/GGPS2/GGPS3/GGPS4和GGPS6，由于这些GGPS N端序列的差异，使这些亚型分别定位于不同的细胞内。TPS基因家族是一个很大的家族，TPS具有高度保守的氨基酸序列，C端具有天冬氨酸富集的DDXXD域，该结构域形成一个α螺旋的三级结构，可绑定金属离子使酶的底物离子化。N端具有高度保守的RR(X8)W结构域，促进TPS适当折叠[6]。虽然高度保守，但不同酶的这些结构域的氨基酸序列也存在某些差异[7]。
在植物体内，生物胁迫可诱导产生某些萜类化合物，这些化合物可作为植物抗毒素直接抵御胁迫[8]，也可以通过三级营养互作关系吸引天敌间接地抵御胁迫[9-10]。此外，UV-B射线、γ射线或者高温等非生物胁迫导致活性氧ROS产生时，萜类化合物也被诱导产生[11-12]。高温环境下冬青栎(Quercus ilex)利用单萜清除细胞内的自由基团、活性氧等，并释放大量挥发性单萜来降低树体体温[13]。萜类化合物在抵御盐胁迫方面的研究较少。
天津天塔五号是近年来经过杂交育种获得的新品系，为研究玉米中萜类合成途径对盐胁迫的应答及杂交种在耐盐方面具有优势的分子机理，笔者对三叶期的天塔五号及其父母本进行盐胁迫，并对萜类合成途径关键基因表达情况及相关生理性状进行研究，以期为植物分子抗逆育种提供优质的基因资源，为改良盐渍化土壤提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料本实验所用材料为玉米天塔五号及其双亲本，由天津市科润津丰种业有限责任公司提供，天津大学科技示范园内种植。
1.2 方法 1.2.1 基因表达分析方法天塔五号及其父母本长至三叶期时，用200 ml浓度为200 mmol/L NaCl溶液胁迫处理2 h、8 h、24 h和48 h。取样，Trizol法提取RNA，TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转录，以actin基因作内参，TransGenTranStartTM Top Green qPCR Supermix试剂盒进行qRT-PCR测定。三组实验材料各取3株作为样品，每个样品重复测定3次。引物如表 1所示。基因的相对表达量计算方法参照参考文献[14]。
| 引物名称 | 引物序列 |
| actinFor | 5′-CTGAGGTTCTATTCCAGCCATCC-3′ |
| actinRev | 5′-CCACCACTGAGGACAACATTACC-3′ |
| TPS2For | 5′-CGAGTAGTAGACGATGTA-3′ |
| TPS2Rev | 5′-GAAGGAGGAAGAAGAGAT-3′ |
| TPS3For | 5′-TGAGACCAGTAATGTAGAGTAG-3′ |
| TPS3Rev | 5′-AGATAATAACGCCGATACCA-3′ |
| GGPS4For | 5′-TCAGCAAACCACATCCGAAAC-3′ |
| GGPS4Rev | 5′-CAGGTCAAAGGAAGCAGAGGC-3′ |
1.2.2 玉米叶片光合作用指标测定
本研究所用仪器为美国产LI-6400便携式光合测定仪，分别测定对照组和盐胁迫8 h、16 h、24 h、48 h时三叶期幼苗顶部叶片的净光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度，每个样本重复测量3次。
1.2.3 株高和生物量测定天塔五号及其父母本幼苗长至三叶期时，每天用200 ml 200 mmol/L NaCl溶液浇灌处理，同时以200 ml清水浇灌作为对照。盐处理7 d后，测量株高，每组实验10个重复。取出完整植株，洗净、吸干表面水分，称鲜重。将植株放入烘箱，110 ℃杀青10 min，60 ℃烘干至恒重，称干重。按公式：变化率(％)=[(对照-处理)/对照]×100％，计算株高和鲜重、干重的变化率。
1.2.4 相关生理指标测定天塔五号及其父母本幼苗长至三叶期时，每天用200 ml 200 mmol/L NaCl溶液浇灌处理，胁迫7 d后，(1)测定叶绿素含量，方法参照参考文献[15]。(2)测定游离脯氨酸含量，方法参照参考文献[16]。(3)玉米叶片类胡萝卜素提取及高效液相色谱检测(High performance liquid chromatography, HPLC)，方法参照参考文献[17]。
以上所测数据处理均用SPSS软件进行数据方差分析和多重比较。
2 结果与分析 2.1 盐胁迫条件下萜类合成相关基因表达情况TPS2，TPS3，GGPS4在萜类合成途径中的位置如图 1所示。
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| 图 1 萜类合成途径 Figure 1 Terpene synthetic pathway |
天塔五号及其父母本长至三叶期时，盐处理后，检测不同时间段TPS2、TPS3和GGPS4基因表达情况。统计分析表明，盐胁迫前，三组材料之间TPS2、TPS3和GGPS4基因表达量无显著差异；胁迫后，基因表达量均呈现出先升后降的趋势；不同株系不同基因表达量达到最大的时间不同。天塔五号在盐处理8 h时，TPS2和TPS3表达量达最大，分别是对照的3.2倍和4.3倍，表达量均显著高于父母本。盐处理24 h时，父本和母本的TPS2表达量最高，分别是对照的1.4倍和1.6倍，天塔五号TPS2表达量仍高于亲本。盐处理48 h时，三组材料表达量差异不显著(图 2a、2b)。三组材料中TPS2和TPS3基因差异表达情况说明天塔五号中单萜合成途径对盐胁迫的响应速度较快，程度更强烈。三组材料中GGPS4均在盐处理24 h时表达量达最大，天塔五号和父母本表达量分别是对照的5.2倍、2.1倍和2.5倍。盐处理48 h内天塔五号的GGPS4表达量均显著高于父母本(图 2c)。说明三组材料中二萜合成途径对盐胁迫的响应速度无明显差别，但天塔五号响应更强烈。
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| 图 2 盐胁迫下TPS2、TPS3和GGPS4基因的相对表达量 Figure 2 Relative expression of TPS2/TPS3/GGPS4 genes under salt stress (a)Relative expression of TPS2 (b)Relative expression of TPS3 (c)Relative expression of GGPS4 |
对F1自交所得F2代三叶期幼苗进行耐盐性分析，以盐处理的F1幼苗作为对照，盐处理7 d后测定生物量结果表明，F2代中较F1耐盐的比例为25.5%，耐盐性无显著差异的为43%，耐盐性差的为31.5%(图 3)。
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| 图 3 F2代耐盐性统计 Figure 3 Statistics of salt tolerance of F2 |
分别挑取F2较F1耐盐、耐盐性无差异和耐盐性差的植株，分析盐处理下TPS2、TPS3、GGPS4基因表达情况(图 4)，结果表明F2耐盐植株三基因表达量均显著高于F1，耐盐性无差异植株三基因表达量与F1差异不显著，耐盐性差的植株三基因表达量均低于F1，F2代中三基因表达量与耐盐性呈正相关。
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| 图 4 盐胁迫下F2代TPS2、TPS3和GGPS4基因的相对表达量 Figure 4 Relative expression of TPS2/TPS3/GGPS4 genes of F2 generation under salt stress (a)Relative expression of TPS2 (b)Relative expression of TPS3 (c)Relative expression of GGPS4 |
光合速率是表征植株生理状况和抗逆能力的重要指标之一。盐胁迫后，三组材料叶片光合速率和气孔导度均下降，但天塔五号光合速率和气孔导度均显著高于亲本。盐胁迫8 h时，三组材料光合速率和气孔导度均迅速下降，24 h后下降速度减缓，48 h后天塔五号植株的光合速率和气孔导度基本趋于不变(图 5a、5b)。盐胁迫后，三组材料叶片胞间CO2浓度均表现出先降后升的趋势。16 h时达最低，48 h时叶片胞间CO2浓度基本恢复，天塔五号甚至高于胁迫之前(图 5c)。这可能是因为在盐胁迫初期，为减少水分流失，玉米叶片气孔收缩，气孔导度降低，CO2向叶绿体的运输受到限制，光合作用降低，主要是气孔导度限制光合速率；随胁迫时间延长，胞间CO2浓度逐渐升高，非气孔因素成为主要限制因素。
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| 图 5 盐胁迫下玉米叶片光合作用指标的变化 Figure 5 Changes of the photosynthetic indicators of maize leaves under salt stress (a)Photosynthetic rate of maize leaves (b)Stomatal conductance of maize leaves (c)Intercellular CO2 concentration of maize leaves |
盐胁迫是限制植物生长的重要环境胁迫因子之一。研究结果表明，盐胁迫后，不同株系的苗情表现不同。父本和母本植株生长受到抑制，部分叶片枯黄；天塔五号受胁迫伤害程度最轻(图 6)。盐胁迫条件下，三组材料株高和生物量均有所下降，天塔五号下降幅度明显低于亲本，亲本间无显著差异(表 2)。
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| 图 6 盐胁迫下玉米幼苗生长状况 Figure 6 Growth situation of maize plants under salt stress From left to right:the plants of F1 control, the plants of F1 under salt stress, the plants of male parent control, the plants of male parent under salt stress, the plants of female parent control, the plants of female parent under salt stress |
| 株系 | 株高变化率% | 鲜重变化率% | 干重变化率% |
| 天塔五号 | 7.71±0.32a | 11.17±0.98a | 4.23±0.33a |
| 父本 | 38.27±0.86b | 40.23±2.21b | 21.83±0.72b |
| 母本 | 34.32±1.47b | 37.19±1.18b | 17.16±0.42b |
| P < 0.05 | |||
2.4 盐胁迫条件下玉米相关生理指标 2.4.1 叶绿素含量
正常生长状况下，三组材料的叶绿素总量差异不显著；盐胁迫后，三组材料的叶绿素总量均有所下降，天塔五号及父本母本下降幅度分别为23.83%、49.71%和47.49%。天塔五号降幅最小，盐胁迫后叶绿素总量显著高于亲本，亲本间无显著差异(表 3)。
| 株系 | 对照组叶绿素总量 (mg/g) |
实验组叶绿素总量 (mg/g) |
| 天塔五号 | 1.93±0.10a | 1.47±0.12b |
| 父本 | 1.75±0.01a | 0.88±0.24c |
| 母本 | 1.79±0.17a | 0.94±0.09c |
| P < 0.05 | ||
Chl a/Chl b比值代表叶绿体内类囊体的堆叠程度，Chl a/Chl b比值越小，说明类囊体堆叠程度越小，光抑制越强，光合作用越弱[18]。盐胁迫后，天塔五号及父母本的Chl a/Chl b比值均有所降低，下降幅度分别为4.1%、9.1%和7.6%，天塔五号下降幅度明显低于亲本(图 5)。
|
| 图 7 盐胁迫下玉米Chl a/Chl b比值变化 Figure 7 Changes of Chl a/Chl b of maize plants under salt stress |
正常条件下，三组材料游离脯氨酸含量无显著差异；盐胁迫后，三组材料脯氨酸含量均显著增多(表 4)。其中天塔五号和父母本分别增加到原来的3.7倍，2.82倍和2.94倍。盐胁迫后脯氨酸含量显著高于亲本，亲本间无显著差异。
| 株系 | 对照组脯氨酸总量 (μg/g FW) |
实验组脯氨酸总量 (μg/g FW) |
| 天塔五号 | 10.83±1.05a | 51.98±1.40c |
| 父本 | 8.93±0.45a | 34.12±0.89b |
| 母本 | 9.65±0.66a | 38.07±0.79b |
| P < 0.05 | ||
2.4.3 类胡萝卜素检测结果
类胡萝卜素是植物体内重要的萜类化合物，含有共轭双键，具有抗氧化性。同时玉米黄质和叶黄素循环也能促发NPQ，将光合作用中产生的过多能量以热能的形式耗散出去，以减少ROS等氧化性自由基的产生[19]。本研究利用HPLC分析盐胁迫24 h下天塔五号及父母本类胡萝卜素变化情况(表 5)。盐胁迫前三组材料间类胡萝卜素总量、β-胡萝卜素、叶黄素差异不显著。盐胁迫后天塔五号类胡萝卜素总量较对照无显著差异，父母本则显著下调，下调量分别是天塔五号下调量的6.93倍和6.43倍。盐处理后三组材料的β-胡萝卜素和叶黄素含量均发生下调，父本的下调量分别是天塔五号下调量的3.67倍和1.36倍；母本的下调量分别是天塔五号下调量的4.52倍和1.33倍。实验组中，三组材料的玉米黄质和叶黄素循环池也发生相应变化，天塔五号的玉米黄质含量较父母本分别提高7.37μg/g和3.06μg/g。
| 萜类化合物及含量(μg/g) | 天塔五号 | 父本 | 母本 |
| 对照组 | |||
| 总类胡萝卜素 | 133.17±4.02a | 128.92±2.12a | 133.17±3.63a |
| 玉米黄质 | 9.97±0.51a | 8.04±0.17b | 9.56±0.44a |
| β-胡萝卜素 | 50.78±1.62a | 40.33±0.75b | 47.67±0.21a |
| 叶黄素(Lutein) | 41.72±0.82a | 38.78±0.33a | 39.37±1.03a |
| 实验组 | |||
| 总类胡萝卜素 | 128.36±3.23a | 95.55±2.44b | 102.23±3.01b |
| 玉米黄质 | 13.95±0.72a | 6.58±0.25c | 10.89±0.44b |
| β-胡萝卜素 | 48.57±1.34a | 32.22±0.85c | 37.67±0.95b |
| 叶黄素 | 36.83±0.27a | 32.11±0.63b | 32.86±0.57b |
| P < 0.05 | |||
3 讨论
植物萜类化合物可被非生物胁迫诱导产生。Lee等[20]发现氧化胁迫条件下水稻的柠檬烯、月桂烯等萜类化合物含量增加，并证实OsTPS20基因的转录水平显著提高。本研究通过qRT-PCR检测发现，玉米萜类合成途径中的关键基因——单萜合酶基因TPS2和TPS3及二萜合成途径中的GGPS4基因被盐胁迫诱导表达，不同品系不同基因的表达情况存在差异，天塔五号表达水平显著高于亲本, 这可能有助于杂种在逆境中保持产量稳定。此外检测了F1自交所得F2代耐盐性和萜类合成基因表达情况，结果表明F2代中TPS2、TPS3和GGPS4基因表达水平与耐盐性仍呈正相关。结合胁迫后三组材料生长势、生物量、叶绿素含量和游离脯氨酸含量的差异变化，均说明萜类合成途径在植物抵御高盐等非生物胁迫方面发挥作用，并在表型上有所体现。玉米耐盐性是位于染色体上多个基因控制的数量性状，Rao等[21]研究发现，玉米的耐盐性存在加性和显性效应，具有非常复杂的机制。盐胁迫产生的信号可能作用于某些共同的调控因子，再由调控因子来控制受盐胁迫诱导的基因的表达。通过植物基因工程及分子生物学技术从耐盐植物中分离出耐盐基因导入到玉米中将是培育耐盐玉米新品种的发展趋势。
干旱和盐碱化可直接影响气孔导度，还作为渗透胁迫破坏植物体内平衡和胞内离子分布，使植物表现出光合作用降低及其他可见的胁迫症状。本研究中玉米三组材料在盐胁迫条件下的光合作用指标，并未简单地随萜类合成相关基因的表达而变化，可能是在胁迫初期，未引起植物自身抗逆机制足够的响应，但随时间延长，抗逆机制充分响应后，胁迫对光合作用的损害受到一定遏制。
本研究检测了玉米三组材料盐胁迫前后类胡萝卜素总量及其主要成分的含量，结果表明盐胁迫条件下天塔五号通过合成更多的类胡萝卜素帮助植物保护光合作用、抵御非生物胁迫。这与前人研究结果一致，Owen[22]等证实胁迫条件下植物选择性地合成类胡萝卜素等萜类，可清除胁迫产生的活性氧。Zhao等[23]在烟草中过表达β-类胡萝卜素羟化酶基因chyB增强了转基因植株的抗旱能力。
Sharkey等[24]提出并证实，异戊二烯可通过保护光合作用来抵御短暂的高温胁迫对植物的伤害，而异戊二烯或单萜的抗氧化作用机制尚未清楚，可能由于氧化胁迫下，异戊二烯嵌入到细胞器膜中，通过阻止膜脂质变性来增加膜和光合作用过程的稳定性[25]。基于本文研究结果笔者推测，盐胁迫可引发萜类合成途径产生响应，并选择性地合成某些萜类化合物如某些单萜和类胡萝卜素等，保证更多有效的光合作用和光合电子转移速率，减少胁迫引起的活性氧积累，帮助植物抵御胁迫。迄今为止，几百个萜类合酶已被发现，并且其结构和性能逐渐被人们所了解，但阐明其产物的生理和生态功能仍然具有很大的挑战[3]。
本研究发现，盐胁迫条件下玉米萜类合成途径的关键基因TPS2、TPS3和GGPS4被诱导表达，且品种间基因表达量存在差异，天塔五号该途径对胁迫的响应更加迅速和强烈，可能对其发挥耐盐能力具有重要作用。植物萜类合成途径的研究对提高植物耐盐性、解决土壤盐渍化等生态问题具有重要意义。
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