文章信息
- 曹荣月, 俞敏霞, 张昕黎, 李曼曼, 苗梓韬, 金亮.
- CAO Rong-yue, YU Min-xia, ZHANG Xin-li, LI Man-man, MIAO Zi-tao, JIN Liang.
- VEGFⅡ/GRP融合蛋白的构建、表达、纯化及其抗小鼠RM-1前列腺癌的作用研究
- Construction, Expression, Purification of VEGFⅡ/GRP Fusion Protein and the Effects on RM-1 Prostate Tumor in Mice
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(8): 9-15
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(8): 9-15
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160802
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-01
前列腺癌是男性生殖系统中常见的恶性肿瘤,随着生活条件的改善,男性前列腺癌的发病趋势逐年升高,前列腺癌的治疗研究已引起了广泛的重视[1-2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一个二聚体糖蛋白,家族成员有VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E,VEGF-F和PlGF[3]。它可与血管内皮细胞相应受体结合,刺激血管内皮细胞的增殖、迁移,诱导新生血管形成,提高血管通透性,使肿瘤持续生长[4-5]。大多数肿瘤细胞均高水平表达VEGF,而正常组织中仅肾、卵巢等少数脏器有较高水平的表达,因此VEGF是抗肿瘤血管治疗理想的靶部位。
胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)是哺乳动物蛙皮素同系物,GRP是由前体分子proGRP1-125衍生的酰胺化的氨基酸肽。它是正常生理过程中的调节肽也是某些癌症的生长因子,GRP和GRP-R可以在前列腺癌中表达并且可刺激前列腺癌细胞系的生长[6]。GRP是一个关键的神经内分泌肽,它可能参与了晚期前列腺癌的神经内分泌分化[7]。
随着分子免疫学及肿瘤免疫学的迅猛发展,肿瘤治疗性疫苗因其特异性高、针对性强且毒副作用小等特点,已经成为恶性肿瘤主动免疫治疗发展的重要方向。2012年美国FDA批准PROVENGE用于治疗前列腺癌[8],它是以肿瘤内皮细胞中的相关抗原为靶点。而以VEGF/VEGFR2为靶点的抗肿瘤血管生成的主动免疫治疗也取得了突破的研究进展。抗肿瘤血管生成主动免疫治疗攻击的是肿瘤组织中基因相对稳定且容易到达的血管系统,以内皮细胞中过表达的各种抗原为靶位,可以克服长期以来各种单纯攻击肿瘤细胞治疗的局限性[9]。
由于单一靶点的小分子药物免疫原性弱,因此本研究利用分子克隆技术构建了针对VEGF和GRP两个靶点的抗肿瘤融合蛋白疫苗,以期产生抗肿瘤血管生成和特异性抗肿瘤反应。
1 材料 1.1 菌种和质粒菌种Escherichia coli BL21(DE),pET28a-HSP65-GRP6,pET28a-VEGFⅡ质粒均为中国药科大学微基因药物实验室保存。
1.2 试剂引物(上海捷瑞生物工程有限公司合成);限制性内切酶Nco Ⅰ、Nhe Ⅰ、HindⅢ、E.coli DNA连接酶(Ferments公司);质粒抽提试剂盒,PCR胶回收试剂盒、兔抗人GRP单克隆抗体(上海生工生物科技有限公司),羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司);兔抗人VEGF单克隆抗体(万类生物科技有限公司);胎牛血清(杭州四季青工程研究所);RPMI-1640(美国Gibco公司);抗人VEGF抗体ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司);多西他赛注射液(批号:5080081 TA,齐鲁制药有限公司)。
1.3 动物和细胞株RM-1前列腺癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院,清洁级C57BL/6J雄性小鼠(5周龄)购自扬州大学SCXK(苏)2012-0004。
2 方法 2.1 VEGF Ⅰ-M2-DPTGG和GRP6基因的获得根据本实验室已有的关于重组质粒pET28a-HSP65-GRP6和pET28a-VEGFⅡ的序列信息,利用引物设计软件Primer 5和Oligo 7来设计两对引物V1、V2;G1、G2。
V1:5′-CATGCCATGGACATCATCGACGACT-3′
V2:5′-CGGCTAGCGCCACCAGTCGGATCCTTGTTGTGAGCGGCAA-3′
G1:5′-GCGACATGGGTGGCATGGATTTC-3′
G2:5′-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGT-3′
上游引物V1中引入Nco Ⅰ,Nhe Ⅰ酶切位点以及DPTGG连接肽序列。采用PCR技术从pET28a-VEGFⅡ质粒中克隆得到基因VEGF Ⅰ-M2-DPTGG,扩增条件为94℃预变性5min;94℃变性1min,58.3℃退火45s,72℃延伸1min,共35个循环;72℃延伸10min。从pET28a-HSP65-GRP6质粒中克隆得到GRP6基因,扩增条件为94℃预变性5min;94℃变性1min,59.3℃退火45s,72℃延伸1min,共35个循环;72℃延伸10min。
2.2 重组表达载体的构建和鉴定通过切胶回收获得目的片段VEGF121 Ⅰ-M2-DPTGG,将目的片段和pET28a载体质粒分别经Nco Ⅰ、Nhe Ⅰ双酶切,酶切产物纯化后用E.coli DNA连接酶4℃连接,将酶连产物转化感受态细胞后涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上,37℃过夜培养后挑取单菌落,通过PCR、单酶切和双酶切方法初筛阳性克隆,经DNA测序结果确认该重组载体序列完全正确。
通过切胶回收获得目的片段GRP6,将目的片段和pET28a-VEGF Ⅰ-M2-DPTGG载体质粒分别经Nhe Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切,酶切产物通过同样方法连接转化后,获得重组质粒,以引物V1和G2进行PCR验证、测序验证、至此重组质粒pET28a-VEGF Ⅰ-M2-GRP6构建完成。
2.3 融合蛋白的诱导表达将鉴定成功的重组菌接种于LB培养基中,37℃培养4h后加乳糖(终浓度为7mmol/L)诱导8h,每小时取样,离心收集菌体沉淀,进行12%SDS-PAGE分析,观察目的条带位置和表达量。
2.4 融合蛋白的分离纯化大规模培养重组菌,离心,将菌体沉淀用配制好的菌体裂解液(10ml/g菌体)溶解,超声裂解菌体。离心收集上清及沉淀均留样标记。12%SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白主要存在于菌体沉淀中,故可判断融合蛋白为胞内包涵体表达。
2.4.1 包涵体的洗涤和溶解将沉淀先用包涵体洗涤液A(pH8.0 Tris·HCl 20mmol/L,EDTA 5mmol/L,NaCl 10mmol/L,2%Triton X-100)溶解,室温磁力搅拌溶解后离心取沉淀;再分别用包涵体洗涤液B(pH8.0 Tris·HCl 20mmol/L,EDTA 5mmol/L,NaCl 10mmol/L,0.5mol/L尿素)和双蒸水溶解,重复上述洗涤步骤,去除部分杂蛋白和核酸。每g沉淀加入20ml包涵体裂解液(pH8.0 Tris·HCl 20mmol/L,EDTA 5mmol/L,8mol/L尿素)加入DTT至终浓度为10mmol/L,4℃搅拌过夜溶解,离心收集上清。
2.4.2 包涵体的复性将2.4.1收集的上清依次对6,4,2,1,0.5mol/L的尿素溶液(以pH8.0 Tris·HCl 20mmol/L,EDTA 5mmol/L缓冲液溶解)透析,透析液中加入含氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽至终浓度分别为0.1mmol/L和1mmol/L,4℃搅拌透析,每隔6h换液一次,最后用pH8.0 Tris·HCl 20mmol/L缓冲液透析过夜,离心取上清,获得复性后的目的蛋白。
2.3.4 DEAE-52阴离子交换层析将复性成功的蛋白过阴离子交换柱DEAE-cellulose做进一步纯化,以pH 8.0 Tris·HCl 20mmol/L作为缓冲液,再用浓度梯度为0~500mmol/L NaCl色谱缓冲液进行梯度洗脱,收集洗脱峰留样,进行SDS-PAGE电泳分析。将含目的蛋白峰组用蒸馏水充分透析后冻干。
2.5 融合蛋白的Western blot鉴定按照Western-blot方法,分别用兔抗人的VEGF和兔抗人的GRP单克隆抗体对融合蛋白进行Western blot鉴定分析,针对融合蛋白所包含的两个抗原表位做体外生物活性检测。
2.6 重组蛋白对小鼠前列腺癌RM-1的免疫治疗 2.6.1 融合蛋白的作用研究(1)融合蛋白抗肿瘤作用研究:将皮下接种了RM-1肿瘤细胞0.1ml(3×106个/ml)的C57BL/6J小鼠随机分为5组:生理盐水(NS)组,HSP65-GRP6(HG)组,VEGFⅡ(V2)组,VEGFⅡ-GRP6(VG)组,多西他赛(DTX)组,每组9只。实验期间共免疫3次,分别于接瘤后的第5、10、15天,NS组皮下注射生理盐水0.1ml;HG、V2、VG组注射融合蛋白疫苗0.1ml(融合蛋白疫苗用无菌生理盐水配成2mg/ml的溶液,等体积混合弗式不完全佐剂);多西他赛组以10mg/kg剂量给药。待瘤块长到可触程度开始测量肿瘤大小,每隔3天测一次,计算肿瘤体积=长×宽×宽×0.5。每次免疫后第3天进行小鼠眼眶静脉从采血,第三次免疫后的第3天处死各组小鼠,剥取肿瘤,拍照并称重,计算各组抑瘤率(IR)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。将数据进行统计和绘图。
(2)融合蛋白的抗血管生成作用。小鼠腹部除毛,在其腹部真皮浅层皮下接种RM-1细胞0.1ml(106个/ml),以相同的方式给药,最后一次免疫后3d将各组小鼠处死剥离腹部皮肤,观察肿瘤血管生成状况,在10倍显微镜下观察肿瘤周围以及内部的血管分布,并计数瘤块周围1cm2范围内的所有微血管数。
2.7 血清中抗hVEGF抗体的ELISA检测取第3次免疫后第3天取的小鼠血清按照抗hVEGF抗体ELISA检测试剂盒说明书进行操作,计算各组血清样品抗VEGF抗体的浓度。
3 结果 3.1 VEGF121 Ⅰ-M2-DPTGG和GRP6基因鉴定以pET28a-VEGFⅡ为模板,PCR反应后,琼脂糖凝胶电泳结果显示500bp附近有较亮的核酸条带(图 1),条带位置与预期的VEGF121 Ⅰ-M2-DPTGG基因大小(539bp)一致。以pET-28a-HSP65-GRP6为模板,PCR反应后,琼脂糖凝胶电泳结果显示300bp附近有较亮的核酸条带,与GRP6基因片段大小一致。
3.2 重组表达载体的鉴定以重组质粒为模板,V1和G2为引物,进行PCR反应,经琼脂糖凝胶电泳结果显示800bp附近有较亮的核酸条带(图 2),条带位置与预期的VEGF121 Ⅰ-M2-GRP6(798bp)基因大小一致。重组质粒通过DNA测序结果证明GRP6基因已成功插入pET28a-VEGFⅡ中。
3.3 VEGFⅡ/GRP融合蛋白的诱导表达乳糖诱导表达融合蛋白,经12% SDS-PAGE分析,目标条带与预测的蛋白分子质量相符(图 3),且在诱导6h表达量达到最高,7h和8h时其蛋白表达量不再增加,故选择6h作为乳糖诱导表达时间。
3.4 融合蛋白的分离纯化应用离子交换色谱对复性后的蛋白进一步纯化,洗脱时NaCl浓度达150mmol/L时,目的蛋白被洗脱(图 4),将含目的蛋白组分最多的洗脱样品用双蒸水透析除盐、冻干、复溶后SDS-PAGE检测其纯度,可达电泳纯。
3.5 融合蛋白的Western blot鉴定融合蛋白冻干粉用缓冲液复溶,先进行SDS-PAGE电泳,再分别用兔抗人VEGF和GRP单抗对融合蛋白进行Western blot分析,DAB显色。实验结果显示,融合蛋白能够分别与VEGF和GRP单抗结合并在28kDa附近显示棕色条带,说明融合蛋白能特异性识别VEGF和GRP单抗(图 5)。
3.6 融合蛋白对肿瘤生长的影响小鼠皮下接瘤出瘤后开始测量瘤体积,每3天测量一次,每组测量9只,共5组。肿瘤体内增长曲线见图 6c。
最后1次免疫后第3d将各组小鼠处死,剥取肿瘤拍照(图 6a)称重,比较各组抑瘤率(IR)的差异。实验结果显示,通过计算可得,同NS组相比,DTX、HG、V2、VG组的抑瘤率(%)分别为45.6,16,20.8,27.3,可见只有DTX组抑瘤率明显低于NS组(P < 0.05),VG组效果比HG组和V2组好,但HG组、V2组、VG组与NS组相比并无显著性差异。
3.7 融合蛋白对肿瘤血管的影响实验结果(图 7)显示与NS组相比,HG组肿瘤局部微血管生成与其无显著性差异,而V2和VG组的微血管生成显著减少(P < 0.05),DTX与NS组有极显著差异(P < 0.01),可见重组融合蛋白VG对肿瘤血管生长有一定抑制作用。
3.8 血清中抗hVEGF抗体的ELISA检测实验结果(图 8)显示V2和VG免疫组的VEGF抗体水平与NS组相比有显著升高(P < 0.05);而DTX组和HG组抗体水平与NS组比较则无显著差异(P > 0.05)。结果说明hVEGF121Ⅱ/GRP能够一定程度上打破小鼠对VEGF的免疫耐受,诱导小鼠产生抗VEGF的抗体。
4 讨论目前,将抗血管生成和主动免疫治疗联合使用在临床治疗肿瘤中前景十分良好[10]。本实验中,作为阳性对照药的多西紫杉醇,其ELISA检测结果显示其抗VEGF抗体的量最少,但它对肿瘤血管和肿瘤的生长均有抑制作用,其原因可能是多西紫杉醇通过促进细胞微管聚合和阻止微管正常的生理解聚来影响细胞有丝分裂过程,并伴随bcl-2磷酸化,导致bcl-2/bax异二聚体减聚,bax/bax二聚体增加,进而抑制多种肿瘤细胞的生长和诱导其凋亡[11]。
本研究将VEGF和GRP两个抗原表位融合,构建融合蛋白,以其作为蛋白疫苗,来打破VEGF/VEGFR2信号通路实现的抗肿瘤血管生成,以及肿瘤组织自身介导的免疫耐受与逃避。ELISA实验结果表明,融合蛋白VG作用后,小鼠体内产生了抗VEGF抗体,该抗体可阻断VEGF与其受体Flk-1或KDR结合,对肿瘤的血管生成有一定的抑制作用,但是在抑制肿瘤生长的实验中,本疫苗虽相对NS组有一定的抑制肿瘤生长的作用,但并无统计学差异。主要原因可能在肿瘤治疗是在接瘤后给药,而主动免疫效果的形成需要2~4周,故不能有效地抑制肿瘤的生长。本蛋白疫苗是在蛋白VEGFⅡ的基础上连接了6次重复肽段GRP,通过实验可知,hVEGF121Ⅱ/GRP疫苗抑瘤效果比VEGFⅡ好,但并无统计学差异。可能原因在于GRP多肽免疫原性较弱,只能激发低水平的CTL反应,不能获得理想的抗肿瘤效果。
虽然该融合蛋白已在原核表达系统中正确表达,但其表达为包涵体表达,复性率低,故为获得高活性、高纯度的蛋白疫苗,可换用真核表达载体,蛋白纯化方法还需进行深入探索,且该蛋白疫苗的抗肿瘤作用机理还需进一步验证。
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