2016, Vol. 36文章信息
- 王晶, 夏文跃, 潘小霞, 赵冰心, 滕玉梅, 李传印, 杨筱舟, 文喻玲, 陈元鼎.
- WANG Jing, XIA Wen-yue, PAN Xiao-xia, ZHAO Bing-xin, TENG Yu-mei, LI Chuan-yin, YANG Xiao-zhou, WEN Yu-ling, CHEN Yuan-ding.
- Ⅱ型脊灰病毒抗原表位嵌合蛋白的免疫学研究
- Immunological Activity of a Chimeric Protein Carrying an Epitope of Type 2 Poliovirus on the VP6 of Rotavirus as a Vector
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(8): 1-8
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(8): 1-8
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160801
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文章历史
- 收稿日期: 2016-05-23
- 修回日期: 2016-06-03
2. 云南民族大学化学与生物技术学院民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室 昆明 650118
2. Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources, State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education, Yunnan Minzu University, Kunming 650500, China
轮状病毒(rotavirus, RV)是分节段的双链RNA病毒，属于呼肠病毒科(Reoviridae)，轮状病毒属(Rotavirus)。RV是引起人类婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体[1]。全世界每年大约有453 000个5岁以下的儿童死于RV感染引起的腹泻[2]。完整RV病毒颗粒具有三层衣壳。最外层由刺突样、对乙酰化胰酶敏感的VP4和糖基化的VP7蛋白组成。中间层由260个呈三聚体的VP6蛋白构成。在中间层之下，VP1、VP2及VP3组成的内层衣壳包裹着病毒基因组的11条双链RNA。以上6种蛋白是RV基因编码的全部结构蛋白。其中，VP6蛋白是病毒的组抗原蛋白，含量最为丰富，结构高度保守[3-4]。根据VP6抗原性差异可将已发现的RV分成至少8个组(A~H组)，其中有4个组(A，B，C和H组)的RV可对人类造成感染[5]。研究表明，用VP6蛋白免疫小鼠可以保护小鼠免受RV的攻击[6]；VP6免疫豚鼠的抗血清能够中和RV SA11和Wa株对MA104细胞的感染[3, 7]。所以，以VP6为基础开发新型RV疫苗具有很好的研究前景。
脊髓灰质炎病毒(poliovirus PV)是一种无包膜单股正链的微小核糖核酸病毒，属于肠道病毒属(Enterovirus)。PV感染婴幼儿后会造成肢体迟缓性麻痹，故又称小儿麻痹病毒。PV的基因组约为7.5kb，编码4个结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)及7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、和3D)[8]。已知的PV病毒都可以分类为3个血清型(PV1、PV2和PV3)，3个型之间几乎无交叉保护性。PV的中和抗原分布在结构蛋白VP1、VP2和VP3的外露表面环上，可分为3个中和抗原位点(NAs)。NAs1包括VP1的第91~102、254和168位氨基酸。NAs2包括VP2的166~170和270以及VP1的221~226位氨基酸。NAs3包括VP1的285~289、VP3的58~60、71和73以及VP2的72位氨基酸[9]。
目前用于预防RV和PV感染的疫苗都属于传统性疫苗。WHO推荐使用的两种口服RV疫苗分别是Rotarix® (GlaxoSmithKline)和Rotateq® (Merck)。Rotarix是一种分离自人G1P[8]的单价疫苗，而Rotateq是包含人G1、G2、G3、G4和牛P7[5]以及人P1A[8]和牛G6基因重配的五价疫苗[10]。在欧美国家Rotarix对所有RV引起的重型腹泻的保护性高达85%，Rotateq对G1、G2、G3、G4和G9型RV引起的重型腹泻的保护性为98%[11]。但在经济欠发达国家和地区，RV疫苗的有效性则不太理想。比如在卢旺达，RV疫苗的接种率虽然高达98%~99%，但因RV腹泻而就诊的比例在2013和2014只下降了49%和48%[12]。自上世纪50年代开始使用口服脊灰病毒疫苗(OPV)和灭活脊灰病毒疫苗(IPV)以后，PV引起的脊髓灰质炎得到了很好的预防。但是疫苗源性的脊灰病毒(VDPV)及疫苗相关的麻痹性脊髓灰质炎(VAPP)是传统PV疫苗不足之处，尤其在免疫力低下人群体内，免疫OPV后疫苗病毒有可能不断复制并快速转为有神经毒性的病毒，进而造成接种者瘫痪或慢性感染并且引起脊髓灰质炎的群体性感染爆发[13]。
所以，研发可以弥补现存RV和PV疫苗不足的新型疫苗是有必要的。本研究通过基因克隆和重组技术将PV2的一个抗原表位插入到作为载体的A组RV TB-chen株VP6上构建嵌合蛋白，嵌合蛋白在大肠杆菌中表达并进行免疫学研究。研究结果为开发新型可预防RV和PV感染的疫苗提供了有用的依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞、病毒、质粒及菌株MA104和Vero细胞由本实验室保存，培养液为含10%胎牛血清的MEM；RV SA11株和脊灰病毒Ⅰ型Sabin SO+1(PV1)、Ⅱ型Sabin SO+1(PV2)和Ⅲ型457Pfizer RS1(PV3)来自WHO；TB-Chen株病毒：分离自2岁龄的中国急性胃肠炎患者大便样品，为A组RV；本研究中的TB-Chen株RV VP6基因：克隆自TB-Chen株RV基因组中编码VP6的第6基因；表达质粒pETL源自本实验室保存的质粒pET-3a，克隆和扩增质粒用DH5α以及表达菌株BL21(DE3)由本实验室保存。感受态大肠杆菌由本实验室制备。
1.1.2 试剂限制性内切酶Bln Ⅰ、BamH Ⅰ和T4 DNA连接酶等购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；羊抗豚鼠IgG荧光抗体购自美国KPL公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗豚鼠IgG购自Proteintech公司。二氨基联苯胺(DAB)购自美国Sigma公司。
1.1.3 实验动物豚鼠，体重250g~300g，2月龄，由中国医学科学院医学生物学研究所实验动物中心提供。
1.2 方法 1.2.1 载体蛋白质粒的构建以RV TB-Chen株的VP6构建载体[3]。载体蛋白基因含有Sac Ⅰ，BspT104，Kpn Ⅰ，BlnⅠ，SacⅡ及XhoⅠ6个酶切位点，重组VP6F蛋白分子结构如图 1所示。VP6F编码基因插入到pETL质粒的NdeⅠ/BamH Ⅰ克隆位点，构建携带载体蛋白VP6F编码基因的重组质粒pETP6F。
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| 图 1 VP6F载体蛋白的三维分子结构 Figure 1 Three-dimensional molecular structure of vector protein VP6F |
本研究选取PV2 NAs1的抗原表位，对应的氨基酸序列为EVDNDAPTKRAS。合成编码抗原表位的寡核苷酸序列PV2/N1/308X[F]:TCG AGG AAG TGG ATA ATG ATG CTC CAA CAA AGC GTG CCA GTG GCC和PV2/N1/308X [R]:TCG AGG CCA CTG GCA CGC TTT GTT GGA GCA TCA TTA TCC ACT TCC。运用基因重组技术[7]，并将退火后的抗原表位双链编码基因插入到VP6F载体蛋白上的I6位点(图 1)。携带抗原表位嵌合蛋白编码基因重组连接到pETL质粒的BlnⅠ/BamH Ⅰ克隆位点上，构建在VP6F上携带PV2抗原表位基因的重组表达质粒pETP6F/PV2N1。重组表达质粒经双酶切鉴定，并经DNA测序测定，确定完整正确后，进一步进行蛋白表达研究。
1.2.3 重组嵌合蛋白的表达和纯化重组质粒pETP6F，pETP6F308X/PV2N1在大肠杆菌中表达。将酶切和测序鉴定无误的重组质粒pETP6F和pETP6F308X /PV2N1分别转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞。转化细胞涂布于Amp+ LB培养基上，37℃过夜培养。挑选菌落接种于3ml含氨苄青霉素(Amp，200μg/ml)的LB培养液中，37℃，120r/min摇床培养7h，取50μl菌液转入300ml LB培养基中，37℃，120 /min条件下扩大培养16h。4 000r/min离心8min，收集菌体。菌体悬浮于超声裂解缓冲液[150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris (pH7.5)，5%甘油，1% TritonX-100，2mmol/L EDTA(pH8. 0)，0.2%-巯基乙醇，超声破碎细胞。裂解液于12 000r /min，4℃离心30min，收集沉淀(包涵体蛋白)，超声洗涤液(10mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，0.1% Triton X-100)漂洗，12 000r/min，5min离心洗涤沉淀。将包涵体蛋白溶于8mol/L尿素溶解，分装并于－20℃，保存并进行SDS-PAGE检测。
溶解于8mol/L尿素中的包涵体蛋白用SDS-PAGE电泳分离，在150mmol/L的KCl中显色，将重组蛋白目的条带切下，放入到12% SDS-PAGE的凝胶柱中电泳(20mA，4℃，15h)，富集到与凝胶柱相连，盛有不含SDS电泳液的回收杯中。收集蛋白回收液，分装，－20℃保存。蛋白浓度采用Bradford法进行测定[14]。
1.2.4 动物免疫实验豚鼠分成实验组和阴性对照组，共免疫3次。初次免疫前，随机对两只实验豚鼠采血，检测血清抗体，排除RV/PV前期感染。实验组设有A，B，C，D四个组，每组5只，分别免疫VP6F、6F/P V2N1、SA11和PV2，免疫剂量：蛋白120μg/100μl /只；病毒1×107 TCID50/只，免疫方式为后腿皮下注射免疫。阴性对照组注射TNMC缓冲液，100μl/只。初次免疫后2周进行加强免疫，免疫剂量和免疫方式同第1次免疫。1周后进行第2次加强免疫。第2次加强免疫5天后，心脏采血，制备免疫血清。
1.2.5 病毒增殖和感染性滴度测定轮状病毒SA11在MA104细胞上增殖，感染细胞前病毒预先经乙酰化胰酶(终浓度为10μg/ml)37℃下处理1h。MA104长成致密单层时感染病毒，维持液为不含胎牛血清的MEM。当90%细胞出现病变(CPE)时收获培养物。
PV在Vero细胞上增殖，当细胞长成致密单层时直接感染病毒，维持液为不含胎牛血清的MEM。当90%细胞出现病变(CPE)时收获培养物。
病毒感染性滴度测定在96孔板上进行。待MA104/Vero细胞生长成致密单层后，用PBS洗2次，维持液洗1次，再加入维持液100μl/孔，然后加入10倍梯度稀释的SA11/PV。每个样品设置4孔，50μl/每孔，同时设置细胞对照组(维持液)。37℃，5% CO2培养箱内培养48h，观察细胞病变情况(CPE)。病毒感染性滴度以使培养孔内50%细胞出现病变(TCID50)最高稀释倍数的倒数表示。
1.2.6 免疫荧光试验在盖玻片上长成致密单层的MA104/ Vero细胞，用PBS洗细胞2次，MEM维持液洗1次，用SA11/PV感染。病毒感染后6h后取出盖玻片，用预温的PBS(137mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4)漂洗3次，－20℃无水甲醇固定30min，然后依次在70%、30%、10%预冷乙醇中分别放置10min，再用PBS漂洗3次，加入豚鼠抗血清(1∶400稀释)，37℃孵育1h；PBS-T(含有0.1%Tween-20的PBS)漂洗5次，加入荧光抗体(1∶100稀释)，37℃孵育1h，PBS-T漂洗5次，干燥后甘油封片，置于荧光显微镜下观察。
1.2.7 Western blot用半干转印的方式将SDS-PAGE电泳胶上的蛋白在恒压转移至PVDF膜上(恒压15V，转30min), PVDF膜用含5%脱脂奶粉(TBS稀释) 4℃封闭过夜。封闭后加入作为一抗的豚鼠免疫血清(1∶500稀释)，37℃反应1.5h。TBS-T(含有0.1%Tween-20的TBS)漂洗5次，加入HRP标记的羊抗豚鼠IgG(1∶2 000稀释)，37℃反应1.5h；DAB溶液(TBS稀释)显色，蒸馏水漂洗终止显色。
1.2.8 血清抗体中和试验豚鼠免疫血清先用MEM维持液做1∶10稀释，再按1∶2连续稀释，与等体积的100 TCID50/100μl的病毒液(SA11/PV)混合，37℃中和作用1h后，加至已在96孔板中长成单层的MA104/Vero细胞上(100μl /孔)，每个检测样品设置2孔。阳性对照孔只加病毒样品，阴性对照孔只加维持液。细胞放培养箱中，37℃，5% CO2培养48h，观察细胞病变(CPE)。血清抗体中和滴度以保护50%细胞不出现CPE的稀释倍数的倒数表示。
2 结果 2.1 重组嵌合蛋白表达载体质粒的构建运用分子克隆手段构建载体蛋白VP6F的表达质粒pETP6F及嵌合蛋白6F/PV2N1的表达质粒pETP6F/PV2N1。重组载体蛋白质粒pETP6F和嵌合蛋白质粒pETP6F/PV2N1经BlnⅠ/BamH I双酶切鉴定，分别在相应的位置可见一条约370bp，410bp的条带(图 2)，与预期相符。结果表明，嵌合蛋白质粒pETP6F/PV2N1中成功插入PV2 NAs1的抗原表位基因。DNA测序结果表明所构建的质粒核苷酸序列完整正确。
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| 图 2 重组质粒BInⅠ/BamH Ⅰ双酶切琼脂糖凝胶电泳(1.5%) Figure 2 Agarose gel(1.5%)electrophoresis analysis of BInⅠ/BamHⅠ double enzyme digestion of recombinant plasmids M:250bp DNA Marker；1:pETP6F/PV2N1；2:pETP6F |
重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中转化和表达。重组表达的载体蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV2N1分别为380aa和395aa，分子量分别为43.2kDa和44.8kDa。经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色的方法检测，结果与预期相符(图 3)。表达的重组蛋白均存在于包涵体中，细胞培养上清和超声裂解上清中未检测到目的蛋白。表达蛋白经纯化(图 3b)，用于动物免疫和其它检测。
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| 图 3 纯化前(a)和纯化后(b)重组嵌合蛋白SDS-PAGE(10%) Figure 3 10%SDS-PAGE of pre-(a) and post-(b) purified chimeric protein M:Protein marker; 1:Vector protein VP6F; 2:Chimeric protein 6F/PV2N1 |
免疫荧光结果表明，载体蛋白VP6F免疫豚鼠血清抗体可以识别SA11感染的MA104细胞内的病毒抗原(图 4A)，但不能识别PV2感染的Vero细胞内的病毒抗原(图 4a)；嵌合蛋白6F/Pv2N1免疫的豚鼠血清抗体可以识别SA11感染的MA104细胞和PV2感染的Vero细胞内的病毒抗原(图 4B/b)；SA11免疫的豚鼠血清抗体只能识别SA11感染的MA104细胞内的RV抗原(图 4C)，不能识别Vero细胞内的PV2抗原(图 4c)；PV2免疫的豚鼠血清抗体只能识别PV2感染的Vero细胞内的病毒抗原(图 4d)，不能识别MA104细胞内的SA11抗原(图 4D)。
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| 图 4 病毒抗原蛋白在感染细胞中的免疫荧光检测 Figure 4 Immunofluorescence analysis of virus antigen in SA11-infected MA104 cells (A~D) and PV2-infected Vero cells (a~d) using antibodies against vector protein VP6F (A/a), chimeric protein 6F/PV2N1 (B/b), SA11 (C/c) and PV2 (D/d) |
免疫前、阴性对照以及PV1和PV3免疫的豚鼠血清对SA11感染的MA104细胞和PV2感染的Vero细胞内的病毒抗原都不能识别。
2.4 Western blot分析Western blot结果表明，重组蛋白免疫豚鼠血清抗体可与相应抗原特异性反应。载体蛋白VP6F免疫豚鼠血清抗体能特异性结合载体蛋白VP6F、嵌合蛋白6F/PV2N1以及SA11(图 5a)；嵌合蛋白6F/PV2N1免疫的豚鼠血清抗体不但能特异结合嵌合蛋白6F/PV2N1，同时还能结合载体蛋白VP6F和RV SA11(图 5b)；抗SA11血清能同时结合载体蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV2N1(图 6a)；抗PV2血清只能特异性结合嵌合蛋6F/PV2N1，对载体蛋白VP6F无反应(图 6b)；抗PV1和PV3以及阴性对照血清对载体蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV2N均无反应。
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| 图 5 抗嵌合蛋白豚鼠血清抗体的Western blot检测 Figure 5 Western blot of the chimeric protein by antibodies in sera from inoculated guinea pigs immunized with vector VP6F (a), chimeric protein VP6F/PV2N1 (b) M:Protein marker; 1:Chimeric protein6F/PV2N1; 2:Vector protein VP6F; 3:SA11-infected MA104 cell lysate |
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| 图 6 抗嵌合蛋白豚鼠血清抗体的Western blot检测 Figure 6 Western blot of the chimeric protein with antibodies from inoculated guinea pigs immunized with SA11(a), PV2(b) (a) M:Protein marker; 1:Chimeric protein 6F/PV2N1; 2:Vector protein VP6F (b) M:Protein marker; 1:Vector protein VP6F; 2:Chimeric protein6F/PV2N1 |
免疫动物血清中和抗体滴度测定结果显示，VP6F蛋白，6F/PV2N1和SA11免疫豚鼠血清抗体可以中和SA11在MA104细胞的感染，血清抗体滴度分别为320，320和10240。6F/PV2N1免疫血清抗体具有中和PV2感染的中和活性(中和滴度为1280)。VP6F蛋白，6F/PV2N1，SA11和PV2免疫豚鼠血清抗体对PV1和PV3的感染均无中和活性(中和滴度 < 10)。免疫前及阴性对照血清对RV和PV的感染均无中和活性(中和滴度 < 10)(表 1)。结果表明抗嵌合蛋白6F/PV2N1抗体同时具有抗SA11和PV2的中和活性。
| Virus | Neutralization titer of antibody* | ||||
| NC** | VP6F | 6F/PV2N1 | SA11 | PV2 | |
| SA11 | < 10 | 320 | 320 | 10240 | < 10 |
| PV1 | < 10 | < 10 | < 10 | < 10 | < 10 |
| PV2 | < 10 | < 10 | 1280 | < 10 | 10240 |
| PV3 | < 10 | < 10 | < 10 | < 10 | < 10 |
| * Arithmetic mean ** Negative control | |||||
3 讨论
本研究运用分子克隆和基因重组技术，将A组人RV TB-Chen株的组抗原蛋白VP6的编码基因进行克隆和重组，构建可以插入外源性抗原表位基因的载体蛋白VP6F，将PV2抗原表位NAg1插入VP6F上，构建了嵌合蛋白6F/PV2N1。嵌合蛋白6F/PV2N1可以在E.coli系统中大量表达。研究结果表明，6F/PV2N1可刺激免疫豚鼠产生可以抗SA11和PV2感染的血清中和抗体，具有双重免疫原性。
RV是导致婴幼儿严重腹泻的主要原因，全世界每年有大量的婴幼儿因感染RV致死，其中绝大部分发生在发展中国家。鉴于RV的严重危害及其所造成的巨大社会负担，全球疫苗和免疫联盟在2001年呼吁第三世界国家积极研发和使用RV疫苗[15-16]。RV疫苗的研发始于上个世界80年代初，SmithKline-RIT将一株牛源RV作为候选疫苗，该疫苗对RV的严重感染有很好的保护性，但对轻中度感染保护性比较差，其研发因在非洲临床试验的免疫保护性较差而终止。1998年美国惠氏公司推出RV的多价重配疫苗(Rotashield)，该疫苗对G1~G4四个血清型引起的腹泻均有保护作用，其免疫保护性与之前的疫苗相比有很大的加强。但后来发现并证实该疫苗会引起肠套叠，因此被撤销上市。目前WHO推荐的两种RV口服疫苗是Rotarix®(GlaxoSmithKline) (RV1)和Rotateq®(Merck)，在经济发展比较好的国家和地区，RV1和VP5对RV的严重感染有非常好的保护性，而对中轻度RV感染的保护性相对较差。在发展中国家，由于公共卫生和RV疫苗经济负担的原因，RV1和RV5的有效保护性比欧美国家要差很多。另外，有迹象表明在一些国家RV口服疫苗引起肠套叠的风险呈上升趋势[17-18]。
与RV一样，PV也是威胁公共健康的一个因素。人感染PV会引起脊髓灰质炎，造成肢体麻痹性瘫痪。目前全世界用于预防PV感染的疫苗有两种，分别是口服脊灰病毒疫苗(OPV)和灭活脊灰病毒疫苗(IPV)。自1988年PV灭绝计划开始实施至今，野生PV感染的病例下降超过99%[19]。我国最后一例野生PV感染发生在1999年，野生PV感染的威胁已基本消除。但疫苗源性的脊灰病毒(VDPV)正逐渐成为引起脊髓灰质炎的主要原因。数据表明我国疫苗源性的脊灰病毒(VDPV)及疫苗相关的麻痹性脊髓灰质炎(VAPP)的发生率高于其他国家[20]。VDPV正成为威胁我国无脊髓灰质炎国家形象的主因。
鉴于上述问题，研制可以克服RV和PV减毒活疫苗所存在弊端的新型疫苗具有重要意义。本研究运用基因工程技术构建RV/PV2抗原表位嵌合蛋白，并通过免疫荧光、Western blot和血清抗体中和试验检测其免疫学性质。研究结果表明6F/PV2N1具有较好的抗RV和抗PV2免疫原性。与传统的RV和PV疫苗相比，嵌合蛋白6F/PV2N1有以下优势：(1)不涉及病毒制备，生物安全性更高；(2)不会出现疫苗病毒毒力返祖现象；(3)不会感染和破坏肠道细胞，所以不存在肠套叠风险。本研究成果为进一步研制更有效的RV/PV2联合疫苗奠定了很好的基础。
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