2016, Vol. 36文章信息
- 曾斯雨, 施天穹, 石焜, 任路静, 黄和, 纪晓俊.
- ZENG Si-yu, SHI Tian-qiong, SHI Kun, REN Lu-jing, HUANG He, JI Xiao-jun.
- 高山被孢霉遗传操作系统的构建与应用
- Establishment and Application of Genetic Motification System for Mortierella alpina
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(7): 112-116
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(7): 112-116
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160715
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-27
- 修回日期: 2016-05-18
2. 南京工业大学材料化学工程国家重点实验室 南京 210009
2. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China
功能性油脂是一类重要的脂类物质，有特殊的生理活性，可促进机体健康。多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFAs)是功能性油脂发挥功能的主要体现者，广泛应用于医药保险和食品添加剂等领域，其一般通过产油微生物来积累获得[1]。丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)的油脂积累量高达自身干重的50%，是一种重要的产油微生物[2]。以前对M. alpina的研究重点集中在菌种选育和发酵条件优化等方面[3]。目前，通过基因工程改造M. alpina获得优良菌种以提高PUFAs含量受到多数研究人员的青睐。为了确定M. alpina的生理学特性和阐明PUFAs的生物合成途径，研究人员已成功构建了多种M. alpina遗传操作系统，为基因工程育种提高脂肪酸的生产水平奠定了坚实的基础。
1 高山被孢霉的筛选标记及遗传操作系统M. alpina的遗传转化方法主要有原生质体-聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)转化法、基因枪转化法及根瘤农杆菌介导的转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)。M. alpina的遗传操作系统中常用的筛选标记包括潮霉素抗性基因(Hpt)、博莱霉素抗性基因(Zeo)、萎锈灵抗性基因(CBXB)和尿嘧啶合成基因(Ura5)。英国诺维奇食品研究所的Mackenzie团队[4]、日本京都大学的Shimizu团队[5-7]和中国江南大学的陈永泉团队[8-10]都建立了M. alpina的遗传操作系统(实例汇总见表 1)。
| Transformation methods | Selective markers | M. alpinahost | Note | References |
| PEG | Hpt | CBS 224.37 | Establishment of PEG transformation system | [4] |
| LU166 | Arachidonic acid content increased by 30%, oil content increased by 10% | [12] | ||
| Microprojectile bombardment | Hpt | 1S-4 | Acquisition of 1S-4△ura5 strain | [17] |
| Zeo | Overexpression of elongase which catalyses gamma-linolenic acid into dihomo-gamma-linolenic acid, improving the fatty acid composition | [14] | ||
| CBXB | Expression ofβ-glucuronidase | [15] | ||
| Dihomo-gamma-linolenic acid-producing strains were constructed, theΔku80 strains showed no negative effects on vegetative growth, formation of spores and fatty acid productivity | [16] | |||
| Overexpression of theω3Des gene | [7] | |||
| Silence of the△12-desaturase gene, accumulation the fatty acid of 18:2n-9, 20:2n-9 and 20:3n-9 | [18] | |||
| ATMT | CBXB | 1S-4 | The gene targeting efficiency of△lig4 strains was increased 21-fold | [19] |
| Ura5 | 1S-4 | ω3Des gene was overexpressd, and the n-3 fatty acids reached 40% of total fatty acids | [24] | |
| ATCC 32222 | Overexpression of malE1 gene(fatty acid content increased for 30%) and malE2 gene (arachidonic acid content for 60%). Silence of glucose-6-phosphate dehydrogenase gene and 6-phosphogluconate dehydrogenase gene and the fatty acid content decreased for 40% and 15%, respectively | [9] | ||
| Overexpression of malic anzyme gene(arachidonic acid content for 30%) | [25] | |||
| Overexpression ofω3Des | [26-27] | |||
| Conjugated linolenic acid was detected | [10, 28] |
1.1 原生质体-PEG转化法
PEG转化法的原理：首先制备宿主原生质体，加入待转化的质粒，在PEG和CaCl2的作用将外源DNA导入宿主原生质体中[11]。Mackenzie等[4]和张长杰等[12]首次以Hpt作为筛选标记，利用PEG转化法将重组质粒pD4导入M. alpina CBS 224.37和M. alpina LU166原生质体中，建立了M. alpina的遗传操作系统。
PEG转化法只需成功制备与再生原生质体，操作简便。但其存在以下缺点：①PEG对原生质体有毒性，突变率较高，转化效率较低。②原生质体制备麻烦：溶壁酶不能有效裂解M. alpina坚厚的细胞壁，且转化前的原生质体难以保存。③原生质体再生率较低。这些缺点的存在限制了该转化方法的应用[13]。
1.2 基因枪转化法基因枪转化法利用含有Ca2+的亚精胺等使外源DNA吸附在细小的钨粒或金粒表面后制成DNA微粒，微粒在高气压下被高速射入受体，同时外源DNA导入受体并整合到其染色体中。日本京都大学的Shimizu团队建立了转化M. alpina 1S-4的基因枪转化法。Takeno等[14]构建了pDZeo载体，20mg/ml博莱霉素能完全抑制孢子的发芽，并在某种程度上抑制菌株的生长。但是，利用异源基因作为筛选标记不适用于工业生产，高浓度的博莱霉素价格昂贵，且不能完全抑制菌丝的生长。Ando等[15]和Kikukawa等[16]以杀菌剂萎锈灵作为筛选标记，转化M. alpina 1S-4，转化效率为40~50个转化子/4.0×108孢子。100μg/ml萎锈灵能完全抑制菌丝生长和孢子萌发。该团队[13, 17-18]除了以抗生素作为筛选标记之外，更有效地利用了Ura5作为标记基因。Takeno等构建了以同源组蛋白H4.1p为强启动子的pDura5载体。通过Ura5标记基因筛选获得30个阳性转化子，转化效率不高，但能获得理想的结果[13, 17]。
基因枪转化法的关键在于是否能筛选到稳定的转化子。该法无须制备原生质体，操作快速简便且受体广泛，包括菌丝体、孢子、子实体等。但存在很多缺点：①成本高；②需较多受体，难筛选到稳定的转化子；③难排除嵌合体；④转化效率低且转化子再生困难。
1.3 根瘤农杆菌介导转化法根瘤农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，侵染植物受伤部位，其分泌的酚类诱导T-DNA转化进入植物细胞并整合到基因组中，从而使其产生肿瘤。
日本京都大学的Shimizu团队建立了转化M. alpina 1S-4的ATMT转化法。Takeno等[5, 17]使用诱变剂亚硝基胍随机诱变M.alpina 1S-4得到尿嘧啶缺陷型。Kikukawa等[19]构建了pBIG3CBZL4载体，转化M. alpina 1S-4后的转化子含萎锈灵抗性，其靶向效率是以Ura5为标记基因的20.7倍。
但是诱变菌株往往存在未知突变，无表型特性的遗传背景存在隐患，对日后的基因工程操作和工业化产生不可预知的风险。江南大学的陈永泉团队利用ATMT转化M. alpina ATCC 32222构建了多种M. alpina遗传操作系统。陈永泉等通过同源重组敲除M. alpina ATCC 32222中的Ura5基因获得营养缺陷型菌株，发现0.5mg/ml的5-氟乳清酸能完全抑制野生型菌株的生长并有效筛选到尿嘧啶营养缺陷型[18]。
与其它转化法相比，ATMT具备以下4个优点[20-21]。①受体可以是不同生长时期的分生孢子、子实体、菌丝，不用制备原生质体。②转化效率高。③多数为单拷贝插入突变体，易分离标签基因。④转化子稳定。⑤同源重组效率高。
2 高山被孢霉遗传操作系统的应用M. alpina遗传操作系统的构建为学者们从基因水平研究M. alpina的遗传背景和进一步改造菌株以生产PUFAs提供了坚定的基础。M. alpina遗传操作系统的应用主要有敲除、抑制和表达受体目的基因。
2.1 敲除和抑制目的基因M. alpina遗传操作系统是研究其功能基因的重要手段。将含有外源DNA的质粒导入M. alpina，可通过同源重组敲除或RNA干扰实现对目的基因的抑制。
日本京都大学的Takeno等以Ura5作为标记基因，利用基因枪转化法转化M. alpina 1S-4，采用RNAi技术沉默了△12-去饱和酶基因[16, 18]。突变株能产生野生型菌株不能积累的脂肪酸(18:2n-9、20:2n-9和20:3n-9)；同时干扰了编码双高-γ-亚麻酸转化生成花生四烯酸(ω-6)的△5-去饱和酶关键酶基因和ku80基因，构建了双高-γ-亚麻酸生产菌株。△Ku80的营养生长、孢子形成和脂肪酸生产率没有产生负面影响。而Kikukawa等[19]采用ATMT转化M. alpina 1S-4，通过干扰编码DNA连接酶4一族的lig 4基因，构建了更有效的基因靶向系统。
江南大学的陈永泉团队[8-9, 22]利用ATMT，同源重组敲除M. alpina ATCC 32222中的Ura5基因获得营养缺陷型。他们还构建了RNAi载体，并沉默了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，脂肪酸含量分别降低了40%和15%。实验证明M. alpina脂肪酸合成所需的NADPH主要由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和苹果酸酶共同提供，其中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶为细胞提供了更多的NADPH。
2.2 表达目的基因控制脂肪酸生物合成途径中相关基因的表达量能高效地控制基因的活性并分析其功能。张长杰等[12]和Takeno等[14]用M. alpina遗传操作系统过表达了PUFAs延长酶基因。张长杰获得的转化子摇瓶结果显示，重组菌中花生四烯酸含量提高了30%。实验证实催化γ-亚麻酸生成双高-γ-亚麻酸的脂肪酸延长酶是花生四烯酸合成过程中的限速步骤[23]。Ando等[15]利用基因枪转化法转化M. alpina 1S-4，表达了异源的uidA基因(编码β-半乳糖苷酶)。同年[24]，他们在H4.1启动子的控制下采用ATMT转化M. alpina 1S-4过表达ω3脱饱和酶(ω3 desaturase, ω3Des)。转化株的n-3脂肪酸含量为总脂肪酸的40%。而Okuda等[7]同时利用基因枪转化法和ATMT转化M. alpina S-14，过表达了内源的ω3Des和异源的异枝水霉17去饱和酶。S-14转化子中引入ω3Des基因后12℃培养时，二十碳四烯酸(ω-3)含量为总油脂含量的42.1%，分别比野生型菌1S-4和宿主菌S14(营养缺陷型)高84.2倍和3.2倍。28℃培养时，在含有异枝水霉17去饱和酶的S14转化子中，二十碳四烯酸含量为总油脂的24.9%。
江南大学的陈永泉团队使用ATMT转化M. alpina ATCC 32222营养缺陷型，表达了多种目的基因。郝光飞等[28]同源过表达苹果酸酶1，使脂肪酸含量提高了30%；同源过表达苹果酸酶2，花生四烯酸含量提高了60%。结果表明在产油真菌的脂肪酸合成过程中，苹果酸起着重要的作用[9, 25]。陈永泉等[26]和黄小云[27]将重组质粒pBIG2-ura5s-FADS15导入M. alpina ATCC 32222构建了一株能生产二十碳五烯酸的ω3Des过表达菌株。其中转化子MA-ω3Des-1、MA-ω3Des-2、MA-ω3Des-3的二十碳五烯酸含量分别为野生型菌株的6.02倍、5.62倍和5.92倍。陈海琴等[10]和郝丹辉等[28]将载体pBIG2-ura5s-PAI和pBIG2-ura5s-oPAI(含密码子优化后的oPAI基因)导入M. alpina ATCC 32222，得到一株可异源表达共轭亚油酸异构酶的重组菌，且添加抑制剂长链酰基辅酶A合成酶后，检测到重组菌中含有共轭亚油酸。
3 展望通过遗传改造获得一株性能优良的M. alpina生产菌株是PUFAs生产的关键，而构建M. alpina遗传操作系统，是遗传改造的第一步。目前，通过遗传转化M. alpina进行RNAi达到干扰和敲除目的基因，从而有效调控其脂肪酸代谢已经取得了一些有效进展。但RNAi技术必须确定目的基因部分序列才能进行RNA干扰和沉默，且易引起部分同源的非目的基因抑制或者干扰，同源重组效率低，而新兴发展的CRISPR/Cas9技术从基因水平将靶基因彻底、永久地敲除，效率高，因此更具有优势。
简而言之，建立产油丝状真菌M. alpina遗传操作系统为学者们从基因水平研究其遗传背景提供了参考作用。随着对M. alpina遗传操作的进一步深入，新型的遗传操作系统将会成为研究M. alpina功能基因、分离标记基因的有效手段，且能有效提高PUFAs的含量和改善其脂肪酸组成。
| [1] | Ji X J, Ren L J, Nie Z K, et al. Fungal arachidonic acid-rich oil:research, development and industrialization. Critical Reviews in Biotechnology , 2014, 34 (3) : 197–214. DOI:10.3109/07388551.2013.778229 |
| [2] | Bajpai P K, Bajpai P, Ward O P. Production of arachidonic acid by Mortierella alpina ATCC 32222. Journal of Industrial Microbiology , 1991, 8 (3) : 179–185. DOI:10.1007/BF01575851 |
| [3] | 丛蕾蕾, 彭超, 纪晓俊, 等. 高山被孢霉产花生四烯酸及其遗传改造的研究进展. 生物工程学报 , 2010, 26 (9) : 1232–1238. Cong L L, Peng C, Ji X J, et al. Progress in production of arachidonic acid by Mortierella alpina and genetic modification. Chinese Journal of Biotechnology , 2010, 26 (9) : 1232–1238. |
| [4] | Mackenzie D A, Wongwathanarat P, Carter A T, et al. Isolation and use of a homologous histone H4 promoter and a ribosomal DNA region in a transformation vector for the oil-producing fungus Mortierella alpina. Applied and Environmental Microbiology , 2000, 66 (11) : 4655–4661. DOI:10.1128/AEM.66.11.4655-4661.2000 |
| [5] | Takeno S, Sakuradani E, Murata S, et al. Establishment of an overall transformation system for an oil-producing filamentous fungus, Mortierella alpina 1S-4. Applied Microbiollogy and Biotechnology , 2004, 65 (4) : 419–425. DOI:10.1007/s00253-004-1622-6 |
| [6] | Sakuradani E, Shimizu S. Single cell oil production by Mortierella alpina. Chinese Journal of Biotechnology , 2009, 144 (1) : 31–36. DOI:10.1016/j.jbiotec.2009.04.012 |
| [7] | Okuda T, Ando A, Negoro H, et al. Omega-3 eicosatetraenoic acid production by molecular breeding of the mutant strain S14 derived from Mortierella alpina 1S-4. Bioscience and Bioengineering , 2015, 120 (3) : 299–304. DOI:10.1016/j.jbiosc.2015.01.014 |
| [8] | 陈卫, 郝光飞, 陈永泉, 等.一种通过同源重组敲除ura5基因的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型及其构建方法:中国, CN103468581A.2013-12-15. Chen W, Hao G F, Chen Y Q, Chen H Q, et al.A Mortierella alpina Uracil Auxotrophy of ura5 Gene Was Deleted and Its Construction Methods:China, CN103468581A.2013-12-15. |
| [9] | 郝光飞. 高山被孢霉脂肪酸合成过程转录水平调控和还原力来源研究. 无锡: 江南大学食品学院, 2014 . Hao G F. The Study of the Transcriptional Regulation and the Source of Reducing Power During Fatty Acid Synthesis in Mortierella alpina. Wuxi: Jiangnan University, School of Science and Technology, 2014 . |
| [10] | 陈海琴, 陈卫, 陈永泉, 等.一种异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被孢霉菌株及其构建方法:中国, CN104630079A.2015-05-20. Chen H Q, Chen W, Chen Y Q, et al.A Recombinant Mortierella alpina of Linoleic Acid Isomerase Gene was Overexpressed and Its Construction Methods:China, CN104630079A.2015-05-20. |
| [11] | 张志国, 李东屏, 方芳. 丝状真菌原生质体技术研究. 湖南师范大学自然科学学报 , 1994, 17 (l) : 41–48. Zhang Z G, Li D P, Fang F. Studies on protoplasts technology of filamentous fungi. Journal of Science of Human Normal University , 1994, 17 (l) : 41–48. |
| [12] | 张长杰, 凌雪萍, 曾思钰, 等. 高山被孢霉原生质体转化及延长酶基因同源表达的研究. 厦门大学学报(自然科学版) , 2012, 51 (5) : 911–917. Zhang C J, Ling X P, Zeng S Y, et al. Study on protoplast transformation of Mortierella alpina and its homologous expression of elongase gene. Journal of Xiamen University (Natural Science) , 2012, 51 (5) : 911–917. |
| [13] | Te'O V S J, Bergquist P L, Nevalainen K M H. Biolistic transformation of trichoderma reesei using the bio-rad seven barrels hepta adaptor system. Journal of Microbiological Methods , 2002, 51 (3) : 393–399. DOI:10.1016/S0167-7012(02)00126-4 |
| [14] | Takeno S, Sakuradani E, Tomi A, et al. Transformation of oil-producing fungus, Mortierella alpina lS-4, using Zeocin, and application to arachidonic acid production. Journal of Fermentation Technology , 2005, 100 (6) : 617–622. |
| [15] | Ando A, Sakuradani E, Horinaka K, et al. Transformation of an oleaginous zygomycete Mortierella alpina 1S-4 with the carboxin resistance gene conferred by mutation of the iron-sulfur subunit of succinate dehydrogenase. Current Genetics , 2009, 55 (3) : 349–356. DOI:10.1007/s00294-009-0250-1 |
| [16] | Kikukawa H, Sakuradani E, Nakatani M, et al. Gene targeting in the oil-producing fungus Mortierella alpina 1S-4 and construction of a strain producing a valuable polyunsaturated fatty acid. Current Genetics , 2015, 61 (4) : 579–589. DOI:10.1007/s00294-015-0481-2 |
| [17] | Takeno T, Sakuradani E, Murata S, et al. Cloning and sequencing of the ura3 and ura5 genes, and isolation and characterization of uracil auxotrophs of the fungus Mortierella alpina 1S-4. Bioscience Biotechnollogy and Biochemistry , 2004, 68 (2) : 277–285. DOI:10.1271/bbb.68.277 |
| [18] | Takeno S, Sakuradani E, Tomi A, et al. Improvement of the fatty acid composition of an oil-producing filamentous fungus, Mortierella alpina 1S-4, through RNA interference with delta 12-desaturase gene expression. Applied and Environmental Microbiology , 2005, 71 (9) : 5124–5128. DOI:10.1128/AEM.71.9.5124-5128.2005 |
| [19] | Kikukawa H, Sakuradani E, Ando A, et al. Disruption of lig4 improves gene targeting efficiency in the oleaginous fungus Mortierella alpina 1S-4. Chinese Journal of Biotechnology , 2015, 208 : 63–69. DOI:10.1016/j.jbiotec.2015.05.020 |
| [20] | Michielse C B, Hooykaas P J J, Vanden Hondel C A M J J, et al. Agrobacterium-mediated trandformation as tool for functional genomic in fungi. Current Genetics , 2005, 48 (1) : 1–17. DOI:10.1007/s00294-005-0578-0 |
| [21] | Sakuradani E, Hirano Y, Kamada N, et al. Improvement of arachidonic acid production by mutants with lower n-3 desaturation activity derived from Mortierella alpina 1S-4. Applied Microbiology and Biotechnology , 2004, 66 (3) : 243–248. DOI:10.1007/s00253-004-1682-7 |
| [22] | 陈永泉, 陈卫, 郝光飞, 等.一种高山被孢霉重组基因表达系统及其构建方法和应用:中国, CN103571762A.2014-02-12. Chen Y Q, Chen W, Hao G F, et al.Mortierella alpina Recombinant Gene Expression System and Its Construction Methods and Applications:China, CN103571762A.2014-02-12. |
| [23] | Wynn J P, Ratledqe C. Evidence that the rate-limiting step for the biosynthesis of arachidonic acid in Mortierella alpina is at the level of the 18:3 to 20:3 elongase. Microbiology , 2000, 146 (9) : 2325–2331. DOI:10.1099/00221287-146-9-2325 |
| [24] | Ando A, Sumida Y, Negoro H, et al. Establishment of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of an oleaginous fungus, Mortierella alpina 1S-4, and its application for eicosapentaenoic acid producer breeding. Applied and Environmental Microbiology , 2009, 75 (17) : 5529–5535. DOI:10.1128/AEM.00648-09 |
| [25] | Hao G F, Chen H Q, Wang L, et al. Role of malic enzyme during fatty acid synthesis in the oleaginous fungus Mortierella alpina. Applied and Environmental Microbiology , 2014, 80 (9) : 2672–2678. DOI:10.1128/AEM.00140-14 |
| [26] | 陈永泉, 陈卫, 陈海琴, 等.一种过表达ω3脱饱和酶基因的高山被孢霉基因工程菌株及其构建方法:中国, CN103820335A.2014-05-28. Chen K Q, Chen W, Chen H Q, et al.A Mortierella alpina Genetic Engineering Strain Whichω3 Desaturase Gene was Overexpressed and a Construction Method:China, CN103820335A.2014-05-28. |
| [27] | 黄小云. 高山被孢霉中过表达ω3脂肪酸脱饱和酶提高ω-3多不饱和脂肪酸产量的研究. 无锡: 江南大学食品学院, 2014 . Huang X Y. Enhanceω-3 PUFAs Production in Olesginous Fungus Mortierella alpina by Overexpressingω3 Fatty Acid Desaturase. Wuxi: Jiangnan University, School of Science and Technology, 2014 . |
| [28] | 郝丹辉. 高山被孢霉生物合成共轭亚油酸重组菌株的构建及研究. 无锡: 江南大学食品学院, 2015 . Hao D H. roduction of Conjugated Linoleic Acid by Heterologous Expression of Linoleic Acid Isomerase in Oleaginous Fungus Mortierella alpina. Wuxi: Jiangnan University, School of Science and Technology, 2015 . |