目前治疗性抗体在治疗癌症、肿瘤、自身免疫性疾病、慢性炎症、感染性疾病及其他疾病中取得了重大进展，抗体工程的发展进一步推动新型抗体的产生^[1]。截至2015年年底已上市的治疗性抗体药物及其衍生物超过40种^[2]。目前在抗体工程中基于实用性和功能上的考虑，使现在临床上使用的治疗性抗体均为IgG类型^[3-4]。

在开发治疗性抗体时，IgG亚型的选择是基于其体外活性可以推断体内活性的假设。亚型是决定治疗性抗体的体内生物学活性的关键因素之一。然而除亚型外，IgG-Fc糖型、抗原决定簇密度、细胞Fc受体多态性等多个参数也共同影响着治疗性抗体体内功能结果，导致准确预测治疗性抗体的体内活性仍有困难^[5]。因此在抗体药物设计中应把亚型的结构特征与目的效应功能的关联、体外IgG-Fc和效应配体之间相互作用的分子机制、亚基的生物学活性、理化性质等纳入综合考虑，以确保最大的疗效和安全性^[5-6]。

虽然IgG各亚型在体外实验评估中呈现特异的效应功能，然而在不同疾病中各亚型体内的作用方式可能有所不同^[5]。因此在选择治疗性抗体的IgG亚型时一般应首先由所需的效应功能决定^[3]，其次是IgG 4种亚型的生物功能和理化性质，此外还需考虑IgG 4种亚型触发效应功能的能力。因此，在治疗性抗体的开发中为达到期望的治疗效果并且避免不良反应，选择适宜的抗体亚型就显得格外重要^[3-4]。

1 IgG亚型选择的相关因素 1.1 IgG亚型结构特征与功能效应

IgG可根据其在血清中的分布丰度进一步分为IgG1(60%)、IgG2(25%)、IgG3(10%)、IgG4(5%)4种亚型，它们的恒定区序列高度同源^[3]，但是各亚型与抗原结合、免疫复合物的形成、补体激活、触发效应细胞、半衰期和胎盘转运特性均具有特异性^[7]。4种IgG亚型其恒定区的CH2区不同、铰链区的核心CXXC序列组成不同^[7]，重链和轻链之间的二硫键连接方式也不同^[8](表 1)。

在结构与功能效应上IgG1和IgG3与Fc受体的亲和力高于IgG2和IgG4，具有更强的激活抗体依赖的细胞毒性及补体依赖的细胞毒性的能力^{[3-4, 7]}；IgG2和IgG4亚型具有阻碍或抑制的效应功能^[4]。另外，各亚型生物功能也各有侧重，IgG1和IgG3主要结合蛋白质抗原，IgG2结合糖类抗原，IgG4则响应慢性刺激并且具有抗炎的活性^[4]。

Tian等^[9]采用小角X射线散射(small-angle X-ray scattering，SAXS)技术系统的描述了人源化IgG1、IgG2和IgG4抗体溶液的结构、构象和胶体稳定性等性质，填补了传统生物物理学对其描述的空白。结果显示，SAXS分析技术可敏感检测中性pH条件下IgG1、IgG2和IgG4三类亚型之间的结构差异，低pH条件下IgG2和IgG4快速形成二聚体。此外还揭示了在中、低蛋白质浓度条件下IgG1、IgG2和IgG4三类亚型之间亚型特异的分子间斥力变化情况，并解释了IgG1稳定性高、不易聚合的原因。因此在抗体亚型选择中可选择SAXS分析技术进行筛选。

1.2 IgG亚型对治疗性抗体理化性质的影响

抗体的均一性、稳定性、溶解度是特别重要的物理化学性质，有可能会限制治疗性抗体的成功开发。不同IgG亚型对抗体的构象和物理化学稳定性的影响不同。

Ito和Tsumoto^[3]对三类(嵌合、人源化及全人源)4种抗体分子的研究表明：①各类IgG在物理性质和化学降解方面具有明显的差异。②不同抗体亚型的结构稳定性研究显示，每种亚型的Fc区控制该分子的物理化学性质。所有4种抗体分子显示其亚型的结构稳定性趋势相同，即IgG1 > IgG2 > IgG4。各抗体亚型的结构稳定性和在酸性条件下的聚合与CH2区密切相关，与可变区无关。③不同亚型在热胁迫下对抗体结构稳定性的影响不同，说明抗体的物理化学性质与亚型相关，与可变区无关。即使更换其他IgG的可变区，抗体的物理化学性质仍可因此而保全。此研究表明，在开发治疗性抗体时，应合理预测抗体理化性质的变化，选择更合适的亚型。这对于根据不同抗体亚型的理化性质、选择合适的亚型进行抗体设计及进行抗体生产过程都有很大的指导意义^[3]。

此外，Pepinsky等^[10]采用不同IgG亚型(IgG1、IgG2和IgG4)、互补决定区残基的靶向突变及糖基化位点插入突变三种策略对抗LINGO-1单克隆抗体溶解度进行研究，结果表明，①IgG亚型和糖基化程度共同影响抗体的溶解度，以IgG亚型的影响更为显著。②抗体的纯度和聚体状态结果显示，IgG1含有99%的单体，无可溶聚体，而IgG2含有96%的单体、2%的二聚体和2%的多聚体。③分析超速离心(analytical ultracentrifugation, AUC)结果显示，IgG2亚型抗体可通过蛋白质自联形成可溶性二聚体，并且其形成的可溶性二聚体是浓度依赖性的和可逆的。此外，将IgG1亚型抗体更换为IgG2亚型可阻止其形成不可溶的聚体。④热稳定性研究结果显示各亚型之间的差异均不显著，没有达到能影响框架选择或者解释IgG1和IgG2之间显著的溶解度差异的程度。Pepinsky认为，空间因素在其中可能起着重要作用，促进或限制蛋白质互作有可能导致自联。

单克隆抗体的聚合性是影响其稳定性和均一性的关键理化性质。单克隆抗体聚合是一个多步骤的过程，涉及单体蛋白质结构性改变和可溶性或不溶性低聚物的形成。目前的研究还未揭示了决定天然或突变的单克隆抗体聚合性的构象稳定性和动力学结构的因素。Thakkar等^[11]研究考察了不同溶剂中决定IgG1和IgG2单克隆抗体聚合性的构象稳定性和动态区域因素。结果表明，IgG1与IgG2相比具有较好的动态特性、构象稳定性及较高的抗聚合性；此外还揭示局部构象稳定性和改变部分结构的波动会影响IgG聚合性。

1.3 IgG亚型对治疗性抗体生物活性的影响

Beenhouwer等^[12]比较研究了在新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)感染模型中，一种抗葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan，GXM)抗体的所有4种人类同型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的保护能力。实验结果显示，IgG2和IgG4亚型抗GXM延长了已感染的BALB/c小鼠的生存时间，IgG3亚型抗GXM组没有感染动物存活，而使用IgG1亚型抗GXM治疗的小鼠生存时间比使用磷酸盐缓冲盐水或无关同型单克隆抗体处理的还短。提示在本实验中选择IgG2或IgG4亚型是最理想的，而选择IgG1亚型则是不合适的。该研究结果对于设计治疗感染性疾病的治疗性抗体有重大启示。

Varshney等^[13]在小鼠中使用不同抗体亚型对抗体中和葡萄球菌肠毒素B活性的影响进行了研究。研究表明，①不同抗体亚型在体内和体外中和与保护活力相当；②T细胞增殖分析中，不同亚型对葡萄球菌肠毒素B的亲和力和IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)相当；③在小鼠葡萄球菌肠毒素B中毒和S. aureu败血症模型中，IgG2亚型变体展示出比IgG1显著的更高的保护力。其研究结果证明，改变已经具有保护性的单克隆抗体亚型，但不改变其抗原特异性或敏感性，可增强其保护能力。

Lee等^[14]为了解决IgG1框架的TNF-α阻断剂(如etanercept)潜在的效应功能风险，采用TNF受体与一种混合亚型的Fc段融合, 其混合亚型的Fc包括IgG4的CH2和CH3区，以及IgD具有高度灵活性的铰链区。其体外中和活性检测结果比etanercept高约1.5倍，其余各项均与etanercept相似。这种混合亚型的Fc片段解决了IgG1框架的TNF-α阻断剂(如etanercept)潜在的效应功能风险，使其更具有进一步开发为药物的潜力。

Könitzer等^[15]以IgG2或IgG4重链替代IgG1重链重新构建Rituximab，其体外诱导细胞凋亡的能力分别提高5倍和4倍。直接诱导靶细胞死亡或凋亡是抗CD20抗体Rituximab的效应机制之一。研究证明Rituximab诱导靶细胞凋亡的能力与抗体亚型相关，产生这种行为的决定因素是重链的铰链区和CH1区；而促进靶细胞凋亡的关键因素可能是混合的IgG2或IgG4亚型抗体与IgG1亚型Rituximab相比与CD20的结合模式不同。此研究为开发直接提高细胞毒性的治疗性抗体开辟了新的工程路线。

2 IgG各亚型治疗性抗体药物的研发现状

目前已开发上市的治疗性抗体均是以IgG为框架开发的，大部分属于IgG1亚型，也有部分IgG2和IgG4抗体进入市场^[8], 而IgG3亚型因其潜在的免疫原性、相对较短的半衰期(7天，其它亚型为21天)，以及大量的异型多态性^[16]，目前尚未直接用作治疗性抗体的开发^[3-4]，但Nigel等的研究表明，定点突变435 Arg为435 His可延长其半衰期，增加其成药性^[17]。现分别对以IgG1、IgG2和IgG4亚型为框架的治疗性抗体的研发现状进行综述。

2.1 基于IgG1亚型的抗体药物开发

在人IgG血清中IgG1亚型的含量最高约为60%，最初由多发性骨髓瘤患者的血清中分离而来，对其结构和功能研究明确，使其在抗体发展中首先被选择和应用^[5]。因此在开发治疗性抗体时，最初选择IgG1亚型似乎是自然的选择。基于IgG1亚型的治疗性抗体是目前应用最广泛的抗体，其主要用于肿瘤、感染和自身免疫性疾病等。但值得注意的是，几乎所有已获许可的或目前正在开发的抗感染的治疗性抗体均为IgG1亚型^[6]。

开发双功能特异性抗体是目前基于IgG1亚型治疗性抗体的新应用。由于IgG1亚型与IgG4亚型高度相似，其与IgG4亚型可发生Fab臂交换相关的铰链区氨基酸序列仅有P228S和K409R两对氨基酸的差别^[18]。目前Aran、Michael等已采用点突变等方法，将IgG4铰链区与Fab臂交换相关位点移植入IgG1亚型，使IgG1抗体具有IgG4亚型抗体的Fab交换能力，可诱导IgG1发生Fab臂交换^[19-21]。突变后的IgG1抗体在特定条件下可形成双特异性抗体，可同时结合两种不同的抗原，具有用于检测和治疗的潜力。

2015年新上市基于IgG1亚型的治疗性抗体有5种(Daratumumab、Mepolizumab、Alirocumab、Dinutuximab、Secukinumab)，此外还有30种基于IgG1亚型的治疗性抗体处于临床试验阶段^[2](表 2)。

2.2 基于IgG2亚型的抗体药物开发

在IgG2中，由于铰链区和轻重链之间形成的二硫键不同可形成不同的异构体，不同异构体与FcRn的结合力相同。同时IgG2亚型抗体较其他亚型具有明显的抗木瓜蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白酶水解的能力，其原因可能是IgG2铰链区较短从而降低了对酶的趋近性^[5]。此外Tishchenko ^[22-23]对IgG2亚型抗体的CH2区的宏观和微观稳定性及其生物学活性进行了相关研究。

同时IgG2抗体容易形成共价二聚体，通过定点突变铰链区半胱氨酸为惰性氨基酸可阻止其二聚化^[5]。近年来对IgG2亚型抗体的稳定性控制方面进行了广泛的研究。例如，Aboel、Sahin等建立了相关模型检测IgG2亚型抗体制剂的构象稳定性和动态聚合^[24-25]，为减少IgG2亚型抗体的降解和提高其制剂的稳定性研究提供了新的思路。

IgG2亚型与复发性细菌感染的易感性相关，在复发性细菌感染中产生的主要是特异性抗细菌细胞壁多糖的抗体，其亚型是IgG2。因此开发此类抗体时可选择IgG2亚型^[12]。此外，IgG2抗体可通过FcγRIIa携带的白细胞裂解细菌从而介导菌群的调理。该功效依赖于FcγRIIa受体的多态性，由受体138位的组氨酸(FcγRIIa-138 h)或精氨酸(FcγRIIa-138 r)决定^[5]。在IgG2抗体与FcγR结合能力和激活经典补体途径的研究方面，相关文献对其保护作用的描述不尽相同。在开发不需要效应功能或效应功能低于IgG1的治疗性抗体时可利用此性质^[5]。

最近White等^[26]认为在癌症的治疗中，与肿瘤坏死因子受体蛋白竞争结合的抗体中，IgG2亚型可能具有天然优势。该研究通过改变特异的抗CD40、CD28或4-1BB(CD137)抗体的可变区形成不同的IgG亚型，研究结果表明，①在诱导B细胞增殖、诱导树突状细胞激活和诱导肿瘤特异性细胞毒性T细胞反应中IgG2亚型优于其它的IgG亚型。②在IgG2亚型中其体内活性不依赖于FcgR，其中起关键作用的是IgG2的铰链和CH1区的一对二硫键。仅将IgG2的铰链和CH1区移植入IgG1亚型就能够将其结合活性转移至IgG1亚型抗体。进一步研究表明，其不依赖FcgR活性的主要组分是IgG2亚型的一种特殊异构体h2B，该异构体与h2A异构体的主要区别在于h2B的结构刚性较强。此外h2A异构体不仅没有活性而且还可阻断h2B同型的竞争活力，可采用蛋白质工程技术阻断h2A异构体的形成，从而获得最佳的体内活性。

2015年新上市的基于IgG2亚型治疗性抗体有1种(Evolocumab)，此外还有8种基于IgG2亚型的治疗性抗体处于临床试验阶段^[2](表 3)。

2.3 基于IgG4亚型的抗体药物开发

IgG4是一种具有两个铰链区半胱氨酸的四聚物(H2L2)，其结构与IgG1相似^{[5, 13]}，但其具有独特的重链交换的特性(又称为Fab臂交换)。它可导致形成单价(半抗体分子)或者进一步形成双特异性抗体^[31]，IgG4半抗体分子是由IgG4的HL二聚物组成的^[16]。在IgG4的Fab臂交换过程中, 核心铰链区残基S228和CH3区的R409对于Fab臂交换是重要位点^[27-30]。

此外，在IgG4中将核心铰链区228位Ser替换为Pro可增强核心铰链区内的二硫键连接^[32]，或将CH3区R409替换为K409可促进IgG4 CH3区结构稳定^{[18, 28, 31]}, 从而阻止IgG4 Fab臂交换，大大减少了半分子抗体的形成。

IgG4具有一些独特的生物学特性^[31]。IgG4对大多数FcγR受体具有较弱的亲和力，并且缺乏激活补体的能力^[27]，在体内IgG4亚型的典型特征是单价有效，可避免形成免疫复合物，因此IgG4可作为阻断抗体，避免触发效应机制^[27]。IgG4亚型的独特性质使其呈现相对"非炎症性"特征，从而更适合用于治疗性抗体的开发^[31]。目前在治疗性抗体工程中，IgG4亚型已用于一些不需要效应功能的治疗性抗体的开发。例如，在自身免疫性疾病治疗领域，同时结合IL-13和IL-4双靶点的"杵臼"结构IgG4双功能抗体已经进入开发阶段^[33]。目前有14种基于IgG4亚型的治疗性抗体处于临床试验阶段^{[2, 34]}，见表 4。

3 结语

综上研究结果表明，在治疗性抗体开发过程中，IgG亚型可影响治疗性抗体的理化性质，还可影响其功能和治疗效果等，因此在治疗性抗体工程中应根据需要进行抗体亚型的选择。4种亚型对不同疾病反应的多样性和其独特的结构和功能效应，凸显了考虑选择亚型属性的重要性。但目前对于IgG亚型选择并没有通用标准，需要更深刻地理解和应用抗体亚型结构与其功能效应的关联、体外IgG-Fc和效应配体之间相互作用的分子机制，以及体外生物学活性和治疗效果之间的关系，模拟所需亚型的特性，并应增加相关实验研究指导最终选择，从而开发出治疗性抗体的全部潜力^{[4, 6, 12]}。