2016, Vol. 36文章信息
- 吉美萍, 庞艳波, 付丽丽, 那日, 郭九峰, 王志永
- JI Mei-ping, PANG Yan-bo, FU Li-li, NA Ri, GUO Jiu-feng, WANG Zhi-yong
- γ-聚谷氨酸基因工程研究进展与展望
- Study Progress and Prospect on γ-poly Glutamic Acid Genetic Engineering
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(6): 107-118
- China Biotechnology, 2016, 36(6): 107-118
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160615
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文章历史
- 收稿日期: 2015-11-30
- 修回日期: 2015-12-15
在经济快速发展和生活水平显著提高的大趋势下，人们的环保意识也越来越强烈。生产环境友好型生物可降解的高分子材料的要求，也随之越来越迫切，γ-聚谷氨酸的生产就应运而生。1937年，Ivanovice等[1]在炭疽杆菌荚膜中首次发现了γ-PGA的存在。Bovarnick[2]于1942在枯草芽孢杆菌中发现了γ-PGA。之后，学者们发现了其他的一些杆菌属微生物也能生产γ-PGA。γ-PGA分子大小不等，由两种谷氨酸单体L-谷氨酸和D-谷氨酸根据不同比例脱水缩合成多肽聚合物γ-PGA。在γ-PGA分子侧链含有活性较高的羧基，因此有很好的保湿和吸水特性，易与一些大分子物质形成稳定新物质。γ-PGA具备良好的生物兼容性、生物可降解性、低免疫原性及无毒无污染性,故广泛用于药物载体、医药粘合剂、土壤、沙地的蓄水保湿膜、食品的水凝胶、防冻剂、金属絮凝剂以及高强度纤维等合成材料[3]。但是，γ-PGA作为一种新型多功能生物大分子量材料，在我国基本上仍处于实验室研究阶段，尚未实现大规模的工业生产，本文就γ-PGA的结构特点、微生物合成、相关基因、诱变处理、合成机理、应用等相关研究进行综述，为在我国实现大规模的工业化大生产提供理论支撑。
1 γ-PGA的结构特点γ-PGA(γ-polyglutamic acid,γ-PGA)是D-或L-谷氨酸按照不同的比例通过α-氨基和γ-羧基间的γ-酰胺键结合而成的高分子阴离子多肽聚合物(图 1)。通过Shimadzi6A凝胶过滤层析法和6A折射指数侦查仪(Asahipak GS-620H)测定的γ-聚谷氨酸分子大小不等，分子量大小在10kDa~10 000kDa之间[4]。γ-PGA具有优越的保湿性、阻氧性、吸水性、可塑性、粘结性、成膜性、成纤维性及生物可降解性等。经测定γ-PGA的pKa=2.23，这与谷氨酸α-羧基的pKa 值相当接近。经过热重法(TGA)和差示扫描量热技术(DSC)分析得知，其熔点为223.5 ℃，热分解温度为235.9 ℃[5]。
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| 图 1 γ-PGA分子结构图 Fig. 1 Molecular structure of γ-PGA |
杨革等[6]研究发现γ-PGA中的α-螺旋和β-折叠的含量较高，它形成的非晶态宏观结构特点是：结合紧密度较低和排列规则性较差的链分子，但排列取向基本上平行于γ-PGA轴。对γ-PGA 动态粘弹性曲线检测，结果显示从低温到高温存在6个损失峰，依次为γ、β2、β1、αH20、α2、α1松弛区域，表明γ-PGA 的无定形区域是较为复杂非均匀结构。γ-PGA 的立体化学结构、离子强度、浓度和溶液pH 决定着其在水溶液中的构象。Borbely等[7]研究了溶剂对γ-PGA构象的影响，结果发现γ-PGA 在不同的溶液中呈现出不同的结构：在水溶液中表现为无规则卷曲的，在甲酸中呈现β-片层结构，但在二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)中又是α-螺旋。Crescenzi等[8]发现B. licheniformis产生的γ-PGA在不同的浓度、离子强度和pH中均呈现不同的结构：低浓度呈现出α-螺旋构型，高浓度呈现β-片层结构；低离子强度下是α-螺旋和β-片层结构，高离子强度下主要以β-片层结构为主；低pH值下呈现出α-螺旋构型，中性偏碱性时呈现β-片层结构，高pH值下呈现出伸展状。可见γ-PGA的结构与其所处的状态，离子强度、浓度和溶液的pH有关。Goto等[9]探究了γ-PGA在不同温度(80、100和120℃)水溶液中的水解模型，发现在这3种温度下，γ-PGA平均分子量的倒数与水解时间表现为线性相关。这说明，通过加热的方式可使γ-PGA多肽链随机断裂。
2 合成γ-PGA的微生物γ-PGA的首次发现是在1937年，Ivanovice等[1]在炭疽杆菌(Bacillus anthracis)荚膜中发现了γ-PGA的存在，以保护菌体免受外界不利环境的破坏。Bovarnick[2]于1942年在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中发现了γ-PGA，之后在纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)和地衣芽孢杆菌(Bacillus lichemiformis)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、耐热芽孢杆菌(B.thermotolerant)和解淀粉芽孢杆菌(B.anmloliquefaciens)中也发现了γ-聚谷氨酸[10]，这些合成的γ-聚谷氨酸可分泌到细胞膜外，即为分泌型γ-聚谷氨酸，这种γ-聚谷氨酸可以更好地提取和纯化。除芽孢杆菌外一些其它古细菌[11]在特定环境下也可以合成γ-PGA，如嗜盐球菌(Planococcus halophilus)、盐藻芽孢八叠球菌(Sporosarcina halophila)、亚洲嗜盐碱杆菌(Natrialba asiatica)、盐碱球菌(Natronococcus occultus)用来降低菌体周围环境的盐浓度，改善生存环境。以及在1990年Weber等[12]发现了唯一一种可合成γ-PGA的真核生物是腔肠动物(Cnidaria)。21世纪以来，学者对筛选可高效合成γ-PGA的微生物的关注越来越多。Kocianova等[13]2005年发现表皮葡萄球菌(Saphylococcus epidermidis)也能合成γ-PGA，并结合在细胞壁上，可对菌体起到一定的保护作用。
目前，合成γ-PGA的细菌主要分为两类[14]，其一为谷氨酸依赖型，即菌株需要从外界另外添加L-谷氨酸才能合成γ-PGA，自身却不合成作为原料的谷氨酸，如：炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、Bacillus subtilis RKY3[15]、Bacillus subtilis MR-141[16]、Bacillus subtilis IFO3335[17]、Bacillus subtilis F-2-01[18]、B.licheniformis ATCC-9945A[19, 20]、B.subtilis (chungkookjang) [21]、B. licheniformis WBL-3[22]、B.licheniformis P-104[23]等；另一类为非谷氨酸依赖性，即在合成γ-PGA过程中不需要加入或者仅需要加入少量谷氨酸作为原料，如：Bacillus subtilis TAM-4[24]、licheniformis A35[25]和B. licheniformis S173[26]、B. subtilis 5E[27] 等[28]。后者在合成γ-PGA时，在培养基中不需要添加大量的谷氨酸，但其生产的菌种较少且合成的量较低，而谷氨酸依赖性细菌单位体积内合成γ-聚谷氨酸的质量明显高于非谷氨酸依赖性细菌，所以对谷氨酸依赖性细菌的研究要多，但是非谷氨酸依赖性细菌不需要谷氨酸作为合成原料，可以降低生产成本，所以也有一部分人在研究。本实验组采用的是谷氨酸依赖型菌-纳豆芽孢杆菌20646。
3 γ-PGA的生物合成合成酶体系Ashiuchi等[29]将枯草芽孢杆菌细胞膜打破后，对细胞中的相关成分进行研究，发现合成γ-PGA过程有3种关键酶起作用，即Pgs B、Pgs C、Pgs A，且只有细胞膜就可以成功合成γ-PGA，说明γ-PGA的合成酶在细胞膜上。其中Pgs B是γ-酰胺连接酶，生成γ-聚谷氨酸的重要酶，Pgs B的一端是由高疏水基团形成的，证明这一端与细胞膜结合，剩余部分在细胞质中；Pgs C上全是高疏水基团，证明Pgs C全部都在细胞膜中，该酶的功能目前尚不清楚；γ-PGA由Pgs A运输到细胞外，Pgs A有部分是高疏水基团，有多处与细胞膜结合。并通过转录和翻译系统在体外合成出酶系的蛋白Pgs B、Pgs C、Pgs A及蛋白的组合，同时对酶系的稳定性及ATP活性进行研究，发现Pgs B和Pgs C的结合十分紧密，而PgsBC和PgsA的结合相对比较松散。推测Pgs B是第一个被发现的γ-酰胺连接酶，具有谷氨酸依赖性的ATP水解酶特性，是生成γ-聚谷氨酸的重要酶。
1997年Eveland等[30]对蛋白CapB/PgsB进行序列分析，发现其拥有一段氨基酸序列与ATP酶序列的相似度很高，并推测其可能拥有ATP酶活性和ATP结合位点。2002年Urushibata等[31]报道了在PgsB蛋白的两种形式(33kDa和44kDa)同时存在时，能单独催化γ-PGA的聚合，且该酶十分稳定，在一定程度上能抵御变性剂的胁迫。在2003年Ashiuchi等[32]验证了Urushibata的方法，但最终结果并未发现γ-PGA。这说明PgsB到底是否具有ATP酶活性，需要学者不断地研究。但是他们均报道了PgsB和PgsC的混合物具有ATP酶活性，进而推测蛋白PgsB和PgsC通过形成复合物来催化γ-PGA的合成，且仅当3个蛋白PgsB、PgsC和PgsA共存时，聚合酶表现的活性最高。γ-PGA在胞内合成后转运到胞外。Pgs B的一端的一小段是由高疏水基团形成的，证明这一端与细胞膜结合，剩余部分在细胞质中；Pgs C上全是高疏水基团，证明Pgs C可能全部都在细胞膜中，该酶的功能目前尚不清楚；γ-聚谷氨酸可能是由Pgs A运输到细胞外，因为Pgs A有3部分是高疏水基团，可能有多处与细胞膜结合。
2012年姚文娟等[33]根据Genbank中B.subtilis IFO3336的PgsBCA序列(Accession number：AB016245.1)，利用多种生物信息学软件对这三种酶组分的蛋白质结构进行了分析，同时也利用ProtParam、TopPred、PredictProtein、PSORT-B Prediction、SWISS-MODEL等软件分别分析了蛋白质氨基酸的理化性质、跨膜区结构、蛋白质二级结构、亚细胞定位、蛋白质三维结构。结果显示：PgsB较低的pI值，携带较多的酸性氨基酸，不稳定系数大于40，属不稳定蛋白，但其疏水性系数为负数，又属亲水蛋白，所以PgsB是亲水不稳定蛋白；PgsC的不稳定系数小于40，疏水系数为正值，属疏水稳定蛋白；PgsA的不稳定系数小于40，疏水系数为负值，属亲水稳定蛋白。通过豆蔻酰锚钩锚定确定PgsB位于质膜上，催化作用需与ATP结合提供能量；PgsB是通过将4个跨膜区与多个豆蔻酰锚钩定位于质膜，具有酰胺化位点；PgsA是通过N端一个跨膜区和豆蔻酰锚钩结合于质膜，具有多种磷酸化位点。这说明γ-PGA合成酶系的3个组分蛋白形成复合物存在于质膜上，其中PgsB在胞内催化γ-PGA合成，PgsC固定于质膜，连接PgsB和PgsA组分，PgsA在胞外负责γ-PGA的运输。通过对γ-PGA合成酶系各组分蛋白结构的分析，为日后在谷氨酸高产菌株中的表达奠定了基础(图 2)。
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| 图 2 γ-PGA的合成途径及调控示意图 Fig. 2 Biosynthesis and regulation of γ-PGA |
此外，2002年Mailer等[34]在B.subtilis中发现了高浓度磷酸化的DegU能活化基因pgsB、pgsC、pgsA的转录。2005年Stanley等[35]报道了在B. subtilis中，调控蛋白ComP-ComA、DegS-DegU、GegQ和SwrA对γ-PGA的合成是必需的。其中ComP-ComA蛋白和DegS-DegU 蛋白调控基因degQ，调节DegQ 的转录，影响γ-PGA 合成酶的合成，间接影响pgsB、pgsC和pgsA的转录。SwrA 主要是作用于pgsB、pgsC和pgsA的转录后调控，即主要调控γ-PGA合成酶的活性。2009年Kimura等[36]发现在pgsB 上游的非编码区。
4 γ-PGA合成机理的研究γ-PGA的合成菌株分为谷氨酸依赖型和非谷氨酸依赖型，故而其对合成γ-PGA的底物需求不同。若菌株通过其他物质自身合成γ-PGA底物的碳骨架，就称其为内源底物。若菌株通过直接添加L-或D-谷氨酸来合成γ-PGA底物的碳骨架，就称其为外源底物。
对于內源底物合成γ-PGA最广泛的途径是葡萄糖经糖酵解，生成丙酮酸，进入TCA循环，通过α-酮戊二酸转化成谷氨酸。对于外源底物来说，一般添加较多的是L-谷氨酸，由D-氨基酸转移酶参与的间接途径实现L-谷氨酸转化为D-谷氨酸。1998年Ashiuchi等[37]在Bacillus subtilis IFO3336中分离出了谷氨酸消旋酶，为γ-PGA合成中D-谷氨酸的来源提供了理论依据。
2006年吴群等[38]报道了，在B. subtilis NX-2合成γ-PGA 过程中，谷氨酸消旋酶参与了L-到D-谷氨酸的转化，且是通过改变谷氨酸消旋酶的活性来调节产物γ-PGA 的立体组成的。
20世纪70年代，Troy等[39]最初在一株以D-谷氨酸为合成底物的B.licheniformis中，推测出γ-PGA的合成机制。其合成机制为：ATP 激活 L-谷氨酸，自身脱去ppi形成AMP，与谷氨酸在γ位结合，形成谷氨酰-γ-AMP；该复合物再与一种带-SH的酶或受体(如一些硫脂X)异构化为谷氨酰-X，连接到γ-PGA片段上，并脱去X，完成γ-PGA片段的延伸。
然而，2001年Ashiuchi等[40]在一株Bacillus subtilis中，不但分离到了细胞膜成分，而且发现在ATP和D-谷氨酸存在下，可体外合成γ-PGA。但发现该菌在合成γ-PGA时，ATP水解后的产物是ADP，而非AMP。所以他们根据capB基因的表达蛋白CapB属氨基连接酶，提出了另一条聚合机制：首先，ATP水解酶将ATP水解为ADP和Pi，接着磷酸基团结合到小分子γ-PGA的C末端形成复合物，再由D-或者L-谷氨酸的氨基端与之发生亲核攻击，生成 Pi，在γ-PGA合成酶的作用下，延伸γ-PGA链。但是，在微生物合成γ-PGA时，D-谷氨酸依赖型的ATP酶活性要比L-谷氨酸依赖型的ATP酶活性高，这似乎与合成酶系对底物的偏好性有关，使得γ-PGA中的D-谷氨酸单体比例偏高。但此机制仍需进一步的研究证明，如小分子γ-PGA是否作为引物分子，小分子γ-PGA究竟多大以及发生亲核攻击的具体位置等。
5 γ-PGA生物合成的相关基因工程根据微生物合成的γ-PGA的状态分为结合型和游离型，从而把γ-PGA合成酶基因分为两种，即cap系(Capsule)和pgs(Polygluamate Synthase)系[41]。如果菌种合成的γ-PGA结合在菌体的细胞壁上，作为荚膜的结构组成部分，即结合型的，就将γ-PGA合成酶基因称为cap系基因，其代表菌株为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；如果合成的γ-PGA游离到菌落外的生存环境中，就将其基因称为pgs系基因，其代表基因为枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)。
5.1 cap系菌株的相关基因cap系菌株合成γ-PGA的最主要基因为capB、capC、capA和capE[42]；炭疽芽孢杆菌合成的γ-PGA是荚膜毒性的主要成分之一，在这种病原菌体内存在2个质粒。1989年，Makino等[43]通过基因互补技术，首次鉴定了在质粒POX2上存在着成簇状排列分布的capB、capC、capA的3个顺反子(图 3a)。这3个基因对恢复突变菌株(消除了的炭疽芽孢杆菌)的荚膜至关重要、缺一不可，并推断了γ-聚D-谷氨酸合成体系是一种多酶体系。这也是关于γ-聚D-谷氨酸合成的首次报道。他们对capBCA这3个蛋白的氨基酸序列分析、定位及对理化处理的敏感性推测出这些酶属于膜交联酶。之后Unrushibata等[44]将 capBCA基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)胞内表达，发现了一个能编码2个蛋白 CapB和CapB′的重叠基因capB，且CapBCA 酶是以膜结合蛋白的形式存在的。在 capBCA 基因簇下游还发现了一个能编码γ-聚D-谷氨酸解聚酶的基因 dep，它是在菌株处于饥饿的情况下，通过启动该基因的表达来降解PGA为菌体提供生长所需氮源。
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| 图 3 参与γ-PGA合成相关的基因 Fig. 3 Related genes in the synthesis of γ-PGA |
Hara 等[45]认为枯草芽孢杆菌的聚谷氨酸合成基因位于质粒上，其编码的γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl-transpeptidase,GGT)与已提取到的或已知的GGT均无序列相似性。Nagai等[46]发现消除质粒后，γ-PGA的合成并不受影响，并且将此质粒转入γ-PGA非合成菌枯草芽孢杆菌168中，发现重组后的菌株仍无合成能力。因此，枯草芽孢杆菌的质粒并不编码γ-PGA的合成基因。
1999年Ashiuchi 等[47]从Bacillus subtilis IFO3336 的Gene Library中，筛选出编码γ-PGA合成酶复合体的克隆，它的表达可促使胞外合成分子量更高的γ-PGA；这个基因簇包含3个基因: pgsB、pgsC 和 pgsA(或称为ywsB、ywtC、ywtA)。研究表明，Bacillus subtilis IFO3336与Bacillus anthracis capBCA 基因同源性很高，分别为66%、77%和 50%。同时他们也分别将含有 pgsB、pgsC、pgsA、pgsBC、pgsBA、pgsCA 和 pgsBCA 等不同基因组合的质粒转入大肠杆菌中，发现只有植入完整的基因组pgsBCA才能合成γ-PGA。先利用Bacillus subtilis ISW1214构建出pgsBCA基因缺陷株MA41，再将携带pgsBCA各基因的质粒导入缺陷株MA41中，构成重组菌株，最后有木糖基因有表达。结果表明，只有完整载入pgsBCA基因的缺陷株M41才能合成γ-PGA，去除其中任一基因都不能合成。这更加充分证明，pgsB、pgsC、pgsA基因对γ-PGA的合成是必需的。在簇状pgsBCA基因下游存在 ywtC 基因，但其功能未知，可能是编码γ-聚谷氨酸解聚酶PgdS(或称为ywtD)的先导小蛋白。2001年Achiuchi等[48]通过基因敲除来破坏枯草芽孢杆菌chungkookjang的pgsBCA 基因,发现突变菌体不再合成 γ-PGA，推测出pgsBCA 系统是唯一的γ-PGA合成体系。
近来，Xu等[49]在Bacillus subtilis IFO16449中克隆出一个新基因，称为ywtD，可编码一种降解γ-PGA的酶。DNA序列分析后，确定出其位于基因ywsC和基因ywtABC的下游，同时也证明了该基因序列与编码DL-内肽酶的基因序列部分相同。经纯化后，DL-内肽酶可将γ-PGA降解为两种分子量不等的产物：高分子质量产物(490kDa，完全由L-谷氨酸构成)和低分子质量产物(11kDa，其中D-谷氨酸与L-谷氨酸的比为80∶20)。所以，ywsC、ywtABC、ywtD共同构成控制γ-PGA生物合成的一个操纵子(图 3b)。Uruchibata等[50]在Bacillus subtilis IFO16449中获得包含有4 个开放阅读框的 4.2 kb 片段。 Northern的 杂交实验显示它们协同构成了合成γ-PGA的一个操纵子，其中γ-PGA合成所必要基因是ywsC (pgsB)、ywtA(pgsC)和 ywtB (pgsA)；Western 杂交实验发现了，由同向重叠基因ywsC编码的蛋白YwsC ，该蛋白是由 44 kDa 的 YwsC 和33 kDa的YwsC′两部分组成的，但目前两蛋白的具体功能尚不清楚。
21世纪以来，我国学者对γ-PGA合成酶基因也有许多报道，如石峰等[51]通过Bacillus subtilis ZJU-7的基因组扩增，得到合了成γ-PGA的合成酶基因pgsBCA，将pTrc99A 作为载体转入coli JM109 体内，构建出重组的工程coli JM109，经验证重组菌株能够合成γ-PGA。在菌体内γ-PGA 合成酶的操纵子受不同启动子控制，使得有些枯草芽孢杆菌不能合成 γ-PGA，如Bacillus subtilis168，虽然拥有pgsBCA 这 3 个基因，但其转录水平太低。而马婕等[52]先从Bacillus subtilis168 基因组中获得合成γ-PGA的3 个基因ywsC、ywtA 和ywtB，用连接酶连接后，导入到 pTrcHisA 中，再用电转入转录水平较高的Coli TOP10 和Coli BL21(DE3)体内进行表达，结果显示宿主菌均具备了γ-PGA的合成能力。2008年金映红等[53]利用pXMJ19质粒将B.licheniformis NK-03deγ-PGA合成酶基因pgsBCA克隆到Escherchia coli JM109中，使其成功表达合成了平均分子量为42433、产量为0.51g/L和分散度为1.77的γ-PGA。并将B.licheniformis NK-03与现已报道的基因pgsBCA编码的氨基酸序列的同源性进行对比，发现在基因簇中，pgsC基因编码的氨基酸序列最为保守。曹铭峰等[54]从非谷氨酸依赖型菌株解淀粉芽孢杆菌LL3中，克隆出合成γ-PGA的基因pgsBCA，通过与谷氨酸依赖型菌株Bacillus subtilis IFO3336的pgsBCA的基因序列进行对比，发现这3个基因的相似性很高，分别为81.39%、83.33%、73.8%。
6 高产菌株的诱变提高菌株的生产能力是聚谷氨酸生产的重要前提，诱发变异技术是指运用物理(紫外诱变、射线诱变、电场诱变)、化学(亚硝基胍诱变)和其他手段作用到菌体上，促使其在短时间内产生大量的突变体，再从中人为地挑选出能稳定遗传的高产突变株，进而给大规模的工业生产和商业制造提供支撑。
冯志彬等[55]对γ-PGA的生产菌株B.sutbilis yt102分别进行了在照射距离不变时通过改变功率和照射时间的紫外(UV)诱变和亚硝基胍(NTC)诱变处理，结果发现先以发功率15W、照射距离30cm的紫外线对原菌作用60s后，可获得菌株U-1，接着对该菌株以质量分数为0.02%的NTG进行诱变处理，最终获得高产菌株NTG -4，γ-PGA产量可达20.7 g/L，较初始菌株产量提高了约3.6倍，且连续传代10代生产性状不衰退，具有较高的遗传稳定性。
索晨等[56]对一株产γ-聚谷氨酸的Bacillus licheniformis CICC10099进行了不同计量的γ射线诱变处理，结果表明：不同剂量γ射线对Bacillus licheniformis CICC10099均有致死作用，且致死率与辐射剂量呈正相关，即致死率随着辐射剂量的增大而增大，如：当剂量为50 Gy(或J/Kg)时，细胞致死率可达63.12 %，当剂量增加为300 Gy 时，致死率基本上接近100 %。实验发现利用γ射线来诱变菌株是有效的，且当辐射剂量(nnegliang)为200 Gy(J/Kg)和300 Gy(J/Kg)时，诱变菌株的正突变率较高，尤其是当剂量是200 Gy 时，正突变率高达13.3 %。经γ射线诱变后可分离筛选到一株高产突变菌株Bacillus licheniformis S16，摇瓶实验表明γ-PGA的含量达到16.9 g/L，较出发菌株Bacillus licheniformis CICC10099产量提高了72.4 %，且经过多次传代后，该菌株仍具有稳定的遗传性状。
陈咏竹等[57]对产量仅为4.582g/L的γ-PAG生产菌株B.licheniformis ATCC9945A实施了三组紫外线(UV)-亚硝基胍(NTG)复合诱变。诱变后，将这三组的所有菌株混合，采用“复杂系统定向调控技术”确定最优发酵条件，利用平板分离法高效而准确地筛选出目标高产突变株Zγ-29，结果发现目标菌株的γ-PAG产量高达18.99g/L，是出发菌株的4.14倍。且该诱变经过多次传代后仍可稳定遗传。
张姝等[58]通过紫外(UV)-硫酸二乙酯(DES)复合诱变得到了高产菌株B.natto S003-D16,γ-PGA的产量较初始菌提高了40.38%。杜沛等[59]采用UV-DES-NTG三因素的多组复合诱变技术获得了高产γ-PGA菌株Bacillus subtilis HD-F9较原始菌株产量提高了56.3%。李楠等[60]通过紫外诱变得到菌株S004-50-01，其产量由4.25g/L提升到10.0g/L，提高了135.3%。疏秀林等[61]通过NTG-UV复合诱变，得到了菌株B.licheniformis PGA-N,其产量较初始菌株提高了30.65%。本实验组采用的是针板电晕电场对γ-PAG生产菌株Bacillus natto20646进行诱变，结果显示诱变后高产菌γ-PGA产量为21.2g/L，初始菌产量为2.6g/L。γ-聚谷氨酸产量变为原来的8倍。高产菌株经过多次传代培养后，γ-PGA的产量稳定，说明这个性状可遗传变异。通过诱变以期获得可实现工业大规模生产的方法和菌株，降低生产成本。
7 γ-PGA的生产方法迄今为止，常见的γ-PGA生产方法有：化学合成法(传统的肽合成法和二聚体缩聚法)、酶转化法、微生物发酵法等。
7.1 化学合成法聚谷氨酸由谷氨酸单体聚合形成，可能应用传统的肽合成法来得到聚谷氨酸，这种方法是将单个氨基酸或者几个氨基酸片段链接到一块得到我们所需长度和结构的聚合物，由基团保护、活化、偶联和脱保护等几个步骤组成化学合成过程。肽合成法得到的是α-PGA，而非γ-PGA[62]。
另一种合成办法为二聚体缩聚法，这种办法分为三步。第一步：D-谷氨酸和L-谷氨酸和它们的消旋体反应生成谷氨酸二聚体；第二步：谷氨酸凝聚体通过浓缩剂的浓缩和凝聚得到聚谷氨酸甲基酯，这种物质的产率是44％~91％；第三步：将聚谷氨酸甲基酯碱化水解得到所需的γ-PGA[63]。
化学合成γ-PGA操作困难，步骤繁琐，难度大，成本高、产率低，纯度低，产品分子量小，而且α-PGA降解速度缓慢，难以大规模生产，不适宜于医药和食品领域的应用。 7.2 酶转化法酶转化法通常是经过一步酶促反应，可将底物自动转化成所需产物，避免了全部合成途径中复杂的反馈调节作用[64]。谷氨酸单体在谷氨酸转肽酶(GTP)的作用下，会自动转化成我们所需的γ-PGA。其中固定化酶技术在实际应用中具有极大的商业价值，其优点是酶的稳定性高、对温度和pH的适应范围较大、反应条件易于控制、可回收重复使用提高产物质量、在实际中，可实现批量或连续操作来进行产业化、连续化、自动化生产，其存在的局限是反应过程中酶活力有所损失，一般只适于小分子底物，对于大分子底物基本无法进行反应，也不适于多酶反应体系的进行[65] 。酶转化法周期短，合成方法简单，生产成本低，可以用于大规模的工业生产。但酶转化法只能生产小分子量γ-PGA，从而制约了酶转化法在实际生产中生产高分子聚合物γ-PGA的应用。
7.3 微生物发酵法微生物发酵法主要是指对微生物菌体进行摇瓶发酵后，对发酵液进行分离提纯，提取出γ-PGA的方法，归纳起来主要分为分批发酵法、连续发酵法、液体两相发酵法、搅拌罐反应器自循环发酵法、固体发酵法等。
液体发酵的主要优点是:培养条件温和、生产过程容易控制、生产周期较短、γ-PGA产量高且分子量高、提取率高、环境友好等优点，仍是目前最具工业化前景的生产方法，日本味之素株式会社及台湾味丹企业已经进入商业化试生产阶段，但存在的问题是微生物的γ-PGA合成代谢途径较为复杂，发酵黏度较高，从而导致γ-PGA的分离纯化困难，且目前现有菌种γ-PGA的产率较低等[66]。
固体发酵是一种传统的发酵技术，在中国应用较多的产业有：白酒的酿制、酱油的生产。可也用于酶制剂、抗生素、有机酸等方面的生产[67]。通过固体发酵来生产γ-聚谷氨酸，有它自身的优缺点。固体发酵的原料相对于液体发酵的原料来说价格便宜，但是在固体发酵培养基中没有水，使得微生物和培养基不能充分混合，营养物质存在梯度，不能被微生物充分利用，导致菌体生长和γ-聚谷氨酸发酵分泌不均匀。整个固体发酵流程不能很好地测量，发酵流程在可控范围之外。大规模生产时能耗较大。
8 γ-PGA的应用γ-PGA分子上有很多羧基，它们有强吸水性和保湿性，且γ-PGA可以和大分子物质形成稳定结合物，同时可生物降解等优点，故而被应用于诸多领域，如药物控释载体、基因载体、植入材料、纳米创伤敷科、食品加工、水凝剂、保湿剂、保鲜剂、防冻剂、增稠剂、化妆品、烟草、皮革等。
在医药领域里，γ-PGA可作为药物载体和医用粘合剂，以实现控释和靶向作用，增加药品的水溶性，提升药品的利用率。如，γ-聚谷氨酸紫杉醇PG-TXL(CT-2103)[68]、二氯二氨铂(Cis-DichLorDiamminepLatinum，CDDP)[69]、聚谷氨酸十四烷基三甲基溴化铵PGA-MTAB、聚谷氨酸十八烷基三甲基溴化铵PGA-STAB[70]等。叶海峰将[71]γ-PGA与顺铂(Cis-Dichlordiammineplatinun，CDDP)巧妙结合形成顺铂衍生物，作为治疗肿瘤的药品，对DNA造成伤害，抑制DNA正常的复制和转录，是目前应用较广泛的化疗方法。克服了CDDP在水中溶解度低、在水中不稳定、毒性较强的缺点。γ-PGA与壳聚糖形成的复合纳米微粒具有极强的亲和力，可作为抗生药物阿莫西林的有效载体，与N-三甲基壳聚糖经自组装得到的复合纳米颗粒可作为口服胰岛素的药物载体。聚谷氨酸-苯丙氨酸形成的纳米微粒γ-PGA-Phe NPs可高效承载多肽，也可作为临床上肝癌的疫苗载体[72]。
在食品及保健品上，γ-PGA具有食品安全性，可作为膳食纤维、保健食品、食品增稠剂、保鲜剂安定剂。分子量在100 000以下的γ-PGA具有良好的防冻性能，优于常用的一些防冻剂[73]。在淀粉制品中加入γ-PGA除改善口感外还能防止淀粉老化，保持结构进而保持食品形状。冰激凌中加入γ-PGA的目的是使冰激凌更稳定，更好地塑造形状。γ-PGA与Ca2+螯合形成的γ-聚谷氨酸钙可作为一种新型的补钙剂，具有不依赖于胃酸的缓释能力，在温和(中性)和不温和(酸性)的条件下均能缓慢释放，提高体内的吸收，预防骨质疏松症[74]。张绪英等[75]以γ-PGA为载体，螯合金属锰离子，制成了γ-PGA-Mn，是一种新型自由基清除剂，不仅具有清除自由基的能力，也可通过控制释放速率来避免因锰离子过量而引起的神经中毒等副作用。
在农业中，经研究发现，将种子放在γ-PGA制成的树脂中，播种在干旱缺水地区，可明显提高小麦和黑麦草的发芽率[76]。对农作物进行施肥和驱虫时加入一定量的γ-聚谷氨酸盐可以延长肥料和药物的作用时间，从而使肥料和药物的作用效果得到提升[77]。
在环保方面，可广泛用于食品包装中一次性餐具(快餐盒)和塑料袋，在自然界中可快速降解，不会造成环境污染[78]。也可作为凝絮剂能有效降低电镀废水中重金属离子的浓度，使废液达到排放标准。王德生等[79]将γ-PGA与化学凝絮剂PAM、PAC对比得知，γ-PGA对高浓度工业废水(含有溶解性的有机物)的处理效果不是很明显，但对低浓度的废水及河水的处理效果较好。
在化妆品中添加γ-PGA可促使整个化妆品体现强大的保湿性，起到改善干性肌肤问题，去除角质、缓解皱纹和美白皮肤的效果[80]。γ-PGA同时还是一种护发素，可修复头发表层损伤的毛鳞片，起到保护头发的作用。在尿布及其他类似产品中加入γ-PGA，会使其吸水性比传统产品提高2~3倍之多[81]。
9 展 望γ-PGA具有水溶性好、保湿性好、吸水性好、无毒无害、可生物降解以及可食用等优点，有着潜在和广阔的发展前景及巨大的开发潜力，而目前合成γ-PGA主要依赖于微生物发酵，但是原始菌株合成的产量相对较低，导致产品生产成本高，这是需要解决的关键问题，如何降低生产成本、控制产物结构和提高γ-PGA产量等已有很多尝试，在传统层面上，可通过物理、化学诱变技术、对培养基条件进行优化，以便寻找到廉价的碳源、氮源、味精废液等培养基成分；在分子层面上，可进行染色体融合、基因同源重组，合成酶表面修饰、提高关键酶活性、增加正向调控蛋白的浓度、敲除γ-PGA的降解基因等，使其发生高产的可遗传的稳定变异，再结合基因和蛋白组数据库、应用相关软件进行计算机分析，模拟基因表达和酶系催化等，实现体外控制γ-PGA的合成，从而降低生产成本，扩大生产，提高科研与应用价值。
物理诱变具有诱变率高，负作用小，环境友好的特点，本实验室通过针板电晕电场对纳豆芽孢杆菌进行诱变处理后获得了高产菌株，其产量为21.2g/L，较初始菌的2.6g/L产量提高了8倍之多，并经过多次传代培养后，高产性状可稳定遗传，足以证明这一诱变技术的先进性，这一方法可为我国实现γ-PGA工业化生产降低生产成本提供理论和实践依据。稀土元素是内蒙古的一大优势资源，前人在动植物生产上已有有效应用的先例，我们通过添加稀土元素镧、铈、铕和铽对高产菌株进行培养，发现菌株在固体培养基上菌落形态发生较大的改变，如直径较小为(1±0.2)cm，较未加前直径减小，边缘较为整齐，且产量也稍有提高，经多次传代后，性状可稳定遗传，其它方面的研究正在进行中。展望未来，随着人们环保意识的不断加强，对γ-PGA的需求将不断提高，通过各种措施提高γ-PGA产量，降低成本是实现绿色发展所必须达到的目标。
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