学术研究和临床应用中所使用的干细胞主要有胚胎干细胞、脐带血来源干细胞、成体干细胞和生物工程干细胞。生物工程干细胞是在体外对已分化的体细胞经体细胞核移植技术、诱导多能干细胞技术等方法获得的具有全能干性或多能性的一类细胞。其中诱导多能干细胞技术自发现以来一直是组织工程和再生医学领域的研究热点。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSCs)是类似胚胎干细胞的一种细胞类型，可以通过对已分化的体细胞进行诱导重编程获得，具有自我更新能力和多潜能性。通过跟踪ApoBEC1-Nat1-Fbx15基因的顺次研究，培养抗 G418的细胞克隆筛选有效的胚胎干细胞维持因子^[1]，2006年，山中伸弥(Takahshi)小组^[2]首次使用逆转录病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因(OSKM)转入小鼠成纤维细胞中，使其重编程为具有胚胎干细胞特性的多能性细胞，开创了iPS技术的新纪元。2009年，高绍荣课题组^[3]利用四倍体囊胚注射得到了完全iPSCs来源的四倍体互补小鼠，验证了iPSCs确实和ESCs具有类似的多能性。iPS技术不使用卵细胞和胚胎，打破了必须使用核移植技术或胚胎物质才能使细胞命运逆转的传统认知，操作较简单，具有重复性，且避免了相关的伦理和法律问题，是细胞重编程领域的重大突破。本文将对近几年诱导多能干细胞重编程方法优化方面取得的的新进展进行综述，重点阐述减少变异降低致瘤性和提高重编程转化率的几种方法及iPS的应用前景。

按照载体的不同，目前诱导重编程的方法大致可分为整合型和非整合型两种。整合型重编程常利用逆转录病毒、慢病毒载体等实现基因导入、整合，实现重编程。逆转录病毒可以将携带的转基因序列随机整合到细胞分裂间期的染色体上，再进行表达。但在表达的过程中因激活了DNA及组蛋白的甲基转移酶，易导致基因沉默，使细胞不完全编程，若用病毒上清液重复感染，外源基因的过表达使嵌合体动物有高致瘤风险^[4]。组成性慢病毒载体的出现解决了基因沉默的问题，但依旧无法有效调控外源性基因的表达^[5]。非整合型重编程减少对染色体结构的改变，一定程度上降低了基因突变和癌变的可能。

蛋白诱导多潜能干细胞的方法是直接向细胞中导入蛋白质，采用基因工程技术制备蛋白质转录因子，在蛋白质的末端添加穿膜肽序列，引领蛋白质跨膜、定位。蛋白质经过折叠、修饰、输送到细胞核内发挥作用后，最终被降解^[6]。Zhou等^[7]已成功使用OSKM四种重组蛋白，诱导获得能稳定传代的iPSCs。此方法不依赖转录因子，不发生插入突变，不影响细胞的遗传物质，但效率极低、造价昂贵、操作复杂。

小分子化合物可协同重编程因子来提高重编程效率，主要机制有：一部分小分子化合物可调控与干细胞自我更新相关的信号转导通路，包括TGFp、Notch、Wnt和Jak/Stat等，来促进重编程进程^{[8, 9, 10, 11]}；一部分小分子化合物可参与细胞周期的调控 ，甚至提升端粒酶活性。

在提高重编程效率方面，小分子化合物易合成、保存和标准化，具有广泛的应用可能。G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-01294可协助Oct4/Klf4基因重编程NSC为iPSCs^[12]；维生素c和低氧条件可以下调肿瘤抑制基因P53的活性，提高重编程效率^[13]；组蛋白去乙酰化抑制剂丙戊酸能使基因处于活化状态，更易于重编程，且效果优于5-氮(杂)胞苷^[14]。

对某些特定种类的细胞可使用一些小分子化合物替代部分重编程因子而获得iPSCs。Hou等^[15]在诱导培养基中加入 7 种小分子化合物 FSK、VPA、CHIR99021、616452、苯环丙胺、DZNep 和 TTNPB，不添加Oct4，成功地将小鼠成纤维细胞重编程为 iPSCs，并验证其具有干细胞特性，此方法的转化率达0.2%。

外源性基因的整合会引起受体细胞基因的不稳定，基因组杂交技术在多种诱导多能干细胞系中发现了染色体亚组的异常^[16]，单核苷酸多态性高分辨率分析发现诱导多能干细胞相对于来源的成体细胞有更多的拷贝数变异^[17]。导入的原癌基因c-Myc等的过表达会极大地提升致瘤和致癌的几率，即使用小分子化合物来取代这些基因或者是用可降解的重组蛋白诱导，也会因为P53等肿瘤抑制基因的功能性表达的下调，使细胞的增殖不受控制。此外每个参与重编程的因子都会以不同的方式对细胞的表观遗传学及其它性质产生影响^[18]。

细胞的直接重编程不经过诱导多能干细胞阶段和去分化、再分化等过程，通过改编(lineage reprogramming)，直接使一种已分化的细胞转变为另一种细胞，又称为直接转分化(dierct transdifferentiation)。这种方法避免了细胞获得性免疫原性的问题，因跳过了细胞的多能性阶段，能在一定程度上降低致瘤的风险。

目前该领域的研究多采用慢病毒载体携带目的基因的方案。2011年，Ambasudhan等^[19]用miRNA-124和转录因子MYT1L和BRN2，将新生儿和成人的原代皮肤成纤维细胞直接重编程为功能性神经元。Huang等^[20]通过抑制p19^Arf的活性同时转导表达Gata4、Hnf1a和Foxa3三个转录因子，将小鼠尾成纤维细胞直接重编程为诱导性肝细胞样细胞。

重编程的步骤一般有：(1)构建携带重编程因子的载体；(2)分离培养靶细胞；(3)重编程靶细胞；(4) iPSCs旳鉴定与培养；(5) iPSCs的功能检测。在诱导重编程过程中，体细胞要经历 DNA 去甲基化、组蛋白去乙酰化、染色体结构调整、多能基因激活，基因组印记去除等一系列分子事件。

针对重编程的步骤和过程中发生的分子事件，研究者正在尝试采用多种基因水平和非基因水平的诱导方式来提高重编程效率，包括使用多重顺反子质粒载体、染色体修饰、miRNA调节、添加培养基质等。

Hong等^[21]经实验证明p53- p21通路的表达对iPS的转化有明显的抑制作用，使该通路表达下调可以较大幅度地提高诱导效率。在P53野生型(p53^+/+)、P53杂合突变(P53^+/-)和P53缺失(P53^-/-)的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts ，MEF)中导入Oct3/4，Sox2、Klf4，用Nanog-GFP标记，经流式细胞计数发现P53缺失的MEF转化率达到10%，远高于其他两组，若同时导入c-Myc，转化率可达20%。若在P53杂合突变(P53^+/-)的MEF中导入P53阴性显性突变的Pro275Ser (ref. 13)，可使其转化率大幅提升。

除卵细胞受精的前三天，Mbd3蛋白在机体发育的各个阶段持续表达，介导组蛋白的去乙酰化和染色质的重塑。小鼠多能外胚层干细胞^[22](murine primed pluripotent epiblast stem cells ，EpiSCs)来自于植入子宫后第5.5天的小鼠胚胎外胚层细胞，与人类ES细胞有相似的基因表达方式和细胞表面标记，在白血病抑制因子LIF存在时不会旺盛生长，是介于传统小鼠ES 细胞与已经开始分化的细胞之间的一个状态。Rais等^[23]选取EpiSCs为材料，分别在Mbd3^+/+、Mbd3^fl/-、Mbd3^-/-的EpiSCs中敲入Rosa26-creER 和Nanog-GFP等位基因，加入OSKM，在2i/LIF条件下培养(2i是ERK1/2和GSK3b抑制因子)，诱导其向幼稚的多能状态转化，发现Mbd3^-/-组EpiSCs的转化率高达95%，明显高于其他组。进一步的实验显示从成体细胞中除去 MBD3 蛋白同样可提高转化率，并将生成干细胞所需的时间从原来的4 周缩短至 8天。

Yu等^[24]经实验发现let-7基因表达的下调，可使HMGA2的表达显著升高，HMGA2和SOX2的协调作用能诱导人成体细胞快速高效地向神经干细胞转化。在SOX2诱导的人皮肤成纤维细胞(SOX2-transduced human dermal fibroblast，SOX2-transduced hDFs)中分别转染miR-124-3p,miR-9-5p，miR-9-3p，anti-let-7b和let-7b进行细胞培养。转染anti-let-7的组合形成PAX6/巢蛋白阳性细胞克隆的效率远高于其他的组合(^* P< 0.05，^** P< 0.01)，该小组在人间充质干细胞和血细胞的实验中也获得了一致的结果。

let-7 microRNA是一种抑癌microRNA，其靶基因有MYC、LIN28、HMGA2等，通过与靶基因的3′UTR配对，降解靶基因的 mRNA或抑制翻译，于转录后水平负调节靶基因的表达。let-7表达的降低会使细胞失去终末分化能力，不断重复细胞周期，持续分裂。非组蛋白HMGA2可与富含AT碱基的DNA序列于小沟处结合，与H1组蛋白竞争结合位点，使染色体转化为开放状态，利于染色体和诱导因子相互作用，加快染色体的复制。区别于改变染色体的结构和单纯的下调抑制因子，此实验着眼于对染色体状态的改变，为提高重编程效率提供了新的研究思路。

不同的因子组合下重编程不同种类的细胞其效率有所不同，以Oct4/Sox2/Klf4因子组合重编程时，ADSCs的重编程效率最高，达0.1%；而成纤维细胞和角质细胞只有0.002%^{[25, 26]}。在使用皮肤成纤维细胞直接重编程获得分化成熟的诱导性心肌样细胞时，使用Gata4、Mef2c和Tbx5这三种心脏发育早期的关键转录因子组合可以提高转化效率^[27]。

自体来源的诱导多能干细胞可接受 HLA相关干细胞配型而无需进行HLA数据库匹配，获得的免疫耐受的干细胞系非常适合作为自体移植的种子细胞，能在一定程度上解决移植供体稀缺、免疫排斥严重、长期后续药物治疗的问题，推动再生医学和疾病个体化治疗的发展。目前，研究者已经诱导出具有临床治疗应用前景的体细胞，如胰腺β细胞^[28]、肌萎缩侧索硬化症的皮肤成纤维细胞^[29]、肝细胞^[30]等。

Hayashi等^[31]首次成功地在体外将iPSCs诱导为原始卵母细胞，并移植至小鼠体内，与精子受精培育出健康的子代小鼠。iPS细胞在颗粒细胞培养上清液的诱导下具有向类生殖细胞分化的潜能，陈默等^[32]在此基础上采用环磷酰胺加白消安腹腔注射构建卵巢早衰小鼠动物模型，经尾静脉注射iPS细胞，利用其归巢效应从生殖及内分泌双方面对化疗所致的卵巢早衰实现了修复。

诱导多能干细胞能够提供体外的疾病模型，有利于重现疾病的发展过程，研究疾病的发生机制，代替亲缘性较远的实验动物进行药物的开发，在临床上代替病人进行药物剂量和给药方式调整等方面的试验。

目前，包括肌萎缩侧索硬化症和脊髓性肌萎缩^[33]、帕金森氏病、亨廷顿病、唐氏综合症等在内的多种遗传病患者特异性的诱导多能干细胞系已经建立^[34]，在许多退行性疾病机制和治疗方案的研究中起到了重要作用。

研究常用的鼠模型和实际人体疾病存在一定的差异性，与灵长类动物模型相比，其iPSCs的诱导阶段、培养环境、分化、行为认知评价和药物试验等都存在差异，尤其在神经系统疾病的长时程研究中存在明显的局限性^{[35, 36]}。

患者自体细胞是建立疾病模型的理想来源，它保有疾病独特的基因型和表型，是患者自体疾病的最好表现形式，但在体外无法完整展现细胞间及细胞和环境间的相互作用。Zhou等^[37]使用Ngn3、Pdx1和Mafa将小鼠体内已经完全分化的胰腺外分泌细胞直接重编程为诱导性β细胞时发现：获得的β细胞虽然能表达β细胞的功能必需基因、重构周围血管并分泌胰岛素，却呈单个细胞或小簇样细胞分布，不能组成胰岛结构，缺乏组织的完整性，限制了细胞使用的有效性。此外，疾病的病理模型具有复杂性，很难由单一种类的细胞完整表现。

在不断改进重编程方法的同时，可以考虑利用其致瘤性，通过诱导多能干细胞建立肿瘤干细胞(cancer stem cell ，CSCs)模型。肿瘤干细胞是在肿瘤中具有自我更新能力并可分化出异质性的肿瘤细胞，对肿瘤异质性的研究有重要意义，CSCs在肿瘤组织中的数量有限，分离和纯化相当困难，因此急需一种便利的方式来建立具有CSCs特点的细胞模型。陈凌 ^[38] 由鼠肺癌细胞系(Lewis lung carcinoma，L L C )诱导出miPS - LLCcm 细胞，在体内试验中表现出典型的恶性肿瘤表型和显著的新生血管形成能力，在无饲养层细胞和白细胞抑制因子的培养基中培养四周后，仍有30% ~ 5 0% 的细胞维持Nanog-GFP的表达，并于裸鼠体内表现出显著而快速的肿瘤形成能力，可作为肿瘤干细胞的模型。

诱导多能干细胞技术自问世至今一直是生物工程领域的研究热点，取得了不少的成果也面临着很多发展障碍。对iPS的相关研究正处于发展的瓶颈和关键阶段，随着技术的逐渐成熟，机制的逐步明确，细胞分子水平研究的进一步深入，可以预见它将推动再生医学、药物开发、胚胎发育学等领域的进一步发展。

今后的研究应主要着眼于：对发育过程相关机制的研究；开发安全高效的标准化诱导方式，使iPS技术走向规范化，群体化，最后达到个体化；建立对复杂疾病有高拟合度的疾病模型；减短培育周期，降低成本和致瘤风险，使其更好地适应临床治疗和药物开发的需求。