碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是FGF家族中的一种多功能的多肽生长因子。bFGF是一种单链碱性非糖基化多肽，分子中有4个半胱氨酸残基，没有二硫键^{[1, 2]}。bFGF 广泛分布于中胚层和神经外胚层来源的多种组织和器官，也存在于肿瘤组织中，它具有促进细胞增殖、分化、迁移等多种生物学效应，并参与血管重塑、骨骼形成、神经发育、肿瘤代谢等生理和病理过程^{[3, 4, 5]}。

对于含半胱氨酸残基的重组蛋白，国家食品药品监督管理总局在其发布的《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》中要求，依据目的产品基因序列，当存在半胱氨酸残基时，应尽可能确定巯基和/或二硫键的数量和位置；2015年版中国药典在“人用重组DNA技术产品总论”中也有同样的要求^[6]。因此，有必要对此类产品的巯基进行测定和表征。

目前巯基的含量测定方法有多种，如荧光标记质谱法^[7]、液相色谱-质谱联用法^[8]、柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法^[9]、Ellman’s法^{[10, 11, 12, 13, 14]}等。前几种方法测定过程复杂，对仪器设备要求较高，对常规质控分析而言成本也较高；Ellman’s法是Ellman在1959年发明的一种方法，即利用5,5’-硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)与游离巯基反应，在412 nm处生成有最大吸收峰的黄色物质后，采用分光光度法测定，该法简单、快速、直接，是测定巯基含量的理想方法^[12]。该法广泛用于食品、血清/浆、细胞、植物组织等样本中巯基含量测定，且已有商业化试剂盒上市。

本研究旨在基于Ellman’s法，建立并优化一种测定重组bFGF中游离巯基的方法，以监测分子结构的正确性及批间一致性。

巯基检测试剂盒为上海贝博生物公司产品、半胱氨酸为Sigma公司产品、重组碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF)为珠海亿胜生物制药有限公司自制，其他试剂为进口或国产分析纯；紫外-可见分光光度计UV6100型为上海美谱达仪器有限公司产品。

用PBS(25 mmol/L 磷酸盐缓冲液,50 mmol/L NaCl,pH 7.0)将半胱氨酸标准品溶解，并制备成104.5、80、60、40、20和10 μg/ml 共6个浓度。以下步骤按巯基检测试剂盒说明书进行，先分别吸取100 μl各浓度的标准品和样品于管中(空白管加入PBS)；再在各管中加入100 μl试剂A，混匀；然后依次加入1 ml试剂B和0.5 ml试剂C(Ellman试剂)，混匀；37℃温育15 min；最后加入50 μl试剂D；于37℃静置10 min，在412 nm波长处测定OD值。用仪器内置软件进行分析，以半胱氨酸标准品的浓度为横坐标，以412 nm处OD值为纵坐标绘制标准曲线。依据标准曲线方程计算出待测样品中游离巯基的含量。根据样品浓度，可计算每分子的蛋白质所含的游离巯基数量^①

①游离巯基含量(mol/mol)=游离巯基含量(mol/L)/{蛋白质浓度(g/L)/蛋白质分子量}。

按照《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》(GPH1-1)，验证方法的专属性、准确性、精密度、线性和范围。专属性是指方法的特异性；准确性是指测定值与真实值之间的一致性或接近程度，一般用回收率表示；精密度是指均质供试品多次取样进行一系列检测结果的接近程度，一般表示为变异系数(CV％)，即测定值的标准差和均值的比值；线性是指在给定的范围内检测结果与供试品中被分析物的比例关系；范围是指能达到一定的准确性、精密度和线性时被分析物的较高和较低浓度(量)的一个区间。

(1)方法的专属性 分别设置阳性对照、阴性对照、PBS对照和加有碘乙酰胺的样品进行测定，按以下顺序(表 1)加样，按检测步骤进行实验。

(2)方法的准确性与精密度 用半胱氨酸标准品制备不同浓度(80、40和20 μg/ml)的样品，分别于不同日进行测定，每一浓度进行3次重复实验，统计回收率及其变异系数。

(3)方法的线性与范围 以标准品的浓度为横坐标，以OD₄₁₂为纵坐标，进行线性拟合；根据准确性、精密度和线性的结果确定方法测定的有效范围。

对三批rb-bFGF原液进行测定，除直接测定外，同时设置100℃加热、20% SDS、8 mol/L尿素和饱和盐酸胍变性处理组。此外，将一批原液于4℃放置0、1、2、3、6个月后测定其游离巯基含量。

表 2的结果表明，阴性对照与Buffer对照的OD值相近，而添加了碘乙酰胺的样品和标准品测定管与阴性对照和Buffer对照的OD值基本一致，而没有加碘乙酰胺的样品和标准品阳性对照的OD值分别为0.2770和0.2431，说明碘乙酰胺封闭了样品及半胱氨酸标准品分子上的游离巯基，故方法专属性好。

表 3的结果显示，3组样品的回收率范围分别为97.6%~107.4%、92.4%~101.8%和91.7%~107.3%，平均回收率分别为101.6%、95.6%和100.6%；变异系数分别为5%、5.6%和8%，符合方法学验证要求。

梯度稀释的标准品，其浓度与OD值呈直线相关，相关系数0.999以上，结果见图 1。

图 1 标准品的拟合直线 Fig. 1 Standard curve with standard references(linearity)

图选项

根据方法的准确性、精密度及线性的结果，在上述检测条件下，游离巯基含量的测定范围为20~80 μg/ml。

表 4的结果显示，rbFGF原液直接测定得到的结果基本一致，在2 mol/mol左右；由于bFGF分子有4个游离巯基，其中Cys34和Cys101位于分子内部，Cys78、Cys96则位于分子外部。分子内部的游离巯基无法与DTNB反应，故本方法只能直接检测暴露于分子外部的两个游离巯基。对此，研究尝试将蛋白变性后再测总巯基含量。结果显示，100℃加热、SDS及尿素变性处理后，测定结果仍在2 mol/mol左右，提示以上三种变性方式不足以使rbFGF内部巯基完全暴露。进一步用饱和盐酸胍变性处理，测得的结果约为4 mol/mol，即每个蛋白质分子上有4个游离巯基，与理论值一致。表 5的结果显示，rbFGF在4℃放置6个月，游离巯基的含量逐渐升高，推测可能是由于蛋白质分子逐步降解，暴露了内部的游离巯基所致，这一点可以从蛋白质浓度和纯度逐步降低得以印证。

表 5 rbFGF原液稳定性样品游离巯基测定 Table 5 Determination of free thiol in rbFGF drug substance(stability)

	游离巯基含量 (mol/mol)	蛋白浓度 (mg/ml)	蛋白纯度 (HPLC)
0	1.96	2.69	96.6%
1	2.55	2.46	90%
2	2.78	2.18	85.5%
3	2.94	1.91	82%
6	3.11	1.60	77%

表选项

蛋白质是由氨基酸聚合而成的生物大分子化合物。巯基(-SH)是某些氨基酸的重要官能团，其中半胱氨酸残基中的巯基是所有蛋白质氨基酸残基中最活泼的基团^[15]。很多半胱氨酸残基中的巯基在蛋白质中是以二硫键形式存在，二硫键的形成对于稳定蛋白质的空间结构和保持其活性功能具有重要影响；另一部分半胱氨酸残基上巯基以游离形式存在，这种游离存在的巯基容易使蛋白分子间形成二硫键，导致蛋白聚体的形成，影响蛋白质的稳定性及均一性。在重组蛋白质药物研发过程中，若蛋白分子中存在二硫键，应确定二硫键的位置和数量以及未形成二硫键的游离巯基的含量，以确证蛋白分子结构的正确性；若无二硫键，只含有游离的巯基，也应测定其含量。

Ellman’s法是测定巯基含量的一种比较成熟的方法，已有商业化试剂盒上市。但该方法目前更多的是应用在测定食品(如豆奶、面粉等)、血清/浆、尿液、细胞、植物组织等样本中的巯基含量^{[10, 11, 12, 13, 14]}。少见用于测定某单一纯品蛋白质/多肽中游离巯基含量；且目前常用的检测方法使用针对于不同样品的经验公式进行计算，存在一定的偏差与风险。

本研究在经典Ellman’s法基础上进行了改进，使用半胱氨酸标准品，根据标准品的浓度与412 nm处的吸光度拟合得到的标准曲线，计算蛋白样品中游离巯基的含量。同时对建立的方法进了方法学验证，专属性、准确性、精密度和线性皆符合要求。本方法测得的分子表面和总游离巯基含量与理论一致，可用于蛋白质游离巯基检测，以监测分子结构的正确性与均一性。采用本方法测定本单位另一种正在研发的生长因子类蛋白的游离巯基含量时也得到与理论值一致的结果。本方法也可以为其他蛋白质药物及抗体药物游离巯基含量测定提供参考。