2016, Vol. 36文章信息
- 蒙国基, 邓义熹, 李乐, 罗豪晖, 于玉根
- MENG Guo-ji, DENG Yi-xi, LI Le, LUO Hao-hui, YU Yu-gen
- 变速上样在MabSelect填料上分离WLB303
- Promotion in ProteinA Chromatography of WLB303 Monoclonal Antibody by Using Dual Flowrate to Load Sample
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(6): 65-75
- China Biotechnology, 2016, 36(6): 65-75
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160609
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文章历史
- 收稿日期: 2015-11-19
- 修回日期: 2015-12-07
Protein A亲和层析是目前工业上捕获、纯化大多数单克隆抗体的金标准步骤[1, 2]，其填料性能在高载量、耐碱清洗等方面不断革新，目的都是为了提升生产效益。但随着生产工艺规模的扩大，细胞培养收获的上清液在亲和层析中的上样过程，仍然是最耗工时的部分[3]。同时，protein A的填料成本在生产成本中占较大的比重，且寿命有限，为了降低使用成本，离子交换层析、疏水层析都曾尝试作为抗体捕获的手段，事实证明protein A亲和层析的选择性最好[4, 5, 6]。Ghose等[7]曾提出利用两阶段上样的策略提高protein A填料的载量，在此基础上出现了变速上样的概念，以提高此步骤的效率。
变速上样是指以不同的保留时间(retention time,RT)进行上样，整个上样过程具体分三个阶段：初始阶段以较短的保留时间(即较快的流速)进行上样；当填料快达到满载时，增加保留时间(降低流速)以提高填料的动态载量；最后，为了让填料达到满载，再增加保留时间至上样结束。其原理是在各阶段最大限度利用不同保留时间下的填料载量。变速上样的手段既可以保证填料的载量得到充分的利用，又可以提高上样过程的流速，从而达到减少整个上样过程耗时目的。
我们用WLB303单克隆抗体在GE MabSelect填料上进行了变速上样工艺的研究，并与恒速上样工艺进行对比，考察变速上样在实际工艺中应用的可行性。
1 材 料 1.1 层析介质层析介质MabSelect购自GE公司。
1.2 仪器设备PP10/35层析柱(PP材质Φ10 mm×3.5 cm)，装填体积2.7 ml；Tricorn10/100层析柱(Φ10mm×10cm)购自GE公司，装填体积7 ml；GE AKTA Avant 25层析系统。
1.3 样品及试剂本公司WLB303项目精纯后单抗样品，浓度0.86 g/L；本公司WLB303项目细胞培养澄清液样品，抗体含量0.62 g/L。试剂：氯化钠、醋酸钠、醋酸、盐酸均为国产分析纯；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Tris均为国产药用级。
2 方 法 2.1 MabSelect在不同保留时间下载量的测定精纯样品以1.2 min、2.4 min、4 min、6 min、8 min保留时间上样至MabSelect PP10/35层析柱，直至UV280达到10%背景穿透，结束上样。以10%穿透点为上样终点，计算出相应保留时间下的动态载量。
试验条件：
层析柱：PP10/35，填料：GE MabSelect 柱体积:2.7 ml。
样品：WLB303精纯样品，浓度0.86 g/L
平衡液：20 mmol/L NaPi，150 mmol/L NaCl,pH7.4
淋洗液：20 mmol/L NaPi，150 mmol/L NaCl,pH7.4
洗脱液：0.1 mol/L NaAc-HAc,pH3.0。
2.2 理论动态载量的计算根据以上测定的几个具体保留时间下的动态载量，以动态载量(DBC)为纵坐标，以保留时间(t)为横坐标，用三次方程拟合得到动态载量曲线(过原点)，得到载量随保留时间的变化趋势曲线方程：Y=a[X]3+b[X]2+c[X]。不同保留时间下的动态载量的对应关系见表 1。
| X | t(a) | t(b) | t(c) | t(d) | t(e) | …… |
| Y | DBC(a) | DBC(b) | DBC(c) | DBC(d) | DBC(e) | …… |
然后划分高速t(A)、中速t(B)和恒速t(C)三个保留时间段，推导出填料在各个时间段下的理论动态载量表(表 2)。
| 高速 | t(A) | t(A1) | t(A2) | t(A3) | …… | t(An) |
| 中速 | t(B) | t(B1) | t(B2) | t(B3) | …… | t(Bn) |
| 恒速 | t(C) | t(C) | t(C) | t(C) | …… | t(C) |
| 注：t(C)>t(Bn)>……>t(B1)>t(An)>……>t(A1) | ||||||
分别将t(A1)、t(A2)……t(C)代入公式Y=a[X]3+b[X]2+c[X]，计算得到各个时间点下的动态载量(表 3)。
| 高速 | DBC(A) | DBC(A1) | DBC(A2) | DBC(A3) | …… | DBC(An) |
| 中速 | DBC(B) | DBC(B1) | DBC(B2) | DBC(B3) | …… | DBC(Bn) |
| 恒速 | DBC(C) | DBC(C) | DBC(C) | DBC(C) | …… | DBC(C) |
针对特定的工艺条件(柱规格、样品浓度)，根据不同保留时间下的流速组合计算出该工艺对应的变速上样组合表。
2.3.1 工作流速与上样时间计算根据体积流速的公式：Q=CV/t计算得到不同保留时间下的体积流速(其中Q为体积流速，CV为柱体积，t为保留时间)，见表 4。| 高速 | Q(A) | Q(A1) | Q(A2) | Q(A3) | …… | Q(An) |
| 中速 | Q(B) | Q(B1) | Q(B2) | Q(B3) | …… | Q(Bn) |
| 恒速 | Q(C) | Q(C) | Q(C) | Q(C) | …… | Q(C) |
根据公式TL=(CV×DBC)/Titer/Q计算得到不同保留时间下满载所需的上样时间(其中：TL为满载上样时间，DBC为不同时间下的动态载量，Titer为细胞培养上清抗体表达量，Q为不同保留时间下的体积流速)，见表 5。
| 高速 | TL(A) | TL(A1) | TL(A2) | TL(A3) | …… | TL(An) |
| 中速 | TL(B) | TL(B1) | TL(B2) | TL(B3) | …… | TL(Bn) |
| 恒速 | TL(C) | TL(C) | TL(C) | TL(C) | …… | TL(C) |
根据公式：
TL(AnBnCn)= [CV×DBC(An)]/Titer/Q(An)+[CV×(DBC(Bn)- DBC(An))]/Titer/Q(Bn)+[CV×(DBC(c)- DBC(Bn))]/Titer/Q(C)计算得到不同保留时间条件下变速上样的总时间。
其中：
TL(AnBnCn)为分别在t(An)、t(Bn)、t(C)三个保留时间下的变速上样总时间；
CV为柱体积
DBC(An)、DBC(Bn)、DBC(C)为分别在t(An)、t(Bn)、t(C)三个保留时间下的动态载量；
Titer为细胞培养上清抗体表达量。
Q(An)、Q(Bn)、Q(C)为分别在t(An)、t(Bn)、t(C)三个保留时间下的体积流速。
得到不同上样速度组合下的上样总时间，见表 6。
| t(A1) | t(A2) | t(A3) | …… | t(An) | |
| t(B1) | TL(A1B1C) | TL(A2B1C) | TL(A3B1C) | …… | TL(AnB1C) |
| t(B2) | TL(A1B2C) | TL(A2B2C) | TL(A3B2C) | …… | TL(AnB2C) |
| t(B3) | TL(A1B3C) | TL(A2B3C) | TL(A3B3C) | …… | TL(AnB3C) |
| …… | …… | …… | …… | …… | …… |
| t(Bn) | TL(A1BnC) | TL(A2BnC) | TL(A3BnC) | …… | TL(AnBnC) |
| t(C) | t(C) | t(C) | …… | t(C) |
取表 7中最小值MIN[TL(A1B1C)，TL(A2B1C)……TL(AnBnC)]，即为总上样时间最短的变速上样组合。
| 保留时间(min) | 10%穿透载量(g/L) |
| 1.2 | 19.77 |
| 2.4 | 25.64 |
| 4 | 27.81 |
| 6 | 28.10 |
| 8 | 28.86 |
根据2.2所推算出来的变速上样条件及上样量，用精纯后样品测试MabSelect PP10/35层析柱在变速上样工艺条件下的回收率、洗脱体积及浓度，并与同等上样量的恒定保留时间工艺进行对比，计算变速上样实际节省的时间。
试验条件：
层析柱：PP10/35，填料：GE MabSelect，柱体积：2.7 ml。
样品：WLB303精纯样品，抗体含量：0.86 g/L
平衡液：20mmol/L NaPi，150mmol/L NaCl,pH7.4
淋洗液：20mmol/L NaPi，150mmol/L NaCl,pH7.4
洗脱液：0.1mol/L NaAC,pH3.0
2.5 Tricorn 10/100柱子下的变速上样方案实践根据2.2所推算出来的变速上样条件及上样量，用细胞培养澄清液在MabSelect Tricorn 10/100层析柱上进行完整工艺测试，对比变速上样工艺和恒定保留时间工艺，考察其回收率和纯度的差别，并比较工艺效率。
试验条件：
层析柱：Tricorn10/100，填料：GE MabSelect，柱体积：7 ml。
样品：WLB303-DF-201407024，抗体含量：0.62g/L
平衡液：10mmol/L NaPi,pH7.2
淋洗液1：10mmol/L NaPi,pH7.2
淋洗液2：10mmol/L NaPi,0.4mol/L NaCl,pH7.2
淋洗液3：10mmol/L NaPi,pH7.2
洗脱液：0.1mol/L Glycine,pH3.3
pH调节液：1mol/L Tris-HCl,pH9.0
洗脱收集的样品先用洗脱液1∶1稀释，再用pH调节液将样品pH调至7.2。
3 结果与讨论 3.1 MabSelect在不同保留时间下的载量 3.1.1 载量测定MabSelect在1.2 min、2.4 min、4 min、6 min、8 min保留时间下的层析图谱见图 1，由图谱可见，随着保留时间的增加，上样量不断增加，但从4 min保留时间开始增加趋缓。
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| 图 1 MabSelect在不同保留时间下的动态载量比较 Fig. 1 Chromatogram of MabSelect DBC tested on different retention time |
不同保留时间下的动态载量结果(表 7)也显示，随着保留时间的增加，动态载量也随之增加。在1.2~4 min保留时间范围内随着保留时间的延长，MabSelect动态载量有较明显的升高，4 min以上保留时间条件下MabSelect的动态载量进入平台期，差别不大。
3.1.2 各保留时间下理论载量计算以保留时间作为横坐标，动态载量(DBC)作为纵坐标做散点图，添加截距为0的3项式趋势线并获得相应的三次方程y＝0.2532x3－3.9502x2＋19.05x，如图 2。
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| 图 2 保留时间与动态载量关系图 Fig. 2 MabSelect DBC trend map |
根据表 2，设置3个不同的保留时间段，高速保留时间段(t1)为1.2~2.2 min、中速保留时间段(t2)为2.5~4.5 min、恒速保留时间段(t3)为6 min，并把t1、t2及t3保留时间段分别平均分成10段，如表 8所示。
| t1 | 1.2 | 1.3 | 1.4 | 1.5 | 1.6 | 1.7 | 1.8 | 1.9 | 2.0 | 2.1 | 2.2 |
| t2 | 2.5 | 2.7 | 2.9 | 3.1 | 3.3 | 3.5 | 3.7 | 3.9 | 4.1 | 4.3 | 4.5 |
| t3 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
分别将表 8中的t1、t2及t3各时间点代入三次方程y＝0.2532x3－3.9502x2 ＋19.05x中，按表 3的方式计算出三个保留时间段下的动态载量DBC1、DBC2、DBC3，如表 9。
| DBC1 | 17.6 | 18.6 | 19.6 | 20.5 | 21.4 | 22.2 | 23.0 | 23.7 | 24.3 | 24.9 | 25.5 |
| DBC2 | 26.9 | 27.6 | 28.2 | 28.6 | 28.9 | 29.1 | 29.2 | 29.2 | 29.2 | 29.0 | 28.8 |
| DBC3 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | 26.8 | 26.8 |
由表 9的计算结果可见，从4.1 min保留时间开始，随着保留时间的延长，填料的载量发生了轻微降低，并且有部分保留时间点(1.2min、4min、6min)计算得到的动态载量值比实际测定值偏低。这是拟合曲线带来的偏差，由图 2可以看出，保留时间在4~8min时间段的曲线出现了向下弯曲的形状，因此导致此范围内计算出的动态载量略低于实际测定值。但是通过该三次方程仍然可以计算测量范围内的任何一个保留时间下的理论动态载量，作为工艺参考，并且，后续的上样方案的推导仍采用计算得到的动态载量。
3.2 PP10/35柱子下的变速上样方案实践 3.2.1 PP10/35柱子下的变速上样组合推算按照表 5，根据公式Q=CV/t计算得到不同保留时间下的体积流速。其中CV为柱体积2.7 ml；t为表 8的保留时间，计算结果如表 10：
| Q1 | 2.3 | 2.1 | 1.9 | 1.8 | 1.7 | 1.6 | 1.5 | 1.4 | 1.4 | 1.3 | 1.2 |
| Q2 | 1.1 | 1.0 | 0.9 | 0.9 | 0.8 | 0.8 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.6 | 0.6 |
| Q3 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
根据2.2.3 的变速上样组合推导方法，精纯抗体(浓度0.86 g/L)在PP10/35规格MabSelect柱(2.7 ml)上样至满载的变速上样组合如表 11。
 | 1.2 | 1.3 | 1.4 | 1.5 | 1.6 | 1.7 | 1.8 | 1.9 | 2.0 | 2.1 | 2.2 |
| 2.5 | 50.8 | 51.4 | 52.3 | 53.5 | 55.0 | 56.8 | 58.7 | 60.9 | 63.3 | 79.5 | 68.5 |
| 2.7 | 50.2 | 50.5 | 51.2 | 52.2 | 53.5 | 55.0 | 56.8 | 58.9 | 61.1 | 63.5 | 66.1 |
| 2.9 | 50.4 | 50.5 | 51.0 | 51.8 | 52.9 | 54.2 | 55.8 | 57.7 | 59.8 | 62.0 | 64.5 |
| 3.1 | 51.4 | 51.3 | 51.5 | 52.1 | 53.0 | 54.1 | 55.6 | 57.3 | 59.2 | 61.3 | 63.6 |
| 3.3 | 53.0 | 52.6 | 52.6 | 53.0 | 53.7 | 54.7 | 55.9 | 57.5 | 59.2 | 61.2 | 63.4 |
| 3.5 | 55.1 | 54.5 | 54.2 | 54.4 | 54.9 | 55.7 | 56.8 | 58.1 | 59.7 | 61.6 | 63.6 |
| 3.7 | 57.5 | 56.7 | 56.2 | 56.1 | 56.4 | 57.0 | 57.9 | 59.1 | 60.6 | 62.3 | 64.2 |
| 3.9 | 60.2 | 59.1 | 58.4 | 58.2 | 58.2 | 58.7 | 59.4 | 60.4 | 61.7 | 63.3 | 65.1 |
| 4.1 | 63.1 | 61.8 | 60.9 | 60.4 | 60.2 | 60.5 | 61.0 | 61.9 | 63.1 | 64.5 | 66.1 |
| 4.3 | 66.1 | 64.5 | 63.4 | 62.6 | 62.3 | 62.4 | 62.8 | 63.5 | 64.5 | 65.8 | 67.3 |
| 4.5 | 69.1 | 67.2 | 65.9 | 65.0 | 64.4 | 64.3 | 64.5 | 65.1 | 65.9 | 67.1 | 68.5 |
| RT3(min) | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
根据表 11可见，使用精纯抗体(浓度0.86 g/L)在PP10/35规格的MabSelect柱上样至满载的最短时间为50.2 min，即使用“t1=1.2 min，t2=2.7 min，t3=6 min”的保留时间组合。
以满载80%的上样量进行测试，设计“t1=1.2 min，t2=2.7 min，t3=6 min”变速上样的试验方案，各阶段的上样条件如表 12。
| t(min) | DBC (mg/ml) | 80%柱载量 (mg) | 上样体积 (ml) | 线性速度 (cm/h) | 体积流速 (ml/min) | 上样时长 (min) | |
| t1 | 1.2 | 17.6 | 38.0 | 44.2 | 175 | 2.3 | 19.2 |
| t2 | 2.7 | 27.6 | 59.6 | 25.2 | 78 | 1.0 | 25.2 |
| t3 | 6 | 26.8 | 57.9 | -2.1 | 35 | 0.5 | -4.2 |
| Total | 67.3 |
t3阶段的上样量为负值，这是由3.1.2 部分拟合曲线在4~8min保留时间段向下弯曲所致，因此，实验中执行t1+t2两阶段上样。根据表 13的试验方案，两阶段上样的等效保留时间为2.7/[(44.2+25.2)/(19.2+25.2)]＝1.7 min，而此时柱子的载量为(67.3×0.86)/2.7 = 21.4 g/L，等效于保留时间为6 min时柱子80%的载量(26.8 × 80% = 21.4 g/L)。
| 上样模式 | 保留时间(min) | 实际上样量(ml) | 洗脱体积(ml) | 洗脱浓度(mg/ml) | 回收率(%) | 工艺时间(min) | |||
| 变速上样 |
| 6.2 | 9.06 | 97.3 | 68 | ||||
| 恒速上样 | 4 | 67.2 | 6.3 | 9.06 | 98.8 | 129 |
由于4 min保留时间以后填料的载量处于平台期，几乎不再增加，因此，以“t=4 min，上样量=67.3 ml为条件”进行恒速上样对照试验，与上述“t1=1.2 min，t2=2.7 min”上样方案进行工艺比较。
3.2.3 PP10/35柱子的变速上样与恒速上样实验结果比较变速上样与恒速上样实验结果见表 13。
由图 3可见，精纯样品在两种模式下上样都会有轻微的流穿，OD280都不大于20 mAu。说明在变速上样的两个较大流速下，都不会带来明显的样品流穿损失。
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| 图 3 上样阶段对照图 Fig. 3 Chromatogram comparison of loading part Red: dual flowrate; Green: constant flowrate |
由图 4可见，两种上样模式下，精纯样品的上样及洗脱效果是一致的，变速上样方案的总工艺时间明显缩短。
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| 图 4 PP10/35柱变速上样和恒速上样层析图比较 Fig. 4 Full chromatogram comparison Black: dual flowrate; Blue: constant flowrate |
上述结果可见，精纯样品在PP10/35柱上用保留时间为“1.2 min＋2.7 min”的变速上样组合进行的模拟纯化实验，与用4 min保留时间的恒速上样条件进行纯化比较，在相同上样量的条件下，获得了相同的纯化效果和回收率，但整体工艺时间可以从129 min减少到68 min，有47%的提升。该模拟纯化实验使用了表 11中最快的上样组合，证实了通过理论动态载量表(表 9)推算出的变速上样组合表(表 11)具有实践意义。
3.3 Tricorn10/100柱子下的变速上样方案实践 3.3.1 Tricorn10/100柱子下的变速上样组合推算按照表 5，根据公式Q=CV/t计算得到不同保留时间下的体积流速。其中CV为柱体积7ml；t为表 8的保留时间，计算结果如表 14。| Q1 | 5.8 | 5.4 | 5.0 | 4.7 | 4.4 | 4.1 | 3.9 | 3.7 | 3.5 | 3.3 | 3.2 |
| Q2 | 2.8 | 2.6 | 2.4 | 2.3 | 2.1 | 2.0 | 1.9 | 1.8 | 1.7 | 1.6 | 1.6 |
| Q3 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
根据2.2.3 的变速上样组合推导方法，细胞培养澄清液(浓度0.62 g/L)在Tricorn10/100规格MabSelect柱(7 ml)上样至满载的变速上样组合见表 15。
 | 1.2 | 1.3 | 1.4 | 1.5 | 1.6 | 1.7 | 1.8 | 1.9 | 2.0 | 2.1 | 2.2 |
| 2.5 | 70.5 | 71.3 | 72.6 | 74.3 | 76.3 | 78.7 | 81.5 | 84.5 | 87.8 | 110.3 | 95.1 |
| 2.7 | 69.6 | 70.1 | 71.0 | 72.4 | 74.2 | 76.4 | 78.8 | 81.6 | 84.7 | 88.1 | 91.6 |
| 2.9 | 69.9 | 70.1 | 70.7 | 71.8 | 73.3 | 75.2 | 77.5 | 80.0 | 82.9 | 86.0 | 89.4 |
| 3.1 | 71.3 | 71.1 | 71.5 | 72.2 | 73.5 | 75.1 | 77.1 | 79.4 | 82.1 | 85.0 | 88.3 |
| 3.3 | 73.5 | 73.0 | 73.0 | 73.5 | 74.5 | 75.8 | 77.6 | 79.7 | 82.1 | 84.9 | 87.9 |
| 3.5 | 76.4 | 75.5 | 75.2 | 75.4 | 76.1 | 77.2 | 78.7 | 80.6 | 82.8 | 85.4 | 88.3 |
| 3.7 | 79.8 | 78.6 | 78.0 | 77.9 | 78.3 | 79.1 | 80.4 | 82.0 | 84.1 | 86.4 | 89.1 |
| 3.9 | 83.5 | 82.0 | 81.1 | 80.7 | 80.8 | 81.4 | 82.4 | 83.8 | 85.6 | 87.8 | 90.3 |
| 4.1 | 87.5 | 85.7 | 84.4 | 83.7 | 83.6 | 83.9 | 84.7 | 85.9 | 87.5 | 89.4 | 91.8 |
| 4.3 | 91.6 | 89.4 | 87.9 | 86.9 | 86.5 | 86.5 | 87.1 | 88.0 | 89.4 | 91.2 | 93.3 |
| 4.5 | 95.8 | 93.3 | 91.4 | 90.1 | 89.4 | 89.2 | 89.5 | 90.2 | 91.4 | 93.0 | 95.0 |
| RT3(min) | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
根据以上的变速上样组合表可见，使用细胞培养澄清液(浓度0.62 g/L)在Tricorn10/100规格的MabSelect柱上样至满载的最短时间为69.6 min，也是使用“t1=1.2 min，t2=2.7 min，t3=6 min”的保留时间组合。
再次以满载80%的上样量进行测试，设计“t1=1.2 min，t2=2.7 min，t3=6 min”变速上样的试验方案，各阶段的上样条件见表 16。
| t(min) | DBC (mg/ml) | 80%柱载量 (mg) | 上样体积 (ml) | 线性速度 (cm/h) | 体积流速 (ml/min) | 上样时长 (min) | |
| t1 | 1.2 | 17.6 | 98.6 | 159.0 | 500 | 5.8 | 27.4 |
| t2 | 2.7 | 27.6 | 154.7 | 90.5 | 222 | 2.6 | 34.8 |
| t3 | 6 | 26.8 | 150.1 | －7.4 | 100 | 1.2 | －6.3 |
| Total | 242.1 |
t3阶段的上样量为负值，这也是由3.1.2 部分拟合曲线在4~8min保留时间下向下弯曲所致，因此，实验中执行t1+t2两阶段上样。根据表 16的试验方案，两阶段上样的等效保留时间为7/[(159.0＋90.5)/(27.4＋34.8)]＝1.7 min，而此时柱子的载量为(242.1 ×0.62)/7 ml = 21.4 g/L，等效于保留时间为6min时柱子80%的载量(26.8 ×80% = 21.4 g/L)。
同样，以“t=4 min保留时间，上样量=242.1 ml为条件”进行恒速上样对照试验，与上述“t1=1.2 min，t2=2.7 min”上样方案进行工艺比较。
3.3.3 Tricorn10/100柱子的变速上样与恒速上样实验结果比较变速上样与恒速上样实验结果如下。
| 上样模式 | 保留时间 (min) |
实际上样量 (ml) |
洗脱体积 (ml) |
洗脱浓度 (mg/ml) |
回收率 (%) |
单体 纯度 (%) |
工艺时间 (min) |
| 变速上样 | 1.2 | 159 | 17.9 | 7.91 | 95% | 94.0 | 158 |
| 2.7 | 81 | ||||||
| 恒速上样 | 4 | 241.7 | 28.1 | 5.24 | 98% | 95.9 | 236 |
由图 5可见，在相同上样量的情况下，两种上样模式的上样过程中细胞上清液流穿的OD280曲线一致。
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| 图 5 上样阶段OD280对照图 Fig. 5 Chromatogram comparison of loading part Blue: dual flowrate; Red: constant flowrate |
由图 6可见，变速上样模式下，1.2 min和2.7 min保留时间上样阶段的柱压都比恒速4 min保留时间上样阶段的柱压稍高，但都小于0.12 MPa，是Tricorn 10/100层析柱及填料耐受的工作压力范围内。说明该变速上样组合的两个流速可以运行。
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| 图 6 上样阶段柱压对照图 Fig. 6 Column pressure comparison of loading part Red: flowrate; Blue: constant flowrate |
由图 7可见，两种上样模式下的纯化全过程，除了上样时间不同，上样及洗脱效果基本一致，变速上样方案的总工艺时间也有明显缩短。
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| 图 7 Tricorn10/100柱变速上样和恒速上样层析曲线比较 Fig. 7 Full chromatogram comparison Red curve for dual flowrate; Blue curve for constant flowrate |
由上述结果可见，细胞澄清液在Tricorn10/100柱上用保留时间为“1.2 min＋2.7 min”的变速上样组合进行的纯化实验，与用4 min保留时间的恒速上样条件进行的纯化比较，在相同的上样量，也获得了相近的纯化效果和回收率，但整体工艺时间从236 min减少到158 min，有33%的提升。该纯化实验也是使用了理论动态载量表(表 9)推算出的变速上样组合表(表 15)中最快的上样组合，证实了变速上样在实际的Protein A亲和层析工艺中也具有实践意义。
4 结 论随着中国抗体药物产业化的不断发展，上游培养规模和抗体表达量的不断提高，下游纯化环节的处理能力已成为制约产能提升的瓶颈。以目前广泛使用的亲和层析介质(MabSelect等)为例，其价格昂贵，且动态载量(Dynamic Binding Capacity,DBC)普遍较低(＜40 g/L)[8, 9]；同时，层析柱规模不能无限放大，这些将对产能的放大存在限制。为了提高产能，过去的纯化工艺设计思路均倾向于追求高动态载量来提高层析填料的利用率，强调增加保留时间的重要性，这不可避免地增加了上样时间，延长工艺周期。
变速上样的方法提供了一种新的提升工艺效率的思路。在上样的初始阶段，由于层析填料没有结合蛋白，配基全部处于游离状态，捕获能力较强，能以较短的保留时间(较快流速)进行上样；当上样到一定体积后，填料表面大部分配基已经与蛋白相结合，继续捕获蛋白的能力下降，此时增加保留时间可以使抗体进入填料内部与配基结合以提高填料的载量；最后，为了最大化利用层析填料，将保留时间恢复到常用条件。通过不同保留时间的上样组合，可以提高整体的平均上样速度，达到缩短总体上样时间，提升工艺效率的目的。
尽管本研究中的拟合方程计算得到的理论载量不能完全符合实测值，并且拟合曲线的局部向下弯曲还带来了恒速上样阶段的负上样量，但细微的偏差不影响理论变速上样方案的推导，不同的项目案例在拟合曲线和方案推导的结果也会有所不同。在3.2.2 与3.3.2的实验方案中，我们看到“t1=1.2 min，t2=2.7 min”的变速上样组合的上样速度等效于1.7 min保留时间的上样速度；同时，其载量等效于6min保留时间的载量。在这种速度与载量等效的情况下，变速上样带来的工艺效率提升的效果是显著的。
我们在两个规格的层析柱上都以最快的上样组合实现了工艺效率的提升，证实了变速上样的可行性。结果表明变速上样在提高工艺效率的同时，还能保证载量不会降低。这提示我们可以利用变速上样的方法去寻找既能满足最大动态载量又能提高工艺效率的上样方案。对于放大的工艺，受硬件条件的限制，如系统压力、层析柱反压等，不一定都能在最快的上样组合下实施工艺，但是可以通过测试去选择符合系统条件的上样组合实施。例如，当选择最佳上样方案时，若因层析柱反压过大或者接近填料的最大耐受压力而无法实施，我们可以调整选择变速上样组合表中其余任意一个组合条件。可以预测，无论选择何种组合，与恒速上样相比，都可以同时满足载量和效率的要求。因此，对于生产规模的工艺，我们可以推论，只要通过同样的方式对实际的工艺条件，如细胞澄清液的抗体含量、层析柱规格等，推算出对应的上样组合表，再测试选择符合实际系统硬件条件的变速上样组合，就能够获得一个提升工艺效率的变速上样方案。最后，再通过工艺验证并评估效率提升的效果去确定是否值得采用。
在protein A亲和层析应用中，变速上样的策略与传统的恒速上样相比有很大的优势。变速上样提供的等效保留时间与等效载量有很大的灵活性，可以根据硬件设备和工艺设计要求得到相应的上样组合。这也提示我们或许可以采取更多步骤的流速改变，甚至是持续变速上样进行工艺操作上的优化，但这也需要进行更多复杂的计算、参数优化以及硬件性能的配合，其可行性及应用价值可以进一步探索。
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