2,3-BD是一种无色、无味的液体，在化工、食品、能源、医药等领域都有着广泛的应用^{[1, 2, 3]}。2,3-BD合成方法主要有化学合成法和微生物发酵法。但是化学法不仅工艺条件要求苛刻，而且生产成本相对较高，又容易对环境造成污染。而微生物发酵法利用可再生的生物质资源发酵生产2,3-BD，不仅条件温和、操作简单，而且原料廉价可再生，因此引起了全国乃至全世界的广泛关注^{[4, 5]}。

目前，虽然克雷伯氏菌(Klebsiella) ^{[6, 7]}，产气肠杆菌(Enterobacter)^[8]，粘质沙雷氏菌(Serratia)^[9]经过补料流加发酵，2,3-BD产量已达到110g/L以上，但因为其自身生理特征的局限性还不符合工业化安全生产的要求，因而挑选符合生产要求的安全菌株至关重要。本实验室保藏了一株用来生产2,3-BD的安全菌株Bacillus subtilis 168，但是生产2,3-BD的能力相对较弱。枯草芽孢杆菌合成2,3-BD的代谢途径如图 1所示，葡萄糖首先经过糖酵解途径(EMP)和PPP 途径生成丙酮酸，再经α-乙酰乳酸、AC最终转化为2,3-BD。有研究报道，最后一步AC转化为2,3-BD不仅需要ACR的催化，同时也需要辅酶NADH的参与 ^{[10, 11]}。近年来，通过代谢工程手段对2,3-BD合成菌株进行代谢改造已有不少报道，但这些研究主要集中在两个方面，一是过量表达2,3-BD合成途径关键酶，Li等^[12]成功地将2,3-BD合成支路的基因alsS和alsD以及acr导入到E.coli中进行异源表达，葡萄糖消耗速率得到了提高，但2,3-BD产率只有0.43g 2,3-BD/g葡萄糖；李秀鹏^[13]将来源于枯草芽孢杆菌的ACR基因acr导入到B. subtilis168中进行同源表达，2,3-BD产量和转化率都得到了相应提高；二是弱化副产物支路，Jung等^[14]以产气肠杆菌为出发菌株，敲除了乳酸脱氢酶的编码基因ldhA,与出发菌株相比，减少了乳酸的生成，同时2,3-BD的产量提高了16.7% ；Ji等^[7]敲除了Klebsiella oxytoca中乙醇合成途径中关键酶乙醇脱氢酶的基因，能够显著降低乙醇的产量，促使更多的碳源流向 2,3-BD 合成途径，2,3-BD 的产量得到了提高，2,3-BD的生产效率达到了1.63g/L·h。而通过调控PPP途径通量和辅酶水平，研究其对2,3-BD合成的反馈作用还未见报道。

本研究首次尝试通过Cre/lox体系^[15]弱化PPP中的关键酶G6PDH的基因zwf，使碳代谢更多地流向EMP途径，来增强胞内的NADH水平(图 1)，提高2,3-BD的产量。为了进一步提高2,3-BD的生产能力，降低乙酸、乳酸等有机酸的积累量，后期研究了几个不同来源的ACR基因在B.subtilis168中的克隆表达情况，结果发现，来源于克雷伯氏菌ACR的相对酶活力最高，将此来源的ACR基因kphs导入到已成功构建的重组弱化菌株B.subtilis168△zwf中加强表达，通过同时增强胞内辅酶NDAH水平和ACR酶活力的双重效应提高2,3-BD产量和生产效率。

图 1 2,3-BD代谢途径 Fig. 1 Metabolic pathway of 2,3-BD E: ACR

图选项

菌株Bacillus subtilis 168，B. subtilis 168/pMA5-acr由本研究室保藏，质粒p7Z6，表达载体pMA5由本研究室保藏。

质粒小量制备试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；葡萄糖-6-磷酸、NADH、NADP⁺购自Sigma Aldrich公司；抗生素、PCR引物等购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR相关酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司。

LB培养基，种子培养基，发酵培养基见参考文献[16]。

根据NCBI中来源于枯草芽孢杆菌G6PDH基因zwf(Gene ID: 938690)的基因序列位置，选择其上下游各1 000bp的一段基因为模板，分别设计引物，通过PCR扩增分别得到两个基因片段。同时以质粒p7Z6模板，设计引物PCR扩增获得博来霉素抗性基因zeo。再将这三段基因进行重叠延伸PCR扩增出一段大小为2.6kb的重组基因片段(图 2)，由上海生工生物有限公司测序验证正确后，按照文献[17, 18]方法直接将此片段转化至B. subtilis 168中，经过博来霉素抗性平板筛选，得到阳性转化子，菌落PCR验证正确。

图 2 重组基因片段的PCR扩增 Fig. 2 PCR amplification of recombinant gene M1: λ-Hind Ⅲ marker; 1: PCR products

图选项

根据NCBI中来源于克雷伯氏菌的ACR基因kphs(Gene ID: 11848062)，粘质沙雷氏菌的budC(Gene ID: 11848062)，谷氨酸棒状杆菌的ncgl(Gene ID:2827943)的基因序列进行相关引物设计。通过PCR扩增得到相关基因片段，与克隆载体pMD18-T进行连接，转化E. coli JM109，挑取阳性转化子。提取质粒酶切验证后，送往上海Sangon公司测序。测序验证正确的重组质粒用BamH I与Mlu I双酶切，再连接到经过相同酶切的载体pMA5上，最终得到表达载体pMA5-kphs，pMA5-budC，pMA5-ncgl。将构建成功的重组表达载体分别转化至B.subtilis 168中，并进行酶切验证。验证正确的重组菌分别培养，并进行ACR酶活力测定和SDS-PAGE分析。蛋白含量采用Bradford法^[19]测定，以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白。

来源于克雷伯氏菌的ACR相对酶活力最高，因此，将重组表达载体pMA5-kphs转化至弱化菌株B. subtilis168△zwf中，用卡那霉素筛选阳性重组子，酶切验证得到重组菌株B. subtilis 168△zwf/pMA5-kphs。

1.6 ml反应体系：5 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，1 mmol/L NADP⁺，50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。G6PDH催化PPP途径中的第一步反应，将葡萄糖-6-磷酸还原成6-磷酸葡萄糖酸-δ-内酯，同时将1分子NADP⁺转变成NADPH。根据在340 nm下NADPH吸光值的增加量计算酶活力，酶活力单位定义：每分钟生成1 mmol/L NADPH所需的酶量^[20]。

乙偶姻还原酶，又称2,3-BD脱氢酶，简称ACR(E.C.1.1.1.4 )。ACR属于氧化还原酶类，它能够在NADH存在的情况下催化AC生成2,3-BD，同时也能够在 NAD⁺存在的情况下催化2,3-BD逆向转化为AC。1 ml还原方向反应体系：0.1 mol/L AC和0.2 mmol/L NADH，50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.5)。根据在340 nm下NADH吸光值的变化测定酶活力，酶活力单位定义：每分钟消耗或生成1 μmol NADH所需要的酶量^{[21, 22]}。

通过上海索宝生物科技有限公司购置的检测试剂盒对胞内NADPH水平进行检测，通过AATBioquest购置的检测试剂盒对胞内NAD⁺/NADH水平进行检测，具体方法见试剂盒说明书。

重组菌株B.subtilis168△zwf，B.subtilis168△zwf/pMA5-kphs和出发菌株B. subtilis 168，经过LB液体培养基活化12 h后，按照4%的接种量转接至发酵培养基中，发酵的初始pH 6.5。发酵过程中定期取样监测菌体生长、葡萄糖含量、2,3-BD、AC和相关有机酸的含量，底物耗尽后结束发酵。

OD₆₀₀，葡萄糖、2,3-BD、AC和有机酸含量的测定见参考文献[16]。

以B. subtilis168的全基因组DNA为模板，按照方法1.2所述，扩增得到一段大小为2.6 kb的重组基因片段(图 2)，直接将此片段转化至B. subtilis 168中，经过博来霉素抗性平板筛选，得到的阳性转化子，并通过菌落PCR验证正确。根据1.5中G6PDH酶活力测定方法，弱化重组菌株B. subtilis 168△zwf几乎测不到G6PDH的酶活，进一步说明弱化菌株已成功构建。

根据1.3所述方法构建了重组质粒pMA5-kphs，pMA5-budC，pMA5-ncgl，重组质粒经过单双酶切验证，结果表明三个重组载体都已构建成功(图 3)。

图 3 重组质粒的酶切验证 Fig. 3 Identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion 1:pMA5-kphs/BamHI;2:pMA5-kphs/BamHI+MluI;3:pMA5-ncgl/BamH I; 4: pMA5-ncgl/BamH I+Mlu I; 5: pMA5-budC/BamH I; 6: pMA5-budC /BamH I+Mlu I;M1: λ-Hind Ⅲ marker; M2: DL2000 marker

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将验证正确的重组表达载体pMA5-kphs，pMA5-budC，pMA5-ncgl分别转化至表达宿主B. subtilis168中，在LB液体培养基中过夜培养后，用pH 7.0的磷酸钠缓冲液悬浮细胞，离心收集菌体，超声破碎后，对上清进行SDS-PAGE分析和验证。与对照组相比，B.subtilis168/pMA5-kphs，B.subtilis168/pMA5-budC两株重组菌的破细胞上清分别在26-27kDa处有一条明显特征条带，表明ACR在这两株重组枯草芽孢杆菌中成功表达，而重组菌B. subtilis168/pMA5-ncgl看不到明显的目的条带(图 4)，其中以原始菌B. subtilis168作为对照；测定破碎上清ACR的酶活力，发现来源于克雷伯氏菌，粘质沙雷氏菌和枯草芽孢杆菌ACR的相对酶活力比原始菌分别提高了11.2倍，3.9倍和2.5倍，而来源于谷氨酸棒杆菌ACR的相对酶活与原始菌比较没有明显变化(表 1)。

图 4 重组菌的全细胞蛋白SDS-PAGE电泳图 Fig. 4 SDS-PAGE analysis of proteins in whole cells M:Protein marker ;1:B. subtilis168/pMA5-budC; 2: B. subtilis168/pMA5-ncgl;3: B. subtilis168/pMA5- kphs; 4:B. subtilis168

图选项

从表 1得知，来源于克雷伯氏菌ACR的相对酶活力最高，因此按照1.4中方法将重组表达载体pMA5-kphs转化至PPP途径弱化菌株B. subtilis168△zwf中，并进行单双酶切验证(图 5)，证明重组菌株B. subtilis168△zwf/pMA5-kphs构建成功。分别对其G6PDH和ACR的酶活进行验证，其中G6PDH几乎测不到酶活，而ACR还原方向相对酶活力为180±6.4 mU/mg。

图 5 重组质粒pMA5-kphs的酶切验证 Fig. 5 Identification of the recombinant plasmid pMA5-kphs by enzyme digestion 1: pMA5-kphs/BamH I; 2: pMA5- kphs/BamH I+Mlu I;M1: λ-Hind Ⅲ marker; M2: DL 2000 marker

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将出发菌株B. subtilis168和重组菌株B. subtilis168△zwf进行摇瓶发酵试验。由图 7，图 8可知，在生长前期，重组菌B. subtilis168△zwf的糖耗速率与原始菌B. subtilis168比较略有下降，弱化了基因zwf，PPP途径的碳流减少，使得糖耗速率略有下降，而重组菌株生长与出发菌B.subtilis168相比基本没有受到影响，原因可能是EMP途径和TCA循环仍正常进行，所以弱化菌株的生长并没有受到影响。由图 8可知，前期B. subtilis168△zwf的NADH水平与出发菌B.subtilis168相比略有提高，PPP途径弱化后，代谢更多地流向了EMP途径，胞内的NADH水平得到了增强。从图 9可知，B. subtilis168△zwf较之出发菌胞内的NADPH水平明显下降，G6PDH能催化胞内NADP⁺转化为NADPH，弱化了G6PDH基因zwf后，则使胞内NADPH水平明显下降。

图 6 发酵过程中OD的曲线 Fig. 6 Curves of OD in fermentation

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图 7 发酵过程中糖耗曲线 Fig. 7 Curves of glucose consumption in fermentation

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图 8 发酵过程中NADH的曲线 Fig. 8 Curves of NADH in fermentation

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图 9 原始菌与PPP途径弱化后胞内NADPH比较 Fig. 9 Intracellular NADPH concentrations in B. subtilis 168 and B. subtilis168△zwf

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发酵液中2,3-BD和有机酸的测定结果表明，发酵72 h时，重组菌株B. subtilis168△zwf 2,3-BD的产量达到了最大值26.8 g/L，与出发菌相比，提高了15.0%，摩尔转化率达到了45%，副产物AC降低了10.6%。PPP途径弱化后，代谢更多地流向EMP途径，提高了胞内NADH的含量，促进了AC到2,3-BD的转化，提高了2,3-BD的产量，同时降低了副产物AC的积累量。对出发菌B. subtilis168和重组菌株B. subtilis168△zwf发酵液进行有机酸测定分析，与出发菌相比，重组菌株B. subtilis168△zwf发酵液中主要副产物乙酸、乳酸、琥珀酸的积累量却得到了提高，也有研究报道提高NADH的水平，乳酸和乙酸都得到加强^[16]，PPP途径弱化后，胞内NADH水平增强，导致依赖于NADH的支路得到加强。

通过弱化PPP途径，不但提高了2,3-BD产量，同时主要副产物乙酸、乳酸等产量也得到提升，为了进一步提高2,3-BD支路对NADH的竞争力，在PPP途径弱化的基础上，加强ACR的表达，以期实现提高2,3-BD产量，同时降低副产物乙酸、乳酸等的积累量。

从图 6可知，重组菌株B. subtilis168△zwf/pMA5-kphs与出发菌B. subtilis168相比生长量有所下降，可能是因为外源质粒的导入导致ACR过量表达，加重了菌体生长的负担，生长受到抑制。由图 7可知，在菌体生长前期(0~24h)，糖耗速率较之出发菌株，重组菌株B. subtilis168△zwf/pMA5-kphs利用葡萄糖的速率稍低；菌体生长的后期(24 h~72 h)，重组菌B. subtilis168△zwf/pMA5-kphs利用葡萄糖的速率显著提高，当后期菌体开始大量合成2,3-BD后，细胞对碳源的需求大大增加，加速了葡萄糖的消耗，使得糖耗速率显著提高。从图 8可知，前期重组菌株B. subtilis168△zwf/pMA5-kphs NADH水平与出发菌相比略有提高，但后期重组菌株B. subtilis168△zwf/pMA5-kphs NADH水平有所下降，由于弱化了PPP途径的关键酶G6PDH基因zwf，代谢更多地流向EMP途径，使得前期NADH水平有所提高，而后期过量表达的ACR促进了AC向2,3-BD的转化，NADH参与合成2,3-BD而被大量消耗。

发酵液中2,3-BD和有机酸的测定结果显示，重组B. subtilis168△zwf/pMA5-kphs 2,3-BD的产量达到了最大值为 32g/L，与出发菌相比，提高了37.3%，摩尔转化率达到了53%，副产物AC降低了28.1%。重组菌株B. subtilis168△zwf/pMA5-kphs发酵液中副产物乙酸、乳酸、琥珀酸分别降低了25.2%、21.2 %、26.5%。原因可能是弱化zwf提高了细胞内NADH水平，细胞内有机酸积累比原始菌株积累量有所提高，但kphs基因的过量表达提高了胞内ACR酶活力，进而提高了该支路对NADH的竞争力，因此减弱了其他依赖于NADH的乳酸、乙酸和琥珀酸支路的代谢通量，从而导致了相关支路有机酸积累量也相应减少。

图 10 发酵过程中NAD+的曲线 Fig. 10 Curves of NAD+ in fermentation

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图 11 发酵过程中NADH/NAD+的曲线 Fig. 11 Curves of NADH/NAD+ in fermentation

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图 12 发酵过程中2,3-BD的曲线 Fig. 12 Curves of of 2,3-BD in fermentation

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图 13 发酵过程中乙偶姻的曲线 Fig. 13 Cuves of AC in fermentation

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本研究以安全菌株B. subtilis168为出发菌株，首次通过Cre/lox体系^[15]弱化了PPP途径关键酶G6PDH的基因zwf，构建了重组菌株B.subtilis168△zwf，对其进行摇瓶发酵实验，与出发菌株相比，胞内辅酶NADH水平得到了增强，2,3-BD产量提高了15.0%，摩尔转化率为45%，主要副产物AC积累量下降了10.6%，但乙酸、乳酸、琥珀酸等有机酸的积累量提高。为了提高2,3-BD产量和生产效率，对重组菌株B. subtilis168△zwf作了进一步的分子改造。通过比较不同来源的ACR在B.subtilis168中的克隆表达情况，发现来源于克雷伯氏菌的ACR相对酶活力最高，因此将成功构建的重组质粒pMA5-kphs导入到重组菌株B. subtilis168△zwf中进行加强表达，获得了一株PPP途径弱化，且ACR酶活力增强的重组菌株B.subtilis168△zwf/pMA5-kphs，通过摇瓶发酵实验，与出发菌相比，2,3-BD产量提高了37.3%，摩尔转化率达到了53%，主要副产物AC积累量下降了28.1%，同时乙酸、乳酸等分支路径的其他副产物也有不同程度的降低。