化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)又称A族链球菌(Group A Streptococci，GAS)，是一种可引起从普通非侵袭性疾病如咽炎、猩红热、脓疱病到侵袭性和严重侵袭性疾病如风湿热、链球菌感染性肾小球肾炎、坏死性筋膜炎、中毒休克综合征等疾病的常见人类专性致病菌^[1]。在链球菌感染的疾病中，约90%是由GAS引起的^[2]。据统计，全球每年由GAS感染所引起的急性咽炎和皮肤病高达8亿多例，而至少有51.7万人死于GAS感染引起的严重疾病，GAS感染与并发症一直是困扰公共健康的严重问题^[3]。调查显示，GAS感染流行周期约3～5年^[4]，因此，加强对GAS致病机理与诊断的研究，对于预防与治疗GAS感染具有非常重要的积极意义^{[5, 6]}。

GAS感染及感染后的变态反应与多种毒力因子有关，其中GAS产生的链球菌溶血素O(streptolysin O，Slo)能够使细胞膜产生大的孔道，毒蛋白进入细胞质，对细胞产生毒性作用^[7]，因此，Slo被认为是一种重要的外毒素^[8]。此外，Slo具有极强的抗原性，感染化脓性链球菌后2～3周内，85%以上病人会产生Slo抗体，病愈后可持续数月甚至数年；并且，在风湿热、强直性脊柱炎等疾病患者血清中也存在较高滴度Slo抗体，血清中抗链球菌溶血素O(anti-streptolysin O，ASO)的测定可广泛应用于与链球菌感染有关的疾病如肾小球肾炎、猩红热、扁桃体炎、风湿热及链球菌感染后反应性关节炎等的診断中^{[9, 10]}。制备有效的检测患者血清中Slo抗体的Slo抗原，对于鉴别诊断链球菌感染相关疾病以及疗效评价具有重要价值。

实验所用菌株化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes,M1 type)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus)、猪链球菌(Streptococcus suis)和表达宿主菌株E.coli BL21(DE3) (本实验室保存)，表达质粒pET101(氨苄青霉素抗性，购自Invitrogen公司)。

PVDF 膜，购自Bio-Rad公司 ；羊抗大鼠IgG-AP购自博士德生物工程有限公司；NBT、BCIP、PNPP、弗氏完全佐剂购自Sigma公司；链球菌Tod-Hewitt培养基购自BD公司。蛋白纯化Ni-NTA琼脂糖凝胶购自康为生物科技有限公司；超滤管购自Millipore公司；大肠杆菌超声破碎液：2 mmol /L EDTA，100 μg /ml 溶菌酶，0.1% Triton X-100，100 mmol /L NaCl，50 mmol /L Tris-HCl，pH 8.0；变性液：20mmol/L PB(pH7.0)，8mol/L尿素，10mmol/L DTT；复性液：50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，20%甘油；TBST：20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween-20 ，pH7.2；封闭液：5%BSA的TBST溶液；显色液：9.5ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH10)，40μl 1mmol/L MgCl₂，0.5ml，5mg/ml NBT，0.2ml 1mg/ml BCIP；缓冲液配制所用试剂均为国产分析纯。

链球菌THY液体培养基：3%Tod-Hewitt，0.2%酵母提取物；大肠杆菌 LB 液体培养基：1% 胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，按需要添加100μg/ml的氨苄青霉素。

化脓性链球菌DNA的提取按北京天根生物技术公司革兰阳性DNA纯化试剂盒指导进行。引物设计用Vector NTI Advance^TM 11软件完成。目的基因片段与载体的连接均根据Invitrogen公司 pET101/D-TOPO的说明书指导进行。相关生物信息及分析采用NCBI和SMART等数据库中软件完成。PCR扩增化脓性链球菌slo基因活性结构域DNA片段引物：ZE470：5′-CACCATGCACACTGAAGAAATCAATGAC-3′；ZE471：5′-ATAA GTAA TCG AACCATATG GGCTC-3′

将构建的基因工程菌接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜后，转接到新鲜LB培养基，37℃震荡培养到OD₆₀₀值0.5左右时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导4h后离心，收集菌体，进行SDS-PAGE电泳鉴定。

采用参考文献[11]的方法，离心收集菌体，菌体洗涤 3 次，加大肠杆菌超声破碎液重悬菌体，超声处理破碎菌体，离心收集包涵体沉淀，2M的尿素洗涤沉淀，用变性液溶解包涵体沉淀。利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化，操作步骤按照康为公司的Ni-NTA琼脂糖凝胶操说明书进行，纯化蛋白经12% SDS-PAGE电泳鉴定。取纯化蛋白变性溶液逐滴滴加到复性液中，滴加过程中不断搅拌，稀释20倍后置于4℃冰箱24h进行复性，再利用Millipore超滤管浓缩蛋白溶液后备用。

采用参考文献[12]的方法并稍作修改，取兔血红细胞，经生理盐水洗涤2次后，配置成2%的红细胞悬液。取等体积的蛋白复性液与红细胞混匀，37℃处理2h，200g离心2min后取上清，测定540nm处的吸光值。以复性溶液为阴性对照组，蒸馏水为阳性对照组，加入终浓度为25mg/L的胆固醇为抑制剂组。

对参考文献[13]稍作修改，将纯化后的重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀，按200μg蛋白/只的剂量皮下注射SD大鼠；1 周后，按蛋白质与等体积弗氏不完全佐剂混匀，相同剂量进行第2次注射；之后每周进行一次注射，第四次免疫1 周后采血，分离血清，500μl/管分装，4℃保存备用。ELISA 检测抗体效价，以未进行免疫的鼠血清作为阴性对照。

将浓度为 10μg/ml重组蛋白，按每孔100 μl加入到酶标板，放置4℃过夜。TBST洗 3 次。然后每孔加入200μl封闭液37℃孵育1 h。洗液洗 3 次后，每孔加入100 μl不同稀释度的多克隆抗血清(1：100；1：200；1：400；1：800；1：1 600；1：3 200；1：6 400和1：12 800)，相同稀释浓度的未免疫大鼠血清作对照，37℃孵育1h ，洗液洗3次，每孔加入100 μl羊抗大鼠 IgG(1：8 000) 溶液，37℃ 孵育 1 h洗液洗涤3次后每孔加入 100μl新鲜的 PNPP 显色液，室温反应一定时间，酶标仪测定 405nm吸光值。

参照文献[14]中的方法，分别将化脓性链球菌、马链球菌、猪链球菌接种于THY培养基中培养12h后转接，再培养至对数晚期后离心取上清，10%的三氯乙酸沉淀上清中的蛋白，蛋白样品经12% SDS-PAGE电泳后，采用湿法转印将蛋白转印到PVDF膜上，加封闭液，室温缓慢振摇1h；弃封闭液，用PBST液洗3次，用1：800实验所制备的抗Slo大鼠血清孵育1h，TBST液洗膜3次，加1：5 000稀释的羊抗大鼠IgG-AP室温孵育1h，TBST洗膜3次；最后用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂显影，PVDF膜干后用HP扫描仪扫描图片。

通过生物信息分析结果发现，化脓性链球菌 SF370(M1 type)溶血素O(slo)基因阅读框架由1 716 bp 组成，编码571个氨基酸； Slo蛋白结构预测分析显示，Slo蛋白N端有一个由19个氨基酸残基(V₁₃-A₃₁)组成的跨膜结构域(Transmembrane Domain)；Slo蛋白的溶血素活性结构域Thiol_cytolysin由466个氨基酸残基组成(图 1a)。 有研究者已证实，Slo蛋白全序列能够被克隆并在大肠杆菌中表达，且表达的重组蛋白能够被Slo抗体识别^[9]。考虑到抗原决定簇是由少量的几个氨基酸残基组成，抗原蛋白分子越大，所制备的多克隆抗体发生交叉反应可能性越大，特异性越差，同时Slo蛋白质的跨膜结构域存在，可能会影响部分表达蛋白在细胞内的位置。因此，本研究将获得的Slo重组蛋白去掉N端包括跨膜结构域内的104个氨基酸，只保留溶血活性结构域Thiol_cytolysin的466个氨基酸。图 1b 为1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增slo基因活性结构域DNA片段的结果，该片段约1 400bp，符合预期。pET101质粒为5 753bp，连接上PCR产物后重组质粒约为7 000bp，表明连接成功(图 1c)。融合表达Slo活性结构域的基因工程经诱导表达，SDS-PAGE电泳结果图 1-d-Recombinants所示，在相对分子量50 kDa附近，出现了一条被考马斯亮蓝染色染得非常深的蛋白质条带，蛋白含量分析结果显示，重组蛋白占菌体总蛋白30%以上。理论上分析，Slo蛋白分子量约为65 kDa，在构建表达菌株过程中，只保留蛋白分子量为52 kDa的具有溶血活性的Thiol_cytolysin结构域，电泳结果显示重组蛋白的分子量约50 kDa左右，符合预期。

图 1 化脓性链球菌溶血素O活性结构表达载体的构建与重组蛋白的表达 Fig. 1 Construction of the expression the Thiol_cytolysin domain plasmid and recombinant protein strains (a) Structure of the Streptolysin O (b)Electrophoresis analysis of the PCR products of the slo thiol_cytolysin domain (c) Electrophoresis analysis of the recombinant plasmid (d) Analysis of the expression of recombinant proteins by SDS- PAGE in the recombinants TM: Mransmembrane domain; M: Maker;1: PCR products of the slo thiol_cytolysin domain; pET101-Slo: recombinant plasmid; Recombinants: Expression recombinant protein strains

图选项

纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳分析，结果显示蛋白纯度较好(图 2a)。尿素溶解后纯化的重组蛋白质，需要进行复性。目前蛋白复性方法主要有透析和稀释两种，在实验过程中发现，透析复性Slo重组蛋白耗时长、步骤繁琐、易发生蛋白沉淀。稀释复性相对而言操作简便，可缩短实验时间，但获得溶液中的蛋白浓度相对较低，可进一步通过盐析或超滤等手段，获得较高浓度的复性蛋白。

图 2 Slo重组蛋白的纯化与溶血活性检测 Fig. 2 Purification of Slo recombinant proteins and Hemolysis test (a) SDS-PAGE analysis of the purified recombinant proteins (b) Hemolysis test of the recombinant protein M: Maker; 0: Purified recombinant proteins; 1: Positive contol ; 2: Hemolysis activity of recombinant proteins; 3: Hemolysis activity of recombinant proteins and cholesterol; 4: Negative control

图选项

对复性后重组Slo蛋白进行溶血活性分析证明，该蛋白具有较强的溶血活性(图 2b)，图 2b中的2为重组蛋白溶血活性，图 2b中的3为重组蛋白在2%的红细胞悬液中加入Slo活性抑制剂胆固醇后的溶血活性。比较图 2b的2与3可以看出，加入胆固醇后，Slo重组蛋白表现为溶血活性的降低。这是因为Slo首先与细胞膜上的胆固醇分子结合后才能发挥细胞融破作用^[15]，加入胆固醇后，Slo的结合能力会受到游离胆固醇的竞争性抑制，因此表现为溶血活性的降低。由此表明，实验所获得的重组Slo蛋白的确具有溶血活性，同时表明Slo蛋白N端104个氨基酸对于保持溶血活性可能并不是必须的，实验结果证实了Susanne等^[16]对Slo的三级结构研究后提出Slo的N端氨基酸不影响其毒性的推测。

取Slo免疫4次后的大鼠血清，稀释不同浓度(1：100~1：12 800)，以纯化的Slo蛋白作为底物，未进行免疫的大鼠血清作为阴性对照，以OD值大于或等于阴性对照的2.1倍时视为多克隆抗体阳性^[17]。Elisa检测结果显示多克隆抗体效价达到 1：12 800(表 1)，表明所制备的重组蛋白具有较强的免疫活性。

在链球菌中，化脓性链球菌大都属于A族β溶血链球菌，马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus)属于C族β溶血链球菌，猪链球菌(Streptococcus suis)属于D群链球菌。取化脓性链球菌，马链球菌，猪链球菌培养基上清，三氯乙酸沉淀分别制得化脓性链球菌，马链球菌，猪链球菌分泌蛋白，用实验获得的Slo重组蛋白多克隆抗体进行Western blot分析结果如图 3所示，只有化脓性链球菌的分泌蛋白中，有一大约分子量60kDa条带，Slo蛋白理论分子量约为62kDa，该条带位置与预期相符，表明去掉Slo的N端部分氨基酸仍能保留原有的免疫原性，刺激宿主产生抗体，产生的抗体也具有应有的抗原性。马链球菌和猪链球菌Western blot分析未出现条带，表明该抗体不能结合马链球菌和猪链球菌分泌的溶血素，表明本实验制备的Slo活性结构域多克隆抗体有一定的种属特异性。而已有研究表明猪链球菌能表达分子量54kDa左右的具有免疫活性的溶血素Sly(Suilysin)，Sly与Slo同为硫醇活性胆固醇结合细胞溶素家族^[18]。

图 3 Western blot分析不同链球菌溶血素蛋白结果 Fig. 3 Analysis of hemolysin by Western blot with the polyclonal antibody in culture supermentants of Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi ssp. zooepidemicus and Streptococcus suis 1: Recombinant protein; 2: Streptococcus equi ssp. zooepidemicus 3: Streptococcus suis 4: Streptococcus pyogenes

图选项

目前已有成功构建slo基因全阅读框架表达重组子的报道^[9]。国外研究者Hisashi等^[19] 利用阿拉伯糖操纵子表达系统表达了Slo的重组蛋白，该重组蛋白只去除了N端形成跨膜结构域的31个氨基酸残基，保留了540个氨基酸，分子量约为60kDa，而该重组蛋白是否有溶血活性也不得而知。本实验所构建重组蛋白表达载体，去除了Slo蛋白N端的104个氨基酸，只保留了Slo蛋白的活性结构域，所获得的重组蛋白质，虽然相对分子量减少大约13kDa，但表达的重组蛋白仍具有溶血活性与免疫原性，证明Slo蛋白的Thiol_cytolysin结构域确实为Slo蛋白的溶血活性和免疫原性所必需。本实验结果使我们有理由推测，Slo蛋白N端104个氨基酸的去除，可能会增强多克隆抗体的特异性，这也许就是用本实验获得免疫血清不能检测到马链球菌兽疫亚种和猪链球菌胞外分泌溶血素蛋白的原因。

Slo有广泛的应用前景，不仅可应用于与链球菌感染有关疾病以及链球菌感染后反应性关节炎等疾病血清中ASO的检验；还能利用它提高细胞膜通透性，将链球菌溶血素O溶液加入受体细胞中，给予一定的作用时间，即可达到通透效果。通过这种方法可使目的细胞抽提物的大分子蛋白质和核苷酸克服细胞膜的生物屏障，进入需要修复的受体细胞后可以发挥重编程作用，使受体细胞转变为目的细胞，这一策略为人造器官提供了新的种子细胞来源，为病损组织器官替代修复治疗提供了新思路 ^[20]。此外，Slo蛋白还可用于链球菌感染引起的肺炎的辅助治疗^[21]。目前，获得Slo可从天然培养中分离以及重组表达获得。天然培养分离是通过大规模培养化脓性链球菌获得其代谢产物再分离获得Slo，该方法最大的优点是得到的Slo为天然结构，但操作复杂且产量低。本研究结果为利用大肠杆菌表达系统大量获得既具有溶血活性，又具有特异性免疫活性的小分子Slo抗原奠定了基础。