结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤，在我国结直肠癌的发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第3位^[1]和第5位呈上升趋势^[2]，其发病率及发病年龄亦呈年轻化趋势^[3]。经大量的研究证实，CD133作为CSC的表面标记物是一个有助于结直肠癌临床诊断的重要指标^{[4, 5, 6, 7, 8, 9]}，常规的手术切除和辅助性化疗能够有效地提高生存率，但结直肠癌的肿瘤组织中仍存在着一小部分的耐放化疗的细胞，且其中CD133⁺亚群细胞具有更高的化疗耐药性^[10]。CD133的表达很广泛，在未分化和分化的结肠癌上皮细胞中均有表达^[11]。

新型非病毒基因载体在抗肿瘤治疗过程中有较好的体内递送作用，聚乙烯亚胺(PEI)和壳聚糖(chiston)是两种常见的修饰材料^[12],都能与细胞表面的蛋白多糖结合，通过内吞作用进入细胞。根据文献[13]证实，合成法制备的PEI修饰的壳聚糖(简称CP材料)在宫颈癌，非小细胞肺癌和肝癌的转染考察结果上，已表明具有较高的转染效率和良好的生物安全性，本实验采用合成法来制备PEI-壳聚糖新型材料，透析纯化后，与DNA形成带正电荷，粒径大小均一的复合纳米粒来对结直肠癌进行转染考察^[12]。

至今，随着越来越多的CD133功能及机制的揭示，CD133作为治疗新靶点的研究最为广泛^[14]。序列为TISWPPR的TR肽是通过噬菌体展示技术得到的与CD133具有高度亲和能力的短肽，TR肽(TISWPPR)^[15]能够特异识别结直肠癌细胞表面的CD133^[16]，因此，本研究将新型非病毒载体作用在CD133⁺梯度表达的结直肠癌细胞株上，初步验证CP材料在CD133⁺结直肠癌上的转染效率和生物安全性。合成CD133高度亲和力多肽连接到非病毒载体表面(CD133-PEI-壳聚糖)，介导纳米粒进入细胞，研究对结肠癌细胞的靶向作用，实现具有高效药物作用的靶点有效治疗结肠癌。以期为寻找合适的CD133⁺靶向材料降低其在结直肠癌上的表达奠定基础。

壳聚糖(玉环县天宝壳聚糖有限公司)，聚乙烯亚胺PEI25000(ALDRICH)，1640培养基(Hyclone 公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，虫荧光素酶测定试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)，其他试剂均为分析纯。质粒pGL3，EGFP (Promega 公司)。结肠癌细胞株SW480、HCT116、CaCO₂、SW620由分子表观遗传中心实验室提供，小鼠抗人CD133流式抗体、小鼠抗人CD133/1(W6B3C1)(Miltenyi公司),小鼠抗人β-actin、HRP标记山羊抗小鼠lgG(北京中杉金桥公司)。

将四种结直肠癌细胞株，SW480，HCT116，CaCO₂，SW620，用含10%胎牛血清的1640培养基，放在37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，每天换液，观察并记录生长状况，将4种结肠癌细胞(1×10⁷)细胞量分别用0.25%的胰酶消化，培养液终止消化，离心(800r/min,5min)后，弃去旧培养液，加100μl缓冲液(0.5%BSA、0.01%PBS、2mmol/L EDTA)洗涤，重悬，加入20μl FCR阻断剂，吹打后，加入10μl藻蓝蛋白(allophycocyanin APC)标志的小鼠抗人CD133单抗，4℃避光孵育10min，用0.01%PBS洗涤3次，100μl PBS重悬后上机检测。同时设计100μl加同型CD133抗体的为空白对照。

用快速RNA提取试剂盒，提取4种细胞的总RNA，用酶标仪在260nm的吸光度值，测定RNA的纯度及定量值。用逆转录试剂盒逆转为cDNA,PCR产物扩增：各取2μl cDNA，分别加入CD133特异性的上下游引物各1μl、2×Tap PCR Master-Mix 6μl和去离子水1μl，反应体系为10μl。引物CD133(113bp)5′-GAGTCGGAAACTGGCAGATAGCA-3′/5′-ACGCCTTGTCCTTCCTAGTGTTG-3′TM：65℃,GAPDH(224bp)5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′/5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。扩增结束后将10μl产物加样在2%琼脂糖凝胶样品孔中，放在0.5×TAE电泳缓冲液中(120V，30min)，凝胶成像系统照相记录实验结果。

将细胞小室放入24孔板内，每孔加700μl的含血清培养基，以1×10⁵个细胞数量加入细胞小室，加200μl无血清培养基在细胞小室孔内，培养36h.荧光显微镜下观察并计数。

称取1g壳聚糖溶于0.5%的醋酸溶液50ml，调pH为7.0，搅拌溶解至过夜。移至离心管离心，取上清10ml注射到圆底烧瓶中(烧瓶预先充满氮气，锡纸避光，磁力搅拌)，按照1∶2投料比加入CDI(溶于5ml DMSO)，针头注射，再加入200μl三乙胺作催化剂，磁力搅拌活化2h；按1∶3加入PEI(溶于5ml DMSO)，针头注射，按照反应速度，每6min加0.25ml，2h滴完后，再加入200μl三乙胺，过夜反应。将反应产物转入15万透析袋中，透析48h，分装EP管里，冷冻干燥，回收产物^{[12, 13]}；连接CD133多肽材料的合成，步骤同上。将CP与鱼精DNA按质量比W/W=1，2，4，8，10等体积混合，室温静置孵育30min，测定DNA含量为50μg，纳米粒体积稀释到3ml，ZETA-SIZER粒径测定仪测定CP/DNA粒径及电位。

将4种细胞消化离心后，计数，96孔板中每孔5 000个细胞，100μl含10%的胎牛血清的1640培养基中37℃细胞培养箱中培养过夜。CP/DNA按质量比=2，3，4，5，10配制纳米粒溶液^[12]，每孔含DNA 0.2μg。等体积混溶，静置孵育30min。酶标仪450nm波长处测定OD值。

4种结肠癌细胞，消化离心后，计数，以2×10⁴个细胞种入24孔板内，培养过夜，将CP/DNA按质量比=5时配制纳米粒溶液，lipofectamin2000^TM按说明书配制，每孔含DNA 1μg.等体积混溶，静置孵育30min。加入500μl新鲜不含血清1640培养基，每孔加入100μl纳米粒溶液，6h后，洗去旧培养液，每孔加500μl含胎牛血清的1640培养基。48h后，荧光倒置显微镜下观测结果。

4种结肠癌细胞，消化离心后，计数，以2×10⁴个细胞种入24孔板内，培养过夜，将CP/DNA按质量比=5时配制纳米粒溶液，lipofectamin2000^TM按说明书配制，每孔含DNA 1μg.等体积混溶，静置孵育30min。加入500μl新鲜不含血清1640培养基，每孔加入100μl纳米粒溶液，6h后，洗去旧培养液，每孔加500μl含胎牛血清的1640培养基。48h后，PBS清洗一次，按照虫荧光素试剂盒提示方法操作，在575nm处测定相对值。此后进行蛋白浓度的测定，代入标准曲线得蛋白含量并作图。

取对数生长期4种结肠癌细胞进行分组，PEI-壳聚糖组和C-PEI-壳聚糖组，转染48h后，常规方法提取细胞总蛋白，BCA法测定两组蛋白浓度，调整其蛋白浓度为5μg/μl，煮沸变性，取等量上述蛋白样品进行SDS凝胶电泳，转膜，然后室温封闭加入CD133一抗4℃孵育过夜，室温30min后洗膜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，经TBST洗膜后，采用ECL化学发光法显影。采用Quantity One 4.6.2.70 软件进行图像分析。

结果以x±s表示。用SPSS18.0软件对数据进行处理。运用t检验及单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

用CD133单克隆抗体检测4种结肠癌细胞株CD133⁺的含量，结果显示(图 1a)：SW620为0.56%,CaCO₂ 为2.00%,为低表达组；HCT116为92.96%，SW480为96.97%，为高表达组；RT-PCR结果与流式结果表达相对呈一致性，CD133⁺在4种结肠癌细胞株上呈梯度表达。

图 1 流式含量鉴定CD133+在4种结直肠癌细胞中的表达情况(a)和RT-PCR法检测CD133+的含量(b) Fig. 1 Identification and quantification of the CD133+ in four colon cells by flow cytometry (a) and Quantification of the CD133+ by Real Time RT-PCR (b)

图选项

肿瘤干细胞学说^[15]认为CD133是肿瘤发生、发展、侵袭、转移、复发及耐药的决定性因素，从图 2得出SW480、HCT116高表达CD133⁺组的细胞迁移能力明显高于SW620、CaCO₂低表达CD133⁺组。

图 2 4种结直肠癌细胞的迁移能力 Fig. 2 Migration ability in four colon cells

图选项

制备得到的纳米复合物的粒径在100nm左右，粒径分布系数PDI＜0.13，ZETA电位为18.6mV左右，包封率为91.46%；制备得到结肽的CP材料的粒径在134nm左右，粒径分布系数PDI＜0.15，ZETA电位为29.2MV左右，包封率为93.12%(表 1)。

按照Chitosan/DNA/PEI=10，5，4，3，2配制纳米粒溶液^[13]，由图 3可知，细胞存活率最高的是质量比=5时，在4种结肠癌细胞毒性最小。

图 3 不同质量比CP/DNA复合载体在四种结肠癌细胞上48h孵育后的细胞毒性 Fig. 3 Cytotoxicity of CP/DNA complex at various w/w ratios in four colon cells after 48h incubation

图选项

在绿色荧光蛋白的实验中，与市售Lipofectmine2000^TM做对照。如图 4所示SW620，CaCO₂低表达组的绿色荧光比SW480，HCT116高表达组变化增强，转染效率与Lipofectmine2000^TM脂质体组差异，SW620，CaCO₂低表达组差异显著，SW480，HCT116高表达组无显著变化。CP材料在高表达CD133组的结肠癌细胞转染效率低，说明CD133⁺高含量的细胞对CP材料摄取能力低。

图 4 CP/DNA复合载体在4种结肠癌细胞株上48小时转染效率 Fig. 4 Transfection efficiency of CP/DNA(EGFP-control)complex in four colon cells after 48h incubation (A) lipofectamine2000TM in SW620 cell (B)CP/DNA in SW620 cell (C)lipofectamine2000TM in CaCO2 cell (D)CP/DNA in CaCO2 cell (E)lipofectamine2000TM in HCT116 cell (F)CP/DNA in HCT116 cell (G)lipofectamine2000TM in SW480 cell (H)CP/DNA in SW480 cell

图选项

采用CP材料转染pGL3质粒，和市售Lipofectamin2000^TM做对照，测定虫荧光素酶活性，SW620，CaCO₂低表达组的转染效率高于SW480，HCT116高表达组，Lipofectmine2000^TM脂质体作对照，据文献报道，在质量比=10时，细胞高安全性，但转染效率比Lipofectmine2000^TM脂质体略低^[14](图 5)。

图 5 CP/DNA复合载体在4种结肠癌细胞株上48h的转染效率 Fig. 5 Transfection efficiency of CP/DNA(pGL3-control)complex in four colon cells after 48h incubation A: CP/DNA in SW620 cell; B:lipofectamine2000TM in SW620 celll; C:CP/DNA in CaCO2 cell; D:lipofectamine2000TM in CaCO2 cell; E:CP/DNA in HCT116 cell; F:lipofectamine2000TM in HCT116 cell; G:CP/DNA in SW480 cell; H:lipofectamine2000TM in SW480 cell

图选项

在质量比=5时，细胞高安全性，但转染效率与Lipofectmine2000^TM脂质体相比略低，同样验证高表达CD133⁺的结肠癌细胞株对CP材料的摄取能力低，与上述实验结果一致。

CP材料和结肽CP材料作用4种结肠癌细胞48h后,CD133蛋白表达差异明显，由图 6所示，结肽CP材料组比CP材料组的4种细胞CD133的蛋白表达水平要明显增高；同组之间，结肽CP材料组及CP材料组的HCT116，SW480的CD133蛋白表达水平要高于SW620，CaCO₂组，由以上结果表明，靶向性结合CD133多肽的CP材料比CP材料在结肠癌细胞上的摄取能力高。

图 6 CD133的蛋白表达 Fig. 6 Western blotting analysis of CD133 protein levels in the cells transfected with different complexes (a) PEI-chitosan (b) CD133-PEI-chitosan

图选项

结直肠癌仍是引起肿瘤相关性死亡的第三大病因^{[16, 17]},在结直肠癌组织中，较高的CD133⁺细胞比例与较差的疾病预后呈负相关^{[18, 19]}。然而，肿瘤的复发和转移是由于肿瘤干细胞具有耐药和耐辐射的特性以及肿瘤干细胞高度的分化能力和致瘤能力^[4]，其干细胞特性在肿瘤的发生和转移中发挥重要作用^[20]。结直肠癌细胞具有较强干细胞样特性，表面高表达CD133⁺，使得结直肠癌的高复发率和转移率对结直肠癌的疗效居高不下。近年来的研究显示，五跨膜的糖蛋白CD133已经广泛用于结直肠癌肿瘤干细胞的表面分子标记，CD133在正常结肠组织中和多种结直肠癌细胞系里存在广泛的表达^[21]。

非病毒基因载体材料在肿瘤的综合治疗当中具有一定的应用价值。非病毒载体的特点是细胞毒性低，因此较为安全，研制非病毒载体也是基因治疗发展中的重要方向。本实验将聚乙烯亚胺/壳聚糖构建成新病毒基因载体，探究其在CD133⁺结肠癌细胞上的转染效率和摄取能力。CP材料^[9]的研究表明，在肺癌，肝癌以及宫颈癌的相关文献报道证实，按质量比=10时，质粒pGL3和质粒EGFP上的转染效率最高，且生物安全性最好。该实验采用合成法制备CP材料，包封率为91.46%。CCK-8法常用于细胞毒性检测，同时我们检测到质量比=5时，CP材料在4种结肠癌上的毒性最小。

流式技术常被用来检测细胞含量，我们通过流式含量检测技术处理细胞后，根据CD133⁺表达结果进行分组，HCT116为92.96%，SW480为96.97%为高表达组；SW620为0.56%,CaCO₂ 为2.00%,为低表达组；以CD133为目的基因的荧光半定量检测法结果，与流式结果表达相对呈一致性；细胞迁移实验验证显示，高表达CD133⁺的结肠癌细胞HCT116、SW480迁移能明显比低表达组高；对CP材料在4种结肠癌细胞上转染效率的考察，以质粒pGL3作为定性指标，质粒EGFP作为定量指标，我们的研究结果显示CP材料处理细胞6h后进行转染，在培养48h过后，用虫荧光素酶测试结果，数值结果得出质粒pGL3在低表达CD133⁺的细胞组转染效率高，CD133⁺阳性高表达组细胞对CP材料摄取能力低，CP材料在转染EGFP质粒后，通过绿色荧光观察到与前者质粒的作用呈一致性。

为了进一步探讨CP材料在CD133⁺细胞上的作用强度，CD133(prominin1)是5跨膜糖蛋白，分子量约120kDa，目前，检测结直肠癌细胞表面CD133表达最常用的是CD133/1(AC133)抗体。我们检测了CP材料和结TR肽CP材料中CD133蛋白的表达，结肽的CP材料组CD133的蛋白表达水平高，其中，CD133⁺高表达组HCT116、SW480结肠癌细胞的CD133蛋白表达偏高，结果提示针对CD133⁺结肠癌细胞对与特异性结合CD133的TR短肽修饰CP材料的摄取明显增多。

本实验探讨出CP材料在质量比=5时能作用于高表达组CD133⁺阳性的结直肠癌细胞，转染效率高且生物安全性好，而且在连接TR肽的CP材料更多与高表达CD133⁺结肠癌细胞结合，该接肽的CP材料在结直肠癌细胞上是一种潜在的靶向材料，其体内对结直肠癌的靶向性和抑制能力正在下一步研究当中。