2016, Vol. 36文章信息
- 秦海霞, 崔红凯, 潘莹, 户瑞丽, 朱利红, 王世进
- QIN Hai-xia, CUI Hong-kai, PAN Ying, HU Rui-li, ZHU Li-hong, WANG Shi-jin
- miR-335靶向Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1对卵巢癌细胞增殖的影响
- miR-335 Regulate Cell Proliferation by Targeting Rho Associated Coiled-coil Forming Protein Kinase 1 in Ovarian Cancer Cells SKOV3
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(6): 24-31
- China Biotechnology, 2016, 36(6): 24-31
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160604
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文章历史
- 收稿日期: 2015-12-14
- 修回日期: 2016-01-04
2. 新乡医学院第一附属医院介入科 卫辉 453100;
3. 新乡医学院第三附属医院 新乡 453000
2. Department of Interventional Radiology, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, China;
3. Department of Obstetrics and Gynecology, The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, China
卵巢癌是继子宫内膜癌及宫颈癌后第三大常见妇科恶性肿瘤，其死亡率更是居妇科恶性肿瘤之首[1]。由于缺乏早期典型症状及可靠的早期诊断技术，故早期卵巢癌往往易被忽视，当出现临床症状并确诊时，大多已属晚期，从而错失实施根治性手术的最佳时间。当前，卵巢癌的临床治疗存在“两个70%”，即70%以上的患者临床确诊时已属晚期，70%以上的患者在治疗后两年内复发[2, 3]。化疗是卵巢癌临床治疗的常用辅助手段，随着近年来化疗技术的不断进步，其临床治疗效果大大提高，但患者5年生存率仍低于30%[4, 5]。因此，寻求更安全、高效的卵巢癌治疗方法是临床关注的热点及难点问题。
微小RNA(microRNA，miRNA)属于内源性非编码小分子RNA，它可通过5′-种子区与调控一个或多个靶基因mRNA 的3′-非翻译区(untranslated region，UTR)碱基互补配对，从而调控靶基因表达，进而起到类似抑癌或促癌基因的作用，并参与恶性肿瘤的发生与发展[6]。miR-335是近年来研究得较多的一种miRNA，其定位于人类7q32.2[7]。有研究证实，上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)组织中miR-335呈现低表达态势，并与临床预后密切相关，提示miR-335可能参与卵巢癌的发生与发展[8]。但miR-335对其下游靶基因的调控作用及机制尚未明确。
Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(rho associated coiled-coil forming protein kinase 1，ROCK1)是Rho家族的主要效应分子，其表达水平与肿瘤分化程度、淋巴转移及远期生存率密切相关[9]。更有学者认为，Rho/ROCK信号途径直接参与恶性肿瘤细胞局部浸润及淋巴结转移过程[10]。ROCK1表达与人卵巢癌细胞SW626、Caov-3体外侵袭和迁移能力的相关性已得到证实，而采用反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)特异性阻断ROCK1则可起到抑制人卵巢癌细胞体外侵袭和迁移的作用[11]。
miR-335靶向ROCK1对细胞增殖的调控作用已在骨肉瘤中得到证实，但其在卵巢癌中的研究尚未见报道[12]。本研究拟选取卵巢癌细胞系SKOV3为研究对象，观察miR-335靶向ROCK1对卵巢癌细胞系SKOV3增殖的调控作用及分子机制，旨在为卵巢癌的靶向治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料卵巢癌细胞系SKOV3及人正常卵巢上皮细胞系IOSE80(购于美国ATCC细胞库)；RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂盒、反转录试剂盒(购于Invitrogen公司)；DMEM培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶(购于Hyclone公司)；胎牛血清(购于Gibco公司)；MTT(购于Sigma公司)；ROCK1兔源单克隆抗体(购于大连Santa Cruz公司)；miR-335 mimic、mimic control(由广州锐博生物有限公司构建)；ROCK1表达质粒(购于Origene公司)；miR-335、U6引物(由上海生工生物工程有限公司合成)；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(购于碧云天生物试剂有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养分别常规复苏卵巢癌细胞系SKOV3及人正常卵巢上皮细胞系IOSE80，PBS洗涤细胞3次，无血清DMEM培养基洗涤细胞3次，用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液将细胞混匀，并置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每天换液1次，收集对数生长期细胞，提取细胞总RNA及总蛋白待用。
1.2.2 细胞转染收集对数生长期的卵巢癌细胞系SKOV3，用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液将细胞密度调节至2×105 cells/well，后接种于6孔板中，共9孔，分为3组，即SKOV3组、miR-335 mimic 组及miR-335 mimic+Sp1组，每孔设3个复孔；将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h；根据上述分组不同，利用LipofectamineTM2000转染miR-335mimic(50nmol/L)、相应的mimic control(50nmol/L)及ROCK1表达质粒(50nmol/L)，其中SKOV3组转染mimic control、miR-335 mimic组转染miR-335 mimic、miR-335 mimic+ROCK1组共转染miR-335 mimic+ROCK1，操作严格按照转染试剂盒说明书进行；转染后将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养48h；收集细胞总RNA及总蛋白以备后续实验。
1.2.3 双荧光素酶报告基因法检测miR-335与ROCK1的靶向作用收集对数生长期的卵巢癌细胞系SKOV3，用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液将细胞密度调节至2×105 cells/well，后接种于24孔板中，将荧光素酶报告载体(0.1μg/孔)与miR-335 mimic(20nmol/L)共转染SKOV3细胞；将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养48h；采用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性，相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶。
1.2.4 MTT法检测细胞增殖收集对数生长期的细胞，按方法2.2分为三组，即SKOV3组、miR-335 mimic 组及miR-335 mimic+ROCK1组，每孔设3个复孔。分组转染后，调整细胞浓度为2×105 cells/well，并接种于96孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱培养，分别培养24h、48h、72h，后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃、5% CO2培养箱4h，800r/min离心10min，弃上清；利用MTT法检测HSC增殖活性，即培养结束后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，继续置于37℃、5% CO2培养箱4h进行显色实验，后吸弃孔内培养上清液，每孔加入100μl DMSO终止显色，振荡10min，使结晶物充分溶解，采用全自动酶标仪检测OD490nm吸光值。
1.2.5 Real-time PCR检测细胞中miR-335及Cyclin D1表达采集对数生长期的卵巢癌细胞SKOV3、人正常卵巢上皮细胞IOSE80及分组转染的各组细胞，参照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒逆转录总RNA至cDNA，取逆转录产物加入SYBR Green法行RT-PCR。miR-335以U6为内参，Cyclin D1以β-actin为内参，引物序列见表 1。
| Primer | Sequence (5′~3′) |
| miR-335 | Forward: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG Reverse: GTGCAGGGTCCGAGGT |
| U6 | Forward: CTCGCTTCGGCAGCACA Reverse: AACGCTTCACGAATTTGCGT |
| Cyclin D1 | Forward:TGTTCGTGGCCTCTAAGATG Reverse: ACTCCAGAAGGGCTTCAA |
| β-actin | Forward:AGCTGAGAGGGAAATCGTGCG Reverse:GTGCCACCAGACAGCACTGTG |
收集对数生长期的卵巢癌细胞SKOV3、人正常卵巢上皮细胞IOSE80及分组转染的各组细胞，加入细胞裂解液，沸水浴5min，室温冷却，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，取200μl样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维膜，5%封闭液4℃封闭4h，TBS缓冲液漂洗3次，加入一抗(ROCK1、β-actin)(1：2 000)，4℃孵育过夜，TBS缓冲液漂洗3次，加入相应二抗(1：500)，室温孵育2h，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测，增强化学发光显色系统显色。
1.3 统计学方法采用SPSS18.0统计软件，计量资料用均值±标准差(Mean±SD)表示，多组间比较用单因素方差检验，两两间比较用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 SKOV3及IOSE80中miR-335、ROCK1表达RT-PCR结果显示，与人正常卵巢上皮细胞IOSE80比较，卵巢癌细胞SKOV3中miR-335表达显著降低，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)(图 1)；Western blot结果显示，与人正常卵巢上皮细胞IOSE80比较，卵巢癌细胞SKOV3中ROCK1蛋白表达显著增高，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)(图 2)。
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| 图 1 SKOV3及IOSE80中miR-335表达 Fig. 1 The expression of miR-335 in SKOV3 and IOSE80 Mean±SD, n=3, a:P＜0.05, vs IOSE80 |
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| 图 2 SKOV3及IOSE80中ROCK1蛋白表达 Fig. 2 The protein expression of ROCK1 in SKOV3 and IOSE80 Mean±SD, n=3, a:P＜0.05, vs IOSE80 |
RT-PCR结果显示，转染miR-335 mimic可使卵巢癌细胞SKOV3中miR-335表达上调，与阴性对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)(图 3)。
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| 图 3 转染miR-335 mimic对SKOV3中miR-335表达的影响 Fig. 3 The expression of miR-335 in SKOV3 after transfected miR-335 mimic Mean±SD, n=3, a:P＜0.05, vs negative control(NC) |
双荧光素酶活性检测结果显示，miR-335 mimic可显著抑制野生型ROCK1-Wt报告载体的荧光素酶活性，但对突变型ROCK1-Mut报告载体的荧光素酶活性并无显著抑制作用，提示miR-335可特异性地与ROCK1 3′-UTR结合(图 4)。
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| 图 4 SKOV3中miR-335 mimic共转染野生型ROCK1 3′-UTR或突变型ROCK1 3′-UTR对荧光素酶活性的影响 Fig. 4 The luciferase activity in SKOV3 cells after co-transfected with wild-type (WT) ROCK1 3′-UTR or mutant (Mut) ROCK1 3′-UTR in the presence of miR-335 mimic Mean±SD, n=3, a:P＜0.01, vs negative control(NC) |
细胞培养24h、48h及72h后，MTT法检测结果显示，转染miR-335mimic后，卵巢癌细胞SKOV3增殖活性较阴性对照组显著降低(P＜0.05)；而转染miR-335 mimic+ROCK1后，卵巢癌细胞SKOV3增殖活性较单纯转染miR-335 mimic组显著提高(P＜0.05)，但仍显著低于阴性对照组(P＜0.05)(图 5)。RT-PCR法检测结果显示，转染miR-335mimic后，卵巢癌细胞SKOV3中Cyclin D1表达显著降低(P＜0.05)；而转染miR-335 mimic+ROCK1后，卵巢癌细胞SKOV3中Cyclin D1表达较单纯转染miR-335 mimic组显著提高(P＜0.05)，但仍显著低于阴性对照组(P＜0.05)(图 6)。Western blot检测结果显示，转染miR-335mimic后，卵巢癌细胞SKOV3中ROCK1蛋白表达较阴性对照组显著降低(P＜0.05)；而转染miR-335 mimic+ROCK1后，ROCK1蛋白表达较单纯转染miR-335mimic组及阴性对照组显著增高(P＜0.05)(图 7)。
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| 图 5 转染miR-335、ROCK1对SKOV3增殖活性的影响 Fig. 5 The effect of transfection miR-335 and ROCK1 on the proliferation of SKOV3 Mean±SD, n=3, a:P＜0.05, vs SKOV3 group(negative control), b:P＜0.05, vs miR-335 mimic group |
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| 图 6 转染miR-335、ROCK1对Cyclin D1表达的影响 Fig. 6 The effect of transfection miR-335 and ROCK1 on the Cyclin D1 expression of SKOV3 Mean±SD, n=3, a:P＜0.05, vs SKOV3 group(negative control), b:P＜0.05, vs miR-335 mimic group |
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| 图 7 转染miR-335、ROCK1对SKOV3中ROCK1蛋白表达的调控作用 Fig. 7 The effect of transfection miR-335 and ROCK1 on ROCK1 protein expression in SKOV3 Mean±SD, n=3, a:P＜0.05, vs SKOV3 group(negative control), b:P＜0.05, vs miR-335 mimic group |
卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，严重威胁妇女生命安全。由于卵巢的生理解剖位置较为隐蔽，故起病隐匿，目前仍缺乏特异性的诊断及治疗措施。早期手术切除是治疗卵巢癌的可靠办法，但多数晚期患者并无法受益。化疗仅能改善患者生活质量，却无法使其长期生存，而长期化疗所致的毒副反应也不容忽视[13]。因此，探寻更安全、高效的卵巢癌治疗方法是目前亟待解决的重点及难点问题。
miRNA属于高度保守的非编码小分子单链RNA，并广泛存在于真核生物中。正常生理状态下，机体内miRNA表达遵守严格的组织、时序特异性；但在肿瘤环境下，不同miRNA则表现出不同的生物学活性，并起到类似癌基因或抑癌基因的作用[14, 15, 16]。miR-335在不同恶性肿瘤发生、发展过程中发挥着不同作用。伍家燕等[17]研究证实，乳腺癌细胞MDA-MB-231中miR-335呈现低表达，过表达miR-335可有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移，提示miR-335发挥着抑癌基因的功能。而Shu等[18]研究发现，星形细胞瘤中miR-335呈现高表达状态，并与细胞增殖及侵袭能力密切相关，从而发挥类似癌基因功能。本研究结果显示，与人正常卵巢上皮细胞IOSE80相比较，卵巢癌细胞SKOV3中miR-335表达显著降低(P＜0.05)；而转染miR-335 mimic可使卵巢癌细胞SKOV3中miR-335表达显著升高，同时显著抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖活性，提示miR-335在卵巢癌的发生与发展进程中起着类似抑癌基因的作用[19]。
ROCK1作为Rho效应分子，可通过Rho/ROCK信号通路激活下游多种靶分子，进而参与肿瘤发生及转移过程[20]。病理生理状态下，Rho蛋白活化并与ROCK1上位点结合，暴露ROCK1催化活性中心，激活ROCK1，促进肌球蛋白轻链磷酸化及肌丝收缩，进而调控细胞骨架蛋白介导的恶性肿瘤细胞运动[21]。研究证实，ROCK1在非小细胞肺癌[22]、乳腺癌[23]及前列腺癌[24]等恶性肿瘤组织中均呈现高表达态势，且其高表达水平与肿瘤低分化、淋巴转移及预后不良密切相关。本研究结果显示，卵巢癌细胞SKOV3中ROCK1蛋白表达显著高于人正常卵巢上皮细胞IOSE80(P＜0.05)，而转染miR-335 mimic可使卵巢癌细胞SKOV3中ROCK1蛋白表达得到显著抑制，提示卵巢癌细胞SKOV3中miR-335表达水平与ROCK1表达水平存在明显相关性，而这种相关性很可能是由miR-335负向调控ROCK1表达所致[25]。进一步利用双荧光素酶活性检测证实，miR-335可与ROCK1 3′-非翻译区(untranslated region，UTR)特异性结合，降低荧光酶活性，从而为miR-335靶向ROCK1提供有力证据，与王勇等[26]研究结论一致。
MTT法检测细胞增殖活性结果显示，共转染miR-335及ROCK1可实现miR-335对卵巢癌细胞SKOV3增殖抑制作用的部分逆转，提示miR-335可通过靶向ROCK1表达调控卵巢癌细胞SKOV3增殖。Cyclin D1是细胞增殖周期启动的重要调控因子。本研究结果显示，共转染miR-335或miR-335+ROCK1后，Cyclin D1的表达趋势变化与卵巢癌细胞SKOV3增殖趋势一致，这为证实miR-335靶向ROCK1抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖提供了有利证据，也在一定程度上阐明了miR-335靶向ROCK1抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖的作用机制。但值得注意的是，转染ROCK1无法完全逆转miR-335对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用。miR-335的靶向基因众多，目前已知的包括Sp1、HER3等，而靶基因的非唯一性可能是导致其靶向ROCK1无法完全调控卵巢癌细胞增殖的原因之一。
总之，miR-335与ROCK1存在靶向关系，miR-335可通过靶向调控ROCK1表达抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖活性，而ROCK1可能是治疗卵巢癌的潜在靶基因。此外，miR-335还可能通过靶向其他下游基因参与卵巢癌的发生与发展过程。
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