前列腺癌(prostate cancer，PCa)是老年男性常见的恶性肿瘤。在欧美国家男性中，PCa发病率位居首位，其中美国PCa占男性癌症死亡的第2 位^[1]。我国PCa 在男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤中发病率已跃居第二位^[2]。我国大多数PCa在诊断时已处于中晚期，虽然内分泌治疗可使多数患者的病情得到控制和改善，但绝大多数患者会发展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)，激素治疗效果不佳，患者预后极差^[3]。因此，寻找新的治疗方法成为亟待解决的问题。

肝细胞粘附分子(hepatocyte cell adhesion molecule，hepaCAM)是从人类肝脏中分离具有抑癌基因特性的新型免疫球蛋白类细胞粘附分子^[4]。研究表明hepaCAM在前列腺癌组织和细胞中低表达或不表达，在正常前列腺上皮组织和细胞中高表达，且参与调节癌细胞的增殖、迁移和侵袭等，对前列腺癌的发生发展起着重要作用^[5]。

帕比司他(Panobinostat)是一种新型、广谱组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，通过阻断HDAC发挥作用，对癌细胞施以严重的应激直至其死亡，而健康细胞则不受影响^[6]。HDACs可使一些肿瘤相关基因启动子和增强子上组蛋白修饰酶模式改变进而影响基因转录和表达^[7]。

本研究以抑癌基因 hepaCAM 为切入点，探究帕比司他能否逆转 hepaCAM在前列腺癌细胞中的表达，并具备协同hepaCAM抑制肿瘤生长的作用机制。

人前列腺癌细胞 PC3(重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室保存)。

表达绿色荧光蛋白腺病毒载体(adenovirus vector of green fluorescent protein，Ad-GFP)及表达hepaCAM 蛋白重组腺病毒载体(adenovirus vector of hepaCAM protein，Ad-hepaCAM)由本课题组构建。

DMEM/F12 培养基及胎牛血清(美国Hyclone 公司)； PBS(武汉博士德公司)；MTT、DMSO(Sigma)；帕比司他(上海皓元生物医药科技有限公司)；PCR 引物合成(Invitrogen 公司)；RT-PCR 试剂盒、Trizol、Taq DNA聚合酶(TaKaRa 生物技术有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；hepaCAM 兔抗人多克隆抗体(ProteinTect 公司)；HDAC1、HDAC3、HDAC4、Ac-H3K9兔抗人多克隆抗体(美国ImmunoWay公司)；化学发光试剂盒(Amersham 公司)；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG和抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

人前列腺癌细胞 PC3常规培养于DMEM/F12完全培养基(含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，置于37℃、5% CO₂饱和湿度的恒温培养箱中培养。待细胞贴壁并长至瓶底的80%~90%后以0.25% 胰酶消化吹打传代。

取对数生长期细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μl，密度约为3 000个/孔。16 h后，进行PC3(0、20、30、40、60、80、100、120nmol/L)浓度的帕比司他处理，每种浓度设5个复孔。另设对照组(未经帕比司他处理)和调零组(不含细胞的培养液)。各组培养24、48、72h 后，分别每孔加入5mg/ml MTT试剂10μl，继续培养4 h。小心吸尽上清，加入150μL/孔DMSO，避光振荡混匀10 min至结晶完全溶解，酶标仪490 nm处检测各孔吸光度(A)值，并计算药物对细胞的抑制率及确定药物作用浓度。抑制率(IR%)=[1－A处理/A空白]×100%。

实验分组：Ad-GFP组、Ad-hepaCAM组、Panobinostat组和Ad-hepaCAM+Panobinostat组。取对数生长期细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μl，密度约为3 000个/孔。16 h后，分组处理后继续培养，每种处理因素设5 个复孔。另设对照组和调零组(不含细胞的培养液)。培养24、48、72h 后，按常规方法操作后，酶标仪490 nm处检测各孔吸光度(A)值，并计算各处理因素对细胞的生长抑制率。

收集经过不同处理的各组细胞，Trizol 法提取总RNA，逆转录为cDNA。反应条件为：95℃预变性 3min；95℃ 变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共经历30个循环；之后72℃延伸10min。反应结束后PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，运用Quantity One(Bio- Rad，美国)软件分析条带灰度值，mRNA 相对表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值。引物序列见表 1。

按常规方法提取各处理组细胞总蛋白以及细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取核浆蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。以50 μg 蛋白上样量进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，湿转法将蛋白转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h 后加入1：1 000 比例稀释兔抗人hepaCAM、HDAC1、HDAC3、HDAC4、Ac-H3K9、cyclinD1、PCNA、GAPDH多克隆抗体4℃孵育过夜；TBST 洗涤10 min×3 次，其次加入HRP 标记的山羊抗小鼠或兔IgG(1：1000)，室温下孵育1h；TBST 洗涤 10 min×3 次，化学发光法显影。运用Quantity One(Bio-Rad，美国)软件分析条带灰度值，蛋白相对表达量=目的条带灰度值／内参条带灰度值。

PBS清洗细胞3次，1ml胰酶消化细胞将液体全部移至离心管中，500r/min离心10min后弃上清，加入1ml PBS混匀后将细胞悬液转移至 1.5ml EP管中，500r/min离心5min; 弃尽上清，200μl PBS重悬细胞，将细胞悬液缓慢滴入至1ml 75%乙醇中，4℃固定过夜；第二天将固定好的细胞送至我校生命科学院流式细胞术实验室检测。

实验结果采用SPSS17.0统计学软件处理。各实验均独立重复3次，结果数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验分析。检验水准α=0.05(双侧)。

MTT法检测结果显示，帕比司他对人前列腺癌细胞 PC3的生长具有抑制作用且随着作用浓度的增加及作用时间的延长抑制作用逐渐增强。在PC3细胞中，药物作用24h时,对PC3 抑制率均在40%以下；48h时,药物浓度在30nmol/L时抑制率达到50%以上，且随着浓度升高抑制率呈增高，但在80nmol/L处抑制率不再增高；72h时,药物浓度在20nmol/L时抑制率达到60%，且随着浓度升高抑制率亦明显增高(图 1)。故后续实验选择0、20、40、60、80、100nmol/L 浓度作用48h处理PC3细胞。

图 1 MTT法检测帕比司他对PC3细胞生长的影响 Fig. 1 MTT assay detecting Panobinostat effect on PC3 cell growth

图选项

RT-PCR结果显示，帕比司他处理PC3细胞 hepaCAM mRNA的表达随药物浓度升高亦呈增高趋势(图 2a)。相比B组，PC3细胞中20和40nmol/L组hepaCAM mRNA无显著性差异(P>0.05),但60、80、100nmol/L组hepaCAM mRNA表达明显增高(P < 0.01,P < 0.001)(图 2a)。

图 2 不同浓度帕比司他处理后PC3细胞 hepaCAM 的表达变化 Fig. 2 The hepaCAM expression of PC3 cell with different concentration of Panobinostat (a) hepaCAM mRNA expression was analyzed by real time PCR (b) hepaCAM protein expression was analyzed by Western blot * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 compared with B group

图选项

Western blot检测结果与RT-PCR结果几乎一致，PC3细胞 hepaCAM 蛋白的表达随着帕比司他浓度升高而增高(图 2b)。

RT-PCR结果显示，PC3细胞 HDAC mRNA的表达随着帕比司他浓度升高而降低 (图 3a)。相比B组，PC3细胞中各处理组HDAC1和HDAC4 mRNA表达降低有统计学意义(P < 0.05,P < 0.001)，而HDAC 3只有80、100nmol/L组降低有显著性差异(P < 0.001)(图 3a)。

图 3 不同浓度帕比司他处理后PC3细胞 HDAC 的表达变化 Fig. 3 The HDAC expression of PC3 cell with different concentration of Panobinostat (a) HDACs mRNA expression was analyzed by real time PCR (b) HDACs protein expression was analyzed by Western blot * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 compared with B group

图选项

Western blot检测结果表明，PC3细胞 HDAC 蛋白的表达随着帕比司他浓度升高亦呈降低趋势(图 2b)。相比B组，PC3细胞中HDAC1 mRNA表达降低除了20nmol/L组没有统计学意义，其余各处理组HDAC1、HDAC3、HDAC4 蛋白表达降低均有统计学意义(P < 0.05,P < 0.01,P < 0.001)(图 3b)。

Ac-H3K9即乙酰化组蛋白H3 赖氨酸9，是组蛋白乙酰化程度的常用标志。Western blot检测结果显示PC3细胞核中Ac-H3K9表达随着帕比司他浓度升高而增高，表明组蛋白乙酰化程度随着药物作用浓度加大而增高 (图 4)。

图 4 不同浓度帕比司他处理后PC3细胞 Ac-H3K9 的表达变化 Fig. 4 The Ac-H3K9 expression of PC3 cell with different concentration of Panobinostat

图选项

MTT 结果显示，分别过表达hepaCAM腺病毒和帕比司他以及两者联合作用于PC3细胞：单独处理组两种细胞明显受到抑制且随着时间延长抑制率增加，但两者联用对PC3细胞增殖抑制更加明显，与单独处理组比较差异有统计学意义(P < 0.05)(图 5)。

图 5 MTT法检测各处理组对PC3细胞生长的影响 Fig. 5 MTT assay detecting effect on PC3 cell growth in each group

图选项

流式细胞术结果显示：与单独过表达hepaCAM腺病毒和单独处理帕比司他相比，两者联合作用PC3细胞后S期细胞比例明显增高(图 6a、图 6b)。表明两者联用可进一步阻滞细胞周期于S期，抑制了前列腺癌细胞的增殖。

图 6 PC3细胞周期 Fig. 6 Cell cycles of PC3 cells (a)Cell cycle was detected by FCM (b) The percentage of cell cycle * P < 0.05 compared with Ad-hepaCAM and PAN group

图选项

RT-PCR结果显示，与空白组和对照组相比，PC3细胞过表达hepaCAM腺病毒和帕比司他组cyclinD1 和PCNA mRNA表达均下调，但差异在1.5倍以内，而两者联用后PCNA mRNA表达下调差异加大，cyclinD1 mRNA表达差异更是达到3倍以上；而与单独处理组相比，两者联用cyclinD1 和PCNA mRNA表达差异具有统计学意义(P < 0.05)(图 7a)。

图 7 检测各处理组PC3和LNCap细胞增殖基因表达 Fig. 7 Detecting the expression of proliferation genes of PC3 and LNCap cell in each group (a) CyclinD1, PCNA and hepaCAM mRNA expression was determined by RT-PCR (b) CyclinD1, PCNA and hepaCAM protein expression was analyzed by Western blot A:Compared with hepaCAM group，P＜0.05；B:Compared with Panobinostat group，P＜0.05

图选项

Western blot检测结果表明，PC3细胞过表达hepaCAM腺病毒和帕比司他组相比，空白组和对照组cyclinD1 和PCNA 蛋白表达均下调，两者联用后表达下调差异加大；与各单独处理组相比，两者联用cyclinD1 和PCNA 蛋白表达差异具有统计学意义(P < 0.05)(图 7b)。

hepaCAM是Moh等^[4]从人类肝脏中分离具有抑癌基因特性的新型免疫球蛋白类细胞粘附分子 [GenBank,AY047587]，经证实hepaCAM基因定位于人类染色体11q24上，转录产物为1 251bp mRNA，编码产物为含416个氨基酸，分子量约46kDa的糖蛋白。前期研究发现它可通过多种信号途径在肿瘤增殖、侵袭、转移和细胞凋亡等过程中发挥重要作用^{[8, 9, 10]}。近期本课题组从表观遗传学角度发现膀胱癌中hepaCAM基因外显子和启动子存在高甲基化并证实去甲基化可使hepaCAM基因重新表达 ^{[11, 12]}。本课题采用广谱组蛋白去乙酰化酶抑制剂Panobinostat研究是否可使hepaCAM基因在前列腺癌细胞中重新表达以及作用机制。

组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修饰的过程。组蛋白的变异修饰则是在病理情况下，修饰相关酶发生变异或失去平衡^[7]。组蛋白去乙酰化和基因启动子甲基化都属于基于非基因序列改变所致基因表达水平变化的表观遗传学范畴。研究发现：肿瘤发生与核小体核心组蛋白N-端的赖氨酸残基乙酰化和去乙酰化失衡有密切关系，肿瘤发生时HDAC催化组蛋白N-端赖氨酸残基去乙酰化,改变核小体中碱性蛋白与DNA链之间的静电吸引力,从而调节核小体之间的聚集状态,影响转录因子抑制基因转录，因此组蛋白去乙酰化状态是基因转录调控的关键机制之一^[13]。人类HDAC家族可以分为二类：Ⅰ 类HDACs (HDAC1-3/8)，在人体肿瘤中广泛表达；Ⅱ 类HDACs(4-11)，在心脏、骨骼肌和脑表达最高^[13]。帕比司他作为一种新型、广谱HDAC抑制剂，已经美国FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤(myltiplemyeloma，MM)，但对其它肿瘤疗效目前仍处于基础研究中^[6]。本研究检测了不同浓度帕比司他作用于PC3细胞后胞核内组蛋白H3 赖氨酸9乙酰化状态并选择具有代表性I 类HDACs中的 HDAC1、HDAC2和II 类HDACs中的HDAC4进行研究，也证实了PC3细胞 HDAC1、HDAC3 和HDAC4 mRNA和蛋白的表达随着帕比司他浓度升高而降低。

cyclinD1 作为细胞周期蛋白，通常在G1 期是稳定的，促丝裂信号刺激后合成增多，导致细胞周期中的G1 期缩短，引起S 期进程相关基因转录，细胞分裂速度加快，在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用^[14]。PCNA 存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内，作为DNA 聚合酶δ的辅助蛋白直接参与DNA 合成复制，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反应细胞增殖状态的良好指标^[15]。

本研究表明，帕比司他可抑制人前列腺癌细胞生长，当达到一定作用浓度和时间后，可进一步逆转hepaCAM使其重新表达。作用机制可能与降低癌细胞中组蛋白去乙酰化酶，使核小体核心组蛋白N-端的赖氨酸残基乙酰化程度升高有关。与单独应用hepaCAM或帕比司他相比，两者联合使用可能通过降低增殖相关基因cyclinD1 和PCNA表达加强细胞周期阻滞于S期，抑制前列腺癌细胞生长。本研究进一步揭示了抑癌基因hepaCAM在前列腺肿瘤缺失的原因，亦为将组蛋白去乙酰化酶抑制剂帕比司他应用于临床治疗肿瘤提供了理论和实验依据。