文章信息
- 王佃亮.
- WANG Dian-liang.
- 细胞药物的种类及生物学特性——细胞药物连载之一
- The Types and Biological Characteristics of Cell Drug
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(5): 138-144
- China Biotechnology, 2016, 36(5): 138-144
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160520
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-03
- 修回日期: 2016-02-15
我国2003年出台的《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》指出,体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种的体细胞,经体外操作后回输人体的治疗方法,这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选,以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理。目前按治疗细胞的生物学特性,细胞药物可划分为传统体细胞、免疫细胞、干细胞等[1-3]。
1 细胞药物的种类 1.1 体细胞可用于临床移植治疗的传统体细胞主要有软骨细胞、肝细胞、胰岛细胞、嗅鞘细胞等。这些细胞都已经完成了分化,在具体组织器官中起着特定结构作用,并行使一定功能。它们的结构和功能作用通常都比较局限,既不像干细胞那样可以转化为一种或多种其他种类的细胞而具有另外的结构功能作用,也不像免疫细胞那样对机体抵抗疾病具有重要的防御功能,但这类细胞在临床上仍然具有重要的治疗价值。在临床上有过多种体细胞移植的尝试,其中常见的包括软骨细胞移植治疗软骨病变、肝细胞移植治疗肝损害、胰岛细胞移植治疗糖尿病及嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤等[2, 4]。
1.2 免疫细胞凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞称为免疫细胞,主要包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞及它们的前体细胞等。但在免疫应答过程中起核心作用的是淋巴细胞。肿瘤生物免疫治疗是当今继传统的手术、化疗、放疗之后的第四种肿瘤治疗手段,具有安全性高、副作用小和特异性强的优点。作为新型安全的肿瘤治疗方法,肿瘤生物免疫治疗能清除手术后残留的肿瘤细胞,有效缓解患者放化疗后免疫力的降低,提高生活质量、减少复发机会、延长生存时间,已成为肿瘤临床综合治疗的重要组成部分,是目前国内外研究的热点之一,尤其是2013年12月美国《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为年度十大科学突破的首位,更确定了生物免疫治疗在未来肿瘤综合治疗中的重要地位及发展前景。免疫细胞移植治疗,就是采集人体自身免疫细胞,经过体外培养,使其数量成千倍增多,靶向性杀伤功能增强,然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞,打破免疫耐受,激活和增强机体的免疫能力,兼顾治疗和保健的双重功效。用于临床治疗的免疫细胞药物类型包括CIK、DC、LAK细胞等[5-6]。
1.3 干细胞干细胞是近年来科学研究领域的一大重要突破,它是一类具有不同分化潜能,并在非分化状态下自我更新的细胞[7]。干细胞治疗是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入(或植入)人体,用于疾病治疗的过程。这种体外操作包括干细胞的分离、纯化、扩增、修饰,以及干细胞(系)的建立、诱导分化、冻存和冻存后的复苏等过程。
干细胞药物是一类干细胞制剂,通过不同途径将其输入体内后,可以改善身体健康状态或防治各种疾病。
干细胞根据来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、成体干细胞(adult stem cell,ASC)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)。ESC来源于囊胚的内细胞团,具有全能性,可分化为体内所有组织细胞类型。ASC是存在于发育成熟机体器官组织中具有高度自我更新和增殖潜能的未分化细胞,可分化为组成该组织或器官的特定细胞类型。活体内成体干细胞的主要功能是维持其所在组织的完整性及修复受损组织,其分化潜能相对较弱,只能分化成有限的组织功能细胞。患者自体干细胞应用由于没有免疫排斥及伦理争议等问题,被更多地应用到临床。用于临床治疗的干细胞种类主要有骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、胰岛干细胞、脂肪干细胞等。
国际上已批准多款干细胞药物上市,其中美国FDA两例,韩国KFDA三例,欧洲EMA、澳洲TGA、加拿大Health Canada各一例[8]。但数量仍较少,大部分细胞药物仍处在临床前和临床研究阶段[9]。
2 细胞药物的生物学特性 2.1 传统体细胞 2.1.1 肝细胞用于移植的肝细胞来源包括:①人原代肝细胞:具有肝细胞功能最完善的人原代肝细胞是最理想的移植细胞,但其来源有限,增殖能力较差,保存效果不太理想,使其应用受到了很大限制。但随着肝细胞分离和培养技术的发展,人原代肝细胞的来源得到了较好的保障,为肝细胞移植的基础研究及临床应用产生了巨大的推动作用。经研究分析,目前已总结出较为稳定可行的人肝细胞分离、培养及冷冻方法。②永生化肝细胞株:肝细胞永生化是将永生化基因导入细胞内,这样获得的肝细胞可以在体外不断扩增。但由于肝细胞永生化后细胞功能及表型与原代肝细胞不完全一致,还存在安全性问题。③动物源肝细胞:动物源肝细胞一般来自猪、犬、鼠、兔等实验动物,其来源广泛、获取方便,目前最常用的是猪肝,它能提供与人肝结构相似、功能相近的肝细胞。④胎肝细胞:胎肝细胞是由流产胎儿肝脏分离所得的肝细胞及其前体,具有分化增殖能力强、免疫原性弱及更能抵抗低温储存损伤等优点。
肝细胞是高度分化的细胞,具有丰富的酶系及多种特异性功能,被广泛用于生物化学、实验性肝损伤、药代动力学、毒理学和致癌作用等研究。原代培养的肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。肝细胞移植是先将供体的肝脏在原位进行插管灌注、分离、纯化、培养,并对培养中的肝细胞进行检测,然后将具有正常细胞功能的活性肝细胞注入受体内,从而部分地替代肝脏的分泌、代谢等功能。实验证明,肝细胞移植至肝脏、脾脏和其他某些部位后,仍能维持其正常结构,并能表达多种肝细胞功能,如清蛋白分泌、糖原储存和酵解、胆红素结合、氨代谢及细胞色素P450酶基因的表达。肝细胞移植能很好地提供近期和长期的肝功能[10-11]。
2.1.2 胰腺细胞人胰岛细胞主要分为A(α)细胞、B(β)细胞、D细胞和PP细胞。其中β细胞是治疗糖尿病的功能细胞,主要分布于胰岛中心部位,排列较规则,一般呈圆形,大小均匀,胞质较多,胞质中充满粗大的胰岛素染色颗粒,均匀地散布于整个胰岛,胞核不着色,但可清楚地观察到其轮廓,多呈圆形或椭圆形。可将胰岛细胞从胰岛组织中用胶原酶等消化并分离出来治疗糖尿病。
组成胰岛的各种细胞可依其颗粒染色特点分为三种类型:α细胞、β细胞、δ细胞(也称A细胞、B细胞、D细胞)。α细胞占细胞总数的20%,胞体较大,胞质内含有许多粗大的嗜酸性颗粒,呈鲜红色,分泌胰高血糖素,有促进糖原分解、升高血糖的作用。β细胞数量最多,占细胞总数的75%,胞体略小。胞质内含有橘黄色颗粒,颗粒是细胞质内胰岛素的小泡。β细胞分泌的胰岛素,是调节体内糖代谢的重要激素。δ细胞数量很少,占细胞总数的5%,胞质呈蓝色,分泌颗粒较大,目前认为它是分泌生长激素释放抑制激素及胃泌素的细胞。还有一种为γ细胞(C细胞),是很少的一种细胞,胞质着色浅,无分泌颗粒,细胞器也很少,一般认为,γ细胞是α细胞和β细胞的前身或其分泌后的状态。
胰岛细胞移植的临床技术指标为:①数量:一般为8 000~10 000 IEQ/kg(患者体重)。②胰岛细胞纯度≥90%。③胰岛细胞活力≥70%。④胰岛细胞功能(胰岛素释放试验):刺激指数(SI)≥2.0。刺激指数是指高糖(20mmol/L)刺激下胰岛素释放量与低糖(2.8 mmol/L)刺激下胰岛素释放量之比。国际胰岛移植登记处(IIRT)建议胰岛细胞移植时所需数量要超过6 000 IEQ/kg。I型糖尿病患者需要接受10 000 IEQ/kg体重以上的胰岛才可能完全脱离外源性胰岛素治疗,大部分患者需要接受2次甚至多次胰岛移植[12-13]。
大多数胰岛移植是采用注射器经门静脉注入肝脏的方法[14]。
2.1.3 软骨细胞软骨细胞是一些幼稚的细胞,体小呈扁椭圆形,细胞长轴与软骨表面平行,多为单个存在。深层软骨细胞逐渐长大,变成圆形或椭圆形,在软骨的中央,软骨细胞成群分布,每群为2~8个细胞,它们都是由一个软骨细胞分裂而来,故称为同源细胞群。电镜下,关节软骨细胞的形态学特点为:①表面可见多数微绒毛与糖被膜;②有明显的粗面内质网与高尔基复合体;③相对数量少的线粒体;④只有少量糖原颗粒;⑤可见微管。软骨细胞所存在的部位为一小腔,称为软骨陷窝。陷窝周围的软骨基质呈强嗜碱性,染色很深,称为软骨囊。软骨细胞具有合成和分泌基质与纤维的功能。来自软骨细胞的基质呈半固态,化学成分为软骨黏蛋白和水,是由透明质酸分子为主干、结合着许多短的蛋白质多糖侧链构成的分子筛,并结合大量水分子,易于物质渗透。软骨基质的硫酸软骨素含量很高而使其呈嗜碱性并具有异染性。基质内的软骨粘连蛋白将软骨细胞和基质连接起来。软骨细胞合成的纤维是由II型胶原蛋白构成的胶原原纤维,直径小,呈交织状分布。
1987年,Peterson采用自体软骨细胞移植(autologous chondrocyte implantation,ACI)技术治疗关节软骨缺损患者。这是细胞工程技术首次用于骨关节病的治疗,现已成为一种较为成熟的关节软骨缺损治疗技术[15]。
2.2 免疫细胞 2.2.1 树突状细胞(dendritic cell,DC)DC是一种高效杀伤活性的异质性细胞群,其能够摄取、加工和提呈抗原,刺激体内的初始型T细胞活化,启动机体免疫应答,并可通过直接或间接方式促进B细胞的增殖与活化,调控体液免疫应答,刺激记忆T细胞活化,诱导再次免疫应答。DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器,但其量仅占外周血单核细胞的1%以下。不同谱系的DC具有不同的功能,人体内存在两种功能及性质不同的DC,即DC的两个来源:骨髓起源的DC和淋巴组织起源的DC。前者为大多数DC的来源,由骨髓CD34+细胞分化而来,与单核吞噬细胞系统有关,分布广;后者由胸腺中分离的前体细胞发育而来,低表达CD34,分布于胸腺髓质、脾、淋巴结的T细胞分布区。
DC的特性包括:①细胞表面有许多树突样不规则突起;②细胞表面具有丰富的有助于抗原提呈的分子,如MHC-I、MHC-II分子,共刺激分子CD40、CD40L、CD80(B7-1)、CD86(B7-2),细胞黏附分子ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3,以及淋巴细胞功能相关抗原LFA -1、LFA-3等;③在混合淋巴细胞反应中,既能激活MHC相同的自身反应性T细胞,又能激活MHC不同的同种反应性T细胞,能够显著刺激初始型T细胞(naive T cell)增殖,分泌高水平辅助性T细胞1(Th1)型细胞因子IL-l2、IFN-α并建立初级免疫应答;④具有向局部淋巴细胞T细胞区迁移的能力;⑤激发T细胞增殖及抗原提呈能力是巨噬细胞和B细胞的100~1 000倍。
DC回输疗法已试用于非霍奇金B细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、MM晚期患者的治疗[16-17]。对于非霍奇金B细胞淋巴瘤的治疗,是应用抗独特型抗体体外致敏的自体DC,目前已取得良好的临床疗效。
2.2.2 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)CIK细胞是指人外周血单个核细胞PBMC在体外经CD3+、CD56+标志为主的免疫效应细胞,同时具有杀瘤活性、NK细胞和非MHC限制性的杀瘤优点。
CIK的特性包括:①增殖能力强,主要效用细胞CD3+CD56+可增殖1 000倍;②杀伤活力强,远优于传统的LAK细胞和细胞因子IFN-γ、IL-2等;③杀瘤谱广,不受MHC限制,可广谱杀肿瘤和病毒,对多重耐药肿瘤细胞仍敏感,杀瘤活性不受环孢素A(CsA)和FK506等免疫抑制剂的影响,能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡;④毒副作用小,无严重不良反应。
体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法,可以在不损伤机体免疫系统结构和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞,调节和增强机体的免疫功能,为预防肿瘤复发,改善晚期患者的生存质量提供了新途径。一般在放疗、化疗后间隔2~4周,机体免疫力有所恢复时,输入CIK细胞,可提高肿瘤患者的缓解率。
近年来,应用CIK细胞进行恶性肿瘤治疗的临床试验在国内外陆续开展,CIK细胞免疫治疗在临床治疗中表现出明显优于其他过继性免疫治疗的强大优势,因而越来越广泛地被应用[18]。
2.2.3 淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell,LAK)LAK不是一个独立的淋巴群或亚群,而是NK细胞或T细胞体外培养时在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞。LAK有广谱抗瘤作用,与IL-2合用的效果比较好,将外周血淋巴细胞在体外经IL-2激活3~5天而扩增的细胞群,经淋巴管途径回输的LAK细胞直接到达次级淋巴器官,并在IL-2的作用下继续增殖、成熟,并保持活性,使得能到达肿瘤组织的细胞数较多,且持续更长,因此杀伤力有力增强。
目前应用LAK细胞过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)与直接注射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤,已获得一定的疗效[19]。
2.3 干细胞 2.3.1 胚胎干细胞(embryonic stem,ESC)ESC是来源于特定解剖部位的细胞,相对于成体干细胞而言,分离和鉴定均比较容易[20]。
胚胎细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小,同时又可以在一定条件下进一步分化成为各种不同的组织细胞,从而构成机体各种复杂的组织器官,并具有形成嵌合体的能力 (包括生殖系嵌合体)。
ESC的基本特点:①来源于早期胚胎,具有与胚胎细胞相似的形态特征,核型正常;②具有与早期胚胎细胞相似的高度分化潜能;③具有培养细胞所有的特征,可在体外培养、增殖、克隆、冻存等,ESC细胞体积较小,细胞核大,集落呈鸟巢状生长,具有稳定的核型,高密度培养时易形成类似早期胚胎组织的类胚体或拟胚体 (embryoid body,EBs);④ESC细胞在体外可以进行遗传操作,是研究动物胚胎早期发生、细胞分化、基因调控等发育生物学基本问题的理想模型,也是组织工程、药理学和临床医学研究的重要工具。
ESC的形态学特点:①ES细胞的形态结构与早期胚胎细胞具有相似性,细胞相对较小,细胞核明显,核质比较高,染色质比较分散,有一个或多个核仁,胞质内除游离核糖体外,其他细胞器很少;②细胞呈多层聚落状生长,紧密堆积在一起,无明显的界限,形似鸟巢。不同物种、不同类型ESC细胞的结构特征有所不同。人和灵长类动物的ESC细胞形态的细胞集落相对扁平、松散,容易被胰蛋白酶消化成单细胞。
ESC的分子生物学标志:①ESC细胞含有丰富的碱性磷酸酶,在已分化的ESC细胞中碱性磷酸酶呈弱阳性或阴性。碱性磷酸酶是一种单酯磷酸水解酶,能在碱性条件下水解磷酸单酯释放出磷酸。碱性磷酸酶的高表达与未分化的多能干细胞密切相关。因其测定方法简单易行,因此常作为ESC细胞鉴定和区分是否分化的重要标志之一;②胚胎阶段特异性表面抗原(SSEA)是一种糖蛋白,常表达于胚胎发育早期的细胞,ESC细胞中SSEA表达阳性,故作为ESC标志分子之一用于ESC鉴定。SSEA的表达有种属特异性,小鼠的ESC以SSEA-1为主,人和灵长类动物的ESC则表达SSEA-3、SSEA-4,而SSEA-1为阴性;③ESC表达出高水平的端粒酶活性,不同于正常二倍体细胞,可能是其复制生命期限远比体细胞长的原因;④Oct-4/Oct-3是含POU结构域的转录因子家族中的一员,目前被广泛用于未分化状态的ESC鉴定。Oct-4最早表达于胚胎8细胞期,发育到桑椹胚时,每个卵裂球中都可以检测到Oct-4大量表达,在胚泡期主要表达于内细胞群细胞。⑤其他标志:除上述以外,ESC还表达干细胞因子、生殖细胞核因子、CD30、GCTM-2、GenesisDG,以及高分子质量糖蛋白TRA-1-60、TRA-1-81等。
ESC的培养特性:目前建立ESC细胞系的方法有许多种,常见的方法包括3个过程:原始ESC获得、ES胞传代培养和ESC鉴定。①原始ESC获得,从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑椹胚或胚泡阶段的早期胚胎,用机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑椹胚或胚泡内细胞群得到原始ESC悬液。②ESC传代培养,将ESC在改良Eargle培养液中培养2~3天,然后转到经放射线照射或丝裂霉素处理的成纤维细胞饲养层上进行传代培养。细胞培养1周左右,挑取细胞集落,用低浓度胰酶分散后,继续传代培养,7~10天传一次。经反复传代培养,可获得生长旺盛的高纯度ESC。ESC的鉴定,长期培养的ESC呈巢式或集落式生长,边缘光滑,细胞排列紧密,并表达上述分子生物学标志。ESC体外生长的环境要求苛刻,原则上应满足两个条件:一是促进细胞的分裂增殖;另一个是抑制细胞的分化。前者受到基本培养液、添加剂、血清和生长因子的影响,后者则涉及动物早期胚胎的胚龄和滋养层细胞种类的选择、条件培养基和生长因子的运用及其它类型(如滋胚层细胞) 的影响。
胚胎干细胞由于来源于胚胎,存在伦理争议,在临床应用上受到了一定限制。
2.3.2 成体干细胞(adult stem cell,ASC)ASC是一类专能干细胞,是存在于发育成熟机体器官组织中的,具有高度自我更新和增殖潜能的未分化细胞,可以分化成为组成该组织或器官的特定细胞类型,起着替换死亡细胞和修复组织功能的作用。ASC主要包括造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞及各种间充质干细胞。在不同年龄段的人体中都存在着ASC。
由于成体干细胞较易获得,致瘤风险相对较低,且不存在伦理学问题,可应用于多种疾病的临床治疗。ASC的分离培养和扩增技术相对成熟,且其疗效在部分疾病的治疗中得到肯定,如造血干细胞移植和间充质干细胞移植等已被证明是安全有效的干细胞疗法。
目前已有多种成体干细胞药物产品完成临床试验走向推广应用[21]。2008年,Osiris的干细胞产品Prochymal在美国上市。它是一种成体干细胞产品,主要用于移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)和肠道炎性疾病Crohn氏病。2010年7月,澳大利亚治疗用品管理局(TGA)批准Mesoblast公司生产和供应自体间充质前体细胞(MPC)产品在澳大利亚上市,该产品主要应用于受损组织的修复和再生。
2.3.3 诱导性多能干细胞 (induced pluripotent stem cell,iPSc)近几年科学家们尝试通过不同途径实现体细胞重编程以获取ESC或ESC样的细胞或iPS细胞[22]。2006年日本京都大学的Takahashi和Yamanaka将4种转录因子基因Oct-3/4、Sox2、c-Myc和Klf4转入小鼠的皮肤成纤维细胞,诱导其转化为具有ESC样特性的iPSc。iPSc的出现无疑将会给移植治疗、药物发现及筛选、细胞及基因治疗和生物发育的基础研究等带来深远的影响。iPS技术克服了免疫排斥和伦理问题,有望用于患者的细胞治疗。2008年7月美国哈佛大学的John Dimos用老年肌萎缩侧索硬化症患者的皮肤制造出iPSc,并将其成果发表在Science杂志上。2009年Cell杂志发表美国Whitehead生物医学研究所等机构用帕金森氏患者的皮肤细胞,通过Cre-LoxP方法培育出了iPSc。2009年Blood杂志,程临钊实验室从多发性骨髓瘤患者的外周血细胞中获得了iPSc。
目前,动物实验证明iPSc能显著改善多种疾病[23]。美国的实验小组将转化得到的iPSc成功用于镰细胞贫血的治疗,通过同源重组的方式纠正了来自患病小鼠的iPSc的基因缺陷,进而通过iPSc分化的造血祖细胞重建了患病小鼠的造血系统,多项血液学指标均明显优于未治疗的对照患病组,证明了iPSc可以在小鼠中用于基因和细胞治疗。iPSc能够恢复心脏病发作后缺失的心肌功能,阻止受损心脏功能损伤进程,并在心脏受损部位再生组织。
2012年美国杜克大学医学院利用iPSc成功地在小鼠实验中培育出软骨,可用于修复组织、研究软骨损伤和骨关节炎病症等。研究人员认为,iPSc有望成为患者专用人造软骨组织的来源。由于iPSc功能强大,实验中需要克服一个难题,让其发育成完全一致的软骨细胞,能产生胶原蛋白并维持软骨,同时要剔除iPSc可能形成的其他类型细胞。为此,研究人员从成年小鼠的成纤维细胞中采集iPSc,诱导它们分化为软骨细胞。并且通过表达绿色荧光蛋白将软骨细胞和其他细胞区别开来。特制细胞也能产生胶原蛋白等更多的软骨成分,并表现出天然软骨特有的硬度,这表明它们在修复身体软骨缺陷方面非常有效。最近伦敦国王学院和旧金山SFVAMC的研究团队利用人类的iPSc生成了角质细胞,首次成功培育了人造表皮,成果发表于4月的Stem Cell Reports杂志上。这种人造表皮拥有功能性的渗透屏障,与真实表皮非常类似。这项研究可以帮助用于研究表皮屏障的正常发育机制,以及皮肤屏障受损的治病过程。
尽管已经建立人类多种器官特异性的iPSc,如来自人成纤维细胞的心肌细胞,但目前iPS技术仍处于实验室阶段,与ESC类似,其安全性、分化和可控性问题仍未解决,外源基因的插入整合及其带来的潜在风险也不容忽视。
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