蜘蛛类属于节肢动物门(Arthropoda)蛛形纲(Arachnida)蜘蛛目(Araneida或Araneae)，多数能吐丝结网，具有较强的生存适应能力。蜘蛛丝是一种高分子蛋白纤维,具有许多重要的优良特性，如非常细小，强度大，柔韧性和弹性都很好，耐冲击力强，耐低温，无论在干燥或潮湿状态下都能保持较好的性能，对环境友好，等等。由于有了这些优良特性，使得蜘蛛丝用途广泛。在军事方面，可用于制造防弹衣、坦克和飞机的装甲、降落伞等；在医学方面，可用于制作人工关节、韧带、假肢，可降解超细伤口缝线等生物材料和生理组织工程材料；在工业方面，蜘蛛丝可用于制作高强度材料、车轮外胎、鱼网等；在建筑方面，可用于制造桥梁、高层建筑和民用建筑等的结构材料及复合材料；在纺织方面，可制作成服装、围巾、帽子等^[1-2]。

然而蜘蛛的产丝量小,提取工艺复杂,且同类相食,无法高密度养殖以获取大量的蜘蛛丝，难以满足实际应用的需要^[3]。于是人们只能着眼于生物工程方法，即将蜘蛛丝蛋白基因转入其它生物体来表达丝蛋白,然后人工纺丝。目前，美国、加拿大、德国、俄罗斯和日本等发达国家已投入大量的人力和物力进行该类研究，吸引了众多的科学家参与此项工作，可以说有关蜘蛛丝的研究已成为当今世界纤维界的热门课题。经过多年的研究，已取得很多重要的进展。例如，利用微生物大肠杆菌来生产这种蜘蛛丝蛋白^[4]；利用植物，如烟草来生产蜘蛛丝蛋白^[6]；利用奶牛等动物来生产蜘蛛丝蛋白^[6]；等等。然而这些方法生产出的蜘蛛丝蛋白必须经过后续的人工纺丝才能转变成有用的丝纤维。目前也有通过转座子piggyBac或其它方法将蜘蛛丝基因导入自然吐丝的家蚕中来生产出有用的丝纤维^[7]。

由于利用不同生物载体表达蜘蛛丝蛋白的研究已有多年历史，并已取得了很多重要的进展，下面重点从不同生物载体法来简述人工生产蜘蛛丝蛋白的研究进展，并讨论各种载体法的优缺点和今后研究展望。

1 微生物载体法

微生物表达体系(特别是大肠杆菌)研究得较为清楚，技术相对成熟，是目前生物工程中用来表达外源蛋白质常用的体系，具有生长周期短、操作简便等优点。早在1995年，Prince等最先尝试利用大肠杆菌来表达蜘蛛丝蛋白。他们首先根据络新妇属蜘蛛的拖牵丝蛋白序列(主要为MaSp1和MaSp2)合成相应的DNA序列，然后通过“从头到尾”构造策略将合成的DNA单体序列多聚化为可以编码大分子质量蜘蛛丝的DNA重复序列多聚体，接着将人工构建好的蜘蛛丝基因克隆进原核表达载体中并使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆菌中表达，利用固相金属亲和色谱和反相高效液相色谱等方法进行分离纯化。纯化所得的蜘蛛丝表达蛋白分子大小为14.7~41.3kDa，且蛋白质表达量随着其分子质量的增大而减小。进一步对人工表达的蜘蛛丝蛋白进行圆二色性分析，发现这些蛋白质具有类似天然蜘蛛丝中所具有的大量β折叠结构^[8]。

随后 Lewis等^[4]将编码蜘蛛丝蛋白MaSp2的重复基因序列加倍至8个、16个和32个连续的单元，并将其通过pET载体转入大肠杆菌中进行表达，分别得到了31kDa、58kDa和112kDa的蛋白质，其中16个单元的重复序列表达量达到了10mg/g，该研究不但提高了蜘蛛丝蛋白表达的产量，且将表达的蛋白质分子质量提高到100kDa以上。

最近Xia等采用提高大肠杆菌内glycyl-tRNA代谢池的方法,成功表达了络新妇属蜘蛛的分子质量为284.9kDa的重组蛋白,其中Gly含量占到了44.9%,这个是目前人工表达出的最大分子质量的蜘蛛丝蛋白，已与天然蛋白质大小相近，并且利用其纺成的纤维具有天然蜘蛛丝一样的机械性能，他们还发现低分子质量的重组蛋白产生的纤维性能较差,其机械性能和蛛丝蛋白大小的进化相关联^[9]。

此外，Fahnestock和Irwin^[10]在采用大肠杆菌来合成生产蜘蛛丝的过程中发现重组蜘蛛丝蛋白的产率随其分子质量的增加而降低。主要原因是大肠杆菌和蜘蛛具有不同的密码子偏好性，且宿主菌通过同源重组常使部分基因删除，使得蜘蛛丝蛋白的翻译有时会提前终止，故表达较长的蜘蛛丝基因时，其产量和均一性均会受到较大的影响。于是他们采取毕赤酵母作为载体来表达蜘蛛牵引丝蛋白，发现蜘蛛丝基因在甲醇诱导的AOX1启动子的控制下能够得到较高水平的表达，但在转化时因基因的重排常产生多种分子质量不同的表达蛋白^[11]。进一步研究发现，在大肠杆菌中表达合成的蜘蛛丝基因，蛋白质翻译提前终止的概率在300或1 000个密码子中出现1次，其能有效表达的蛋白质长度为1 000个氨基酸或更低。而毕赤酵母能持续地表达3 000个密码子以上的基因序列，不会出现蛋白质翻译提前终止的现象，但表达1 600个密码子以上的蜘蛛丝基因时，效率会大大降低^[10-11]。

总之，大肠杆菌是表达重组蜘蛛丝蛋白的常用载体，个别研究中采用了酵母作为载体来表达蜘蛛丝蛋白。由于大分子质量的蜘蛛丝蛋白基因高度的重复结构以及不寻常的mRNA的二级结构,导致其在大肠杆菌或酵母中的转译效率均会明显下降，蛋白质表达量较低。因此要想通过微生物途径获得高产率大分子质量的重组蜘蛛丝蛋白，还需要通过优化遗传信息，调整细菌密码子偏好性等途径来提高外源基因的表达^[12]。

2 植物载体法

由于蛛丝蛋白含有大量的甘氨酸和丙氨酸，由快速生长的微生物表达时需要提供额外的氨基酸代谢池，且蛛丝蛋白高度重复的基因序列容易出现重组而使基因不稳定。与细菌不同,植物本身能利用初始原材料合成氨基酸，且转入植物中的蛛丝蛋白基因不易发生重组丢失，故随着植物生物工程技术的发展，某些科学家尝试用植物作为载体来生产蜘蛛丝蛋白。

2001年Scheller等首先合成编码络新妇属MaSp1的长度为1 800个碱基对的同源cDNA，然后与编码家蚕丝素重链基因的一个片段融合，以期表达出蛛丝蛋白兼具蚕丝的优良性能。将合成的融合基因克隆进特定的载体中，使融合基因的一端与编码信号肽的DNA序列相连，另一端与编码KDEL的DNA序列相连，选择CaMV 35S为启动子，并将构建好的载体分别转化进烟草和马铃薯中。表达的蜘蛛丝蛋白因N端的信号肽及C端的KDEL序列而滞留在内质网中。经检测表达由420~3 600个碱基对编码的重组蜘蛛丝蛋白占了烟草和马铃薯叶片，以及马铃薯块茎中可溶性蛋白的2%以上，且与天然蜘蛛丝蛋白具有90%的同源性。同时发现使用该表达系统，大于100kDa的蜘蛛丝蛋白也能在植物组织中正常表达，并且表达水平不受基因大小的影响。由于高分子质量的蜘蛛丝蛋白具有较好的热稳定性，从而使后续的纯化过程或步骤变得简单而高效^[5]。后来他们改进方法，进一步在烟草和马铃薯中表达了类弹性蛛丝融合蛋白，采用实验室规模的提取方法,结果从1kg的烟草叶片中可提取到80mg的纯蛋白质，表明蛋白质表达水平得到了很大的提高 ^[13]。

Barr等^[14]也曾尝试在拟南芥的叶片和种子，以及大豆体细胞胚中表达络新妇属类MaSp1蛛丝蛋白，重组蛛丝蛋白在叶片中选用35S启动子驱动，在种子和大豆体细胞胚中则选用β伴大豆球蛋白的α亚基启动子驱动。结果表明，在这些植物载体中同样可以表达蜘蛛丝蛋白，且发现蜘蛛丝蛋白在种子中的积累水平比在叶片中的高。

后来更多的研究结果表明，利用植物载体确实能够比较完整地表达大分子重组蜘蛛丝蛋白，并且通过转基因靶向性及融合类弹性多肽等措施可以提高蜘蛛丝重组蛋白在植物中的表达水平^[15-17]。

Hauptmann等^[18]最近使用内含肽依赖的转译后蛋白融合技术在烟草叶细胞的内质网中表达络新妇属蜘蛛的一个天然大小的FLAG蛋白基因，这种方法避免了高度重复的转基因造成的高度的基因和转录的不稳定性。通过内含肽介导的蛋白质单体的聚合，他们利用植物载体成功得到了大于250kDa的高分子质量的蛛丝蛋白，且这种多亚基结构的蛛丝蛋白可形成微纤维，表明其可作为潜在的生物材料。

虽然在植物中还未能生产出接近天然大小的重组蜘蛛丝蛋白，且未来仍具有一定的难度和挑战性，加上目前在植物中表达提取的蛛丝蛋白还未能成功纺丝，离实际应用还有一定的距离。但植物作为蛛丝蛋白的一种表达体系，随着技术的不断完善和进步，相信将来会有很大的开发应用价值。

3 哺乳动物载体法

哺乳动物细胞同样能有效克服蜘蛛丝基因在大肠杆菌等微生物载体中表达出现的翻译提前终止现象,且能表达大分子质量的蛋白质。

首次在Science杂志上成功报道用哺乳动物作为载体生产蜘蛛丝的工作是由加拿大耐克夏(Nexia)生物科技公司和美国陆军那提克(Natick)研究中心的学者共同完成的。他们首先构建了2个不同的蜘蛛丝基因单体序列：蜘蛛牵引丝基因MaSp1 cDNA及ADF-3 cDNA，再通过加倍形成不同大小的多聚体基因序列，然后分别转入牛乳腺上皮泡状细胞和仓鼠肾细胞中进行表达，结果表达出的重组MaSp 1和ADF-3蛋白质分子质量为60~140kDa，并发现在仓鼠肾细胞中110kDa和140kDa蛛丝蛋白的表达量远远低于60kDa单体蛋白的表达量。此外，这些研究人员还通过纺丝技术将表达纯化的蜘蛛丝蛋白纺制成世界上首例人工蜘蛛丝纤维，并命名为“生物钢”。其不仅具有蚕丝般的质感和光泽,而且具有弹性强、重量轻、强度高等许多优良特点^[6]。

在我国，Xu等^[19]将人工合成的MaSp1和MaSp2(40kDa和55kDa)基因克隆进pBC1表达载体，并插入羊的β酪蛋白启动子序列，构建好的载体显微注射进昆明白鼠受精卵的细胞核中，结果获得的转基因鼠能在奶中表达出重组蜘蛛丝蛋白。此后也有人利用山羊、猪等成功生产出重组的蜘蛛丝蛋白 ^[20-24]。总体来讲，随着家蚕生物反应器技术的进步，人们逐渐放弃利用哺乳动物作为载体来生产蜘蛛丝的研究，因为饲养哺乳动物比较昂贵，且合成的蜘蛛丝在哺乳动物中无法像家蚕那样可以自然结成丝。

4 家蚕载体法

家蚕能合成大量的蛋白质,也能吐丝结茧,并可以大规模饲养,是研发较多的生物反应器类型。蛛丝蛋白与蚕丝蛋白均由串联重复序列组成，都富含Gly和Ala；基因序列与结构也很相近，由大量的重复序列组成，富含较高的GC；加上蜘蛛和家蚕具有类似的纺丝系统，随着家蚕核型多角体病毒杆状表达系统的成熟及转基因技术的开发和不断进步，多个国家正在致力于利用家蚕作为载体来生产蜘蛛丝。

起初Miao等^[25]利用家蚕核型多角体病毒杆状表达系统在家蚕细胞系中成功表达了37kDa的重组蜘蛛鞭状蛋白。随后Zhang等^[26]采用同样的表达系统，在家蚕细胞系和其幼体中表达出了络新妇属重组牵引丝蛋白MaSp1和荧光蛋白EGFP的融合蛋白，分子质量为70kDa左右，此融合蛋白在家蚕细胞系中的表达量大约占细胞总蛋白质量的5%，而在单个幼体中的表达量大约为6mg。同时发现表达的融合蛋白倾向于自组装而形成聚集体，导致高达60%是不溶的，这可能是融合蛋白产量过低的主要限制因素，故Zhang等建议研发转基因家蚕，在其丝腺中直接生产蜘蛛丝纤维。

目前将外源基因导入家蚕基因中主要有两种明显不同的方法：第一种是通过杆状病毒作为载体来实现，通常效率较低，转基因后代低于0.2%^[27]；第二种是利用piggyBac作为载体来实现，转基因效率比前者提高10倍左右^[28]。

日本、美国等国家已有多个机构正从事转基因家蚕的开发，以求大量生产蜘蛛丝^[29]，在我国也有多家单位正在从事类似的工作，如西南农业大学、浙江大学、重庆大学、苏州大学、中山大学等。首先见诸报道的是Wen等^[30]利用piggyBac转座子将蜘蛛牵引丝MaSp1基因和丝胶1启动子基因整合到家蚕的基因组中，筛选到的转基因家蚕在其吐丝所结的蚕茧中检测到含有MaSp1蛋白，说明在获得的转基因家蚕中，蜘蛛牵引丝MaSp1基因在丝胶1启动子的作用下，在家蚕丝腺中合成并和蚕丝蛋白一起被成功地分泌到蚕茧中，此外，和野生型的蚕丝相比，重组丝显示更高的张力和弹性。 随后Tuele等^[31]利用piggyBac转座子将一段编码78kDa蜘蛛丝蛋白质基因导入家蚕基因组中，并利用家蚕丝素重链基因启动子使外源蜘蛛丝基因定向在家蚕丝腺中表达，从而生产出复合的蚕丝/蛛丝蛋白纤维，该复合纤维的强度几乎与天然蜘蛛牵引丝纤维的强度一样，远远大于蚕丝纤维的强度，表明转基因家蚕可以生产出包含蜘蛛丝蛋白序列且机械性能得到很大改善的复合丝纤维。

最近Kuwana等^[32]利用piggyBac作为载体，将构建好的大腹园蛛牵引丝和家蚕丝素重链融合基因转入家蚕基因组中，筛选到的各个转基因家蚕个体表达的蜘蛛丝蛋白占家蚕本身丝蛋白总量的0.37%~0.61%。挑选产丝量较好的转基因家蚕品系C515进行详细观察研究，发现该转基因家蚕品系所产的茧中能抽出天然的蚕丝，其韧性因引入蜘蛛丝蛋白后被提高了53%，而蚕丝质量的改善程度取决于蜘蛛丝蛋白的表达量。他们还将这种带有蜘蛛丝蛋白的复合丝纤维编织成背心和围巾等衣物，实现了用转基因家蚕生产出的蜘蛛丝纤维的第一次真正意义上的应用。

5 总结与展望

目前借助生物工程的方法已能利用不同种类的生物载体来人工生产蜘蛛丝蛋白，并取得了不少的研究成果和进步。但在利用微生物、植物和哺乳动物作为载体时，除了遇到各自的特有问题外，都面临到同样的一个难题，即生产出的蜘蛛丝蛋白如何纺成有用的丝纤维？不但纺丝技术还有待改进和提高，而且后续的纺丝成本也是影响其实现应用的关键之处。随着各种技术的进步，虽然现在可以通过转座子piggyBac等方法将蜘蛛丝基因导入自然吐丝的家蚕中生产出有用的丝纤维^[7]，但由于家蚕本身合成大量丝蛋白，占用了体内过多的氨基酸资源，使得外来基因所用氨基酸资源有限，产量严重受到影响。鉴于上述原因，我们实验室正采用CRISPR-Cas9核酸酶技术结合同源重组(基因打靶)方法来敲掉家蚕丝素重链基因，达到减少家蚕自身丝蛋白大量合成的目的，并将蜘蛛丝基因插入到这个部位，且利用家蚕丝素重链基因上游的启动子调控序列控制蜘蛛丝基因只能在家蚕丝腺中表达。这样不但可以利用转基因家蚕高效合成蜘蛛丝蛋白，而且能通过家蚕特有的产丝器官将这些蜘蛛丝蛋白直接转变成丝纤维，从而可以解决利用其它生物作为生物反应器所面临的不能将合成的蜘蛛丝蛋白转变成有用的丝纤维的难题。该研究一旦获得成功，将能获得稳定高效表达蜘蛛丝基因的转基因家蚕体系，从而可大量生产蜘蛛丝，不但能解决蜘蛛丝纤维资源紧缺的问题，而且经济意义重大，并能推进家蚕生物反应器的技术革新。