2016, Vol. 36文章信息
- 张宇萌, 童梅, 陆小冬, 米月, 徐晨, 姚文兵.
- ZHANG Yu-meng, TONG Mei, LU Xiao-dong, MI Yue, XU Chen, YAO Wen-bing.
- 提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率的研究进展
- Advances in Promoting Soluble Expression of Recombinant Protein in Escherichia coli
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(5): 118-124
- China Biotechnology, 2016, 36(5): 118-124
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160517
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文章历史
- 收稿日期: 2015-11-12
- 修回日期: 2015-12-21
2. 北京三元基因药业股份有限公司 北京市长效干扰素工程技术研究中心 北京 102600
2. Beijing Tri-Prime Genetic Engineering Co., Ltd, Engineering Research Center of Beijing of Pegylated Interferon, Beijing 102600, China
重组蛋白的出现极大地扩充了可用于生化及结构生物学研究的蛋白质种类，值得注意的是，仅在2003~2006年就有31种重组蛋白作为治疗性蛋白质经FDA批准上市[1]。尽管多种非细菌类重组蛋白表达系统，如酵母，哺乳动物细胞等表达系统得以逐渐完善，但大肠杆菌作为宿主在重组蛋白的表达上仍然具有显著优势[2-8]。大肠杆菌表达系统相比于其他表达系统具有培养周期短、培养条件容易获得、目的蛋白表达水平高等特点。但相比真核细胞，大肠杆菌无法实现蛋白质转录后的修饰，同时大肠杆菌胞质内还原性环境不利于蛋白质分子内或分子间二硫键的形成，造成重组蛋白部分折叠、错误折叠或未折叠进而导致重组蛋白无法实现可溶性表达。为实现重组蛋白的可溶性表达，常用的思路有两种：①周质空间表达。大肠杆菌周质空间是指细胞膜与细胞壁间的狭窄空间，周质空间内的氧化性环境能够促进正确二硫键的形成，同时其内部蛋白酶含量较低，能够有效避免重组蛋白的降解[9]。与目的基因融合的信号肽序列经转录翻译，产生的疏水性信号肽能够引导重组蛋白至周质空间。②胞质内表达。为了克服胞质内的还原性环境，可以选择胞质重要还原酶(如谷胱甘肽还原酶gor及硫氧还蛋白还原酶trxB)的突变型菌体作为工程菌，这类工程菌能够有效降低大肠杆菌胞质内的还原性，从而有助于胞质内表达的重组蛋白形成正确的二硫键。同时部分蛋白酶(如lon和ompT蛋白酶等)基因缺陷型工程菌能够避免重组蛋白在胞质内被蛋白酶降解。本文将从启动子的选择、SD序列的引入、信号肽的优化、宿主细胞的选择、共表达其他蛋白质，高密度发酵等方面综述提高可溶性表达重组蛋白产率的研究策略。
1 提高可溶性表达重组蛋白产率的策略 1.1 启动子的选择启动子及其他载体元件能够显著影响目的基因转录的强度与持续性，进而影响目的蛋白产率。合适的启动子应当具有以下三个特征：①能够实现目的基因的高效表达(通常使目的蛋白占菌体总蛋白质的10%~50%)；②减少本底表达，防止本底表达的目的蛋白对宿主对数生长期造成负面影响；③诱导方法简单、经济。
启动子的选择应当综合考虑重组蛋白的性质，如果目的蛋白为毒性蛋白，如蛋白酶等，启动子需要严格限制本底表达，如araBAD等；如果需要提高蛋白质产量，可以选择强启动子，如T7和tac等；如果目的蛋白具有聚合倾向，可能需要冷启动启动子，见表 1。经典的lac启动子为低强度启动子，能够有效避免重组蛋白表达速率过快而无法正常折叠造成的包涵体的形成，但lac启动子的蛋白质表达水平较低，无法满足重组蛋白工业生产的需要。对于重组蛋白的工业生产，通常采用强启动子并优化表达和诱导条件来减少包涵体的形成，如表达赛妥珠工程菌采用的是tac启动子而非lac启动子。因此，在启动子的选择上需要综合考虑目的蛋白的性质和所要达到的目的。
1.2 SD序列的作用
原核基因核糖体结合位点(RBS)是指开始于转录起始位点，并具有几个碱基长度的一段序列，其紧邻启动子下游。RBS中与rRNA 16S亚基3′，端互补的序列称为Shine-Dalgarno序列(SD序列)，见图 1。SD序列为一段富嘌呤区，常见序列为AAGGA及UAAGGAGG。SD序列可以减少mRNA形成能够降低翻译效率的二级结构，因此对形成翻译起始复合物，有效地进行蛋白质翻译是必需的。由于不同基因不同的5′端结构，表达载体的RBS为变量，同时不同的RBS序列在mRNA的翻译效率上具有明显差异[15]，具体表现为：①UAAGGAGG型SD序列的翻译效率要比AAGGA型高；②较高翻译效率的SD序列的特征还包括，起始密码子与AAGGA的最适距离为5~7bp，与UAAGGAGG的最适距离为6~8bp；③SD序列与起始密码子之间的碱基具有A、T丰富的特征时，大肠杆菌具有较高翻译效率。Corisdeo和Wang等[16]在研究破伤风毒素抗体片段(Fab)时发现，通过周质表达的抗体证明SD序列对提高Fab片段产率具有重要作用。
另一种提高可溶性蛋白表达的策略为信号肽优化，大肠杆菌周质空间中蛋白质的种类少、数量低，且蛋白酶含量也较低，因此目的蛋白在周质空间中的表达有利于分离纯化和减少蛋白酶的降解。目的蛋白被转运至周质空间过程中信号肽被酶切，且氧化性的周质空间有助于目的蛋白的正确折叠与正确构象的维持。由于具有以上优点，周质空间表达一直是可溶性表达的研究热点。目前已有许多信号肽序列被应用使目的蛋白转运至周质空间，如大肠杆菌的phoA、ompA、ompT、ompF、lamB信号肽，欧文氏菌pelB信号肽，粪肥单胞菌cex信号肽，等等。信号肽基因定位在分泌型蛋白质基因3′端，信号肽在结构上具有三种结构域：N末端碱性区域，中心亲水区域和C端剪切区域。
Humphreys等[18]利用信号肽基因密码子的摆动性通过改变信号肽基因的密码子构建了不同的Fab′，片段表达质粒，用大肠杆菌W3110细胞系分别进行发酵和抗体纯化，最终可以将Fab′，片段的产率提高到580mg/L发酵液。Susanne等[16]研究了OmpA与PelB作为Fab片段轻、重链信号肽的组合情况，证明了PelB作为轻链信号肽、OmpA作为重链信号肽，且轻链位于重链前的排列顺序可以得到最高的可溶性表达量。Nagano和Masuda等[19]研究表明，信号肽C端剪切区域的丙氨酸残基对Fab片段分泌产量具有重要作用，对信号肽C端剪切区域基因进行改造，将丝氨酸残基替换为丙氨酸残基后，构建了4种不同的质粒，即信号肽C端剪切区域为三个丝氨酸(SSS)、一个丙氨酸两个丝氨酸(ASS)、两个丝氨酸一个丙氨酸(SSA)、一个丙氨酸一个丝氨酸一个丙氨酸(ASA)，其中应用ASA质粒发酵产生的抗体产量出现显著提高。
1.4 宿主细胞的选择具有不同特性的工程菌对重组蛋白的可溶性表达具有重要意义，目前已有多种商品化的大肠杆菌株能够协助重组蛋白的可溶性表达，见表 2。
| 特征 | 商品化大肠杆菌细胞类型 |
| 蛋白酶缺陷型菌株 | BL21、BL21(DE3)、BL21Star(DE3) |
| 有助于二硫键形成的菌株 | BL21 trxB、Origami、Rosetta-gami |
| 表达稀有tRNA的菌株 | BL21-RP、BL21-RIL、BL21-RPIL、Rosetta、Rosetta-gami |
| 表达毒性蛋白的菌株 | BL21-AI、pLysS |
大肠杆菌BL21菌株及其衍生菌株被广泛用于重组蛋白的表达，该类菌株为蛋白酶(如lon和ompT蛋白酶等)基因缺陷型菌株，能够有效避免重组蛋白酶解，ompT蛋白酶能够特异性剪切T7 RNA聚合酶，lon蛋白酶能够快速降解异源重组蛋白。用噬菌体DE3(表达T7 RNA聚合酶)的溶源菌，如BL21(DE3)为工程菌，尤其适用于T7启动子系统。BL21Star(DE3)作为BL21(DE3)的衍生株，含有一个rne基因的额外突变，该基因编码的RNase E是降解胞内mRNA的“降解子”的核心酶，其突变型菌株能够提高mRNA的稳定性，进而提高重组蛋白产率[20]。Ali等[21]在探究是何种蛋白酶导致了Fab片段降解时，在培养基中添加了不同的蛋白酶抑制剂进行发酵，最终确定丝氨酸蛋白酶抑制剂可以大幅度提高6D9 Fab的产率，进而利用丝氨酸蛋白酶缺陷型大肠杆菌BW25113的双蛋白酶缺陷型(△degP-△ompT)进行发酵，证实抗体产量有所增加。
转运亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸及脯氨酸等氨基酸的tRNA对于大肠杆菌而言是稀有tRNA，这种现象会导致重组蛋白基因在宿主细胞中的转录延迟甚至产生氨基酸错配[22]。但目前已有多种携带表达稀有tRNA质粒的工程菌被构建，如BL21-RP、Rosetta、Rosetta-gami等，这些质粒能够有效提高含有稀有氨基酸目的蛋白的翻译效率。带有trxB/gor突变的Rosetta-gami菌株能够有效辅助大肠杆菌胞质内重组蛋白二硫键的形成[23]。
由于BL21 trxB、Origami等携带trxB/gor突变，从而降低了胞质内的还原性，因而这些菌株能够帮助胞质内重组蛋白二硫键的形成。Bessette等[24]利用trxB/gor突变菌株FA113表达了多种重组蛋白，如碱性磷酸酶(两个二硫键)、短型人组织纤溶酶原激活剂(9个二硫键)、人组织纤溶酶原激活剂(17个二硫键)，证明了这些胞质表达的重组蛋白比周质表达的重组蛋白可溶性表达产率更高。
对于毒性重组蛋白，如核酸酶等，其的存在会对宿主生长造成负面影响，尤其对于高密度发酵而言，毒性重组蛋白的存在会造成宿主生长缓慢甚至自溶死亡进而无法实现高密度发酵。因此需要使用严格调控型的菌株，如BL21-AI、pLysS等。BL21-AI的T7 RNA聚合酶受低本底表达的araBAD启动子控制，可实现对毒性蛋白表达的严格调控，Chen等[25]使用该菌株表达了多种重组蛋白，实现了产率超过30mg/L的可溶性表达。
1.5 共表达其他蛋白质 1.5.1 共表达核酸酶大肠杆菌经超声破菌或渗透压破菌后，由于大肠杆菌高分子量的核酸存在导致裂解液粘度过大给过滤等操作造成困难，这种现象在高密度发酵时更为明显，进而影响了过滤的速率同时也造成了目的蛋白的损失，因而消除宿主细胞核酸的影响对提高重组蛋白可溶性表达的产率至关重要。采用在细胞裂解液中加入核酸酶的方法虽然可行，但成本过高。Nesheth等[26]构建了载有核酸酶基因的质粒pQR794和载有Fab片段基因的质粒pTTOD A33，两者均在大肠杆菌W3110细胞系周质空间表达，实验证明共表达核酸酶并没有损害宿主细胞的生长同时能够在细胞破碎后的数分钟内使得裂解液澄清，经过20L和75L发酵罐发酵后所得纯化抗体的产率平均约为400mg/L发酵液。可见在不同质粒上共表达核酸酶对于提高抗体产量和提高粗纯效率具有重要指导意义。
1.5.2 共表达分子伴侣分子伴侣是一类能够协助蛋白二硫键形成和蛋白折叠的细胞因子。在大肠杆菌中表达通常会因无法形成正确二硫键及正确构象而聚集成无活性的包涵体，且包涵体的变复性工艺极其困难。共表达参与蛋白质折叠的酶及分子伴侣可使重组蛋白可溶性表达的比例显著提升。同时重组蛋白通常具有分子内和分子间二硫键，分子内二硫键对于重组蛋白的活性和稳定性具有重要作用，因此分子内二硫键的形成是抗体等重组蛋白形成的限速步骤，因而有助于半胱氨酸残基暴露和二硫键形成的分子伴侣有助于提高重组蛋白的可溶性表达产率。通常情况下，大肠杆菌周质空间通过二硫键形成酶(Dsb等)维持适当的氧化还原态势使蛋白质的二硫键形成，肽酰脯氨酰顺反异构酶(FkpA、SurA等)在重组蛋白的正确折叠上也起重要作用。可用于提高重组蛋白可溶性表达的分子伴侣有二硫键形成酶(DsbC、DsbG)、二硫键异构酶(PDI)、GroEL、GroES、 DnaJ、DnaK、见表 3。
已有研究表明，人蛋白质二硫键异构酶(hPDI)在大肠杆菌中共表达可以促进在周质空间表达的果胶裂解酶，组织纤溶酶原激活剂二硫键的形成和正确折叠；对hPDI的研究表明，其能互补dsbA缺陷型菌株，因此其二硫键异构酶的功能有效地弥补了DsbA和DsbB的不足[27]。Humphreys等[28]通过共表达PDI将周质空间内的目的蛋白含量提高到了1.5mg/ml。Reilly等[29]通过DsbA-DsbC共表达系统结合高密度发酵使Fab产率达到了1 050mg/L。
目前研究更多的是分子伴侣的组合使用，如DnaK-DnaJ-GrpE系统和GroEL-GroES系统。这两种分子伴侣系统均通过结合到重组蛋白溶剂暴露的疏水区域防止邻近多肽的聚合进而调节促进重组蛋白正确构象的形成[30]。Chen等[25]证明了DnaK-DnaJ-GrpE系统对提高重组蛋白周质可溶性表达产率的有效性。Sahu等[31]使用GroEL-GroES系统得到了类似效果。值得注意的是，多种分子伴侣共表达会导致宿主代谢负担，而且不同分子伴侣组合针对不同重组蛋白可溶性表达的作用，需视具体实验确定。
1.6 高密度发酵对于以实现重组蛋白工业化生产为目标的研究，高细胞密度培养技术至关重要，得到高密度菌体是提高重组蛋白的前提，因此在生物反应器中生产重组蛋白时可以通过设计各种培养策略以获得更高的体积产率。常用的培养方式有分批补料、恒pH补料和恒溶氧补料等。目前认为，每升发酵液菌体质量(干重)在100g以上的发酵即为高密度发酵。但高密度发酵需要解决诸多限制因素，如溶氧、乙酸积累等，这些限制因素可通过优化培养策略得以解决。Velmurugan等[36]采用恒pH流加的方式进行了Fc受体Ⅱa的高密度发酵，发酵结束时OD600为100，可溶性目的蛋白体积产率为4.4mg/ml。Kotik等[37]研究了分批补料并优化培养基的组成发酵重组吡喃糖氧化酶，得到菌体收率(干重)为33g/L，目的蛋白体积产率为33mg/L。Zou等[38]通过控制诱导物的加入速率[0.4g/(h·L)]，采用分批补料方式发酵支链淀粉酶，得到菌体收率(干重)为15g/L。Zhang等[39]优化了链霉素Protein G高密度发酵中涉及的溶氧、pH、初始接种量及发酵策略等因素，最终得到的菌体干重为80~150g/L，且目的蛋白产率最高为1g/L。Yang等[40]采用分批补料方式发酵幽门螺杆菌多表位疫苗，且在诱导阶段使用甘油而非葡萄糖作为碳源，证明了该种诱导方式不仅可以降低乙酸的积累，而且菌体得率可达70g/L，目的蛋白占菌体总蛋白质的32%。Faust等[41]采用新型微流设备并使用酶催化的葡萄糖释放系统进行补料，最终OD600可达114~133，且菌体干重为70g/L重组蛋白高密度发醇实例对比见表 4。
值得注意的是，在高密度发酵过程中，诱导温度与诱导剂浓度对可溶性目的蛋白终产率有重要影响。降低诱导温度通常能够提高重组蛋白的可溶性表达[42-43]。较低的温度能够降低转录、翻译和细胞分裂的速率，为重组蛋白二硫键的形成及正确折叠赢得了时间，因此能够减少包涵体的过量形成，同时低温也抑制了蛋白酶的活性，抑制了重组蛋白的酶解。通常将大肠杆菌在37℃下培养至对数生长的中后期，之后将诱导温度降低到15~25℃。值得注意的是，由于低温降低了菌体的生长和表达速率，因此需要更长的培养时间来实现可溶性高表达，通常20℃诱导时间为18~20h。除温度外，诱导剂浓度对重组蛋白的可溶性表达也有显著影响，常用的诱导剂有L-阿拉伯糖、α-乳糖、异硫代半乳糖苷(IPTG)等。Turner和Holst[44]研究发现，重组环麦芽糖糊精酶的可溶性对IPTG的浓度具有高度敏感性：当IPTG浓度为0.05mmol/L时，表达的重组蛋白具有可溶性和活性；当IPTG浓度为0.1mmol/L时，表达的重组蛋白为不具活性的包涵体。
2 总结与展望综上所述，目前已有多种方案在大肠杆菌胞质或周质空间实现重组蛋白的可溶性表达，但由于重组蛋白种类不同，以上方法的不同组合所达到的效果也不同，且需要探究高效的破菌及纯化方法，尤其对于周质空间表达可溶性重组蛋白而言，由于胞质内重组蛋白携带信号肽，只有被转运到周质空间的目的蛋白为无信号肽形式。总之，需探究多种途径，采取最优化的方案以提高可溶性重组蛋白的产率。
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