2016, Vol. 36文章信息
- 柯霞, 丁冠军, 孙骏, 王露, 郑裕国.
- KE Xia, DING Guan-jun, SUN Jun, Wang Lu, ZHENG Yu-guo.
- VD3羟化酶及其电子传递链的体外构建及活性研究
- Vitamin D3 Hydroxylase and Its Electronic Transfer Chain in vitro Construction and Activity Analysis
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(5): 89-96
- China Biotechnology, 2016, 36(5): 89-96
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160513
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文章历史
- 收稿日期: 2015-12-28
- 修回日期: 2016-01-25
活性维生素D3[25(OH)VD3，1α,25(OH)2VD3]是体内维生素D3发挥生理作用的基本形式，较维生素D3具有更高的生理活性[1]。目前在世界范围内对于活性维生素D3类药物的研究十分活跃，已有他卡西醇(Tacalcitol)、马沙骨化醇(Maxacalcitol)等9个相关药物产品上市，10余个活性维生素D衍生物处于临床I~III期研究，但这些产品被瑞士、美国、日本等少数发达国家垄断[2-3]。活性维生素D3的合成法主要包括热化学合成、微生物发酵及生物转化三种方式，化学合成法是目前获得活性维生素D3的主要生产方式，由于涉及多步复杂的化学反应过程，且分离纯化过程复杂，目的产物收率低[4]，以马沙骨二醇为例，最高产物回收率为21%[5]。微生物发酵法是利用代谢工程手段以酿酒酵母细胞为底盘细胞，通过敲除ERG6及ERG5基因，将麦角固醇合成通路转变为胆甾醇合成通路，结合酿酒酵母细胞高密度发酵技术获得生产活性维生素D3的关键中间体胆甾5,7,24-三烯醇的累积，但由于链甾醇在酿酒酵母甾醇合成代谢比例低，代谢途径复杂，众多副产物的累积加重了目的产物的纯化难度。生物转化合成过程如图 1所示，生物转化法以维生素D3为底物，早期以野生菌株中内源性的P450羟化酶催化维生素D3的C-1位及C-25位发生羟基化合成活性维生素D3，目前筛选获得具有维生素D3羟化能力的野生菌包括链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)等多种微生物[6-8]，但野生菌转化体系中存在酶活低、选择性差等缺点，导致反应周期长，底物浓度及转化率较低。
近年来，随着基因工程技术在生物转化中的广泛应用，关于细胞色素P450单加氧酶结构与功能的研究相继展开，具有高活力及高选择性的维生素D3羟化能力的单加氧酶被相继克隆，并在重组细胞中实现活性表达[9]。相较于传统的野生菌转化体系，该工艺能够有效提高反应体系中的底物浓度、转化率并显著降低反应时间[10-11]。 由此，利用分子生物学手段，在重组细胞中构建维生素D3羟化反应的关键酶体系，是实现活性维生素D3高效合成的有效手段。
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| 图 1 VD3羟基化转化成活性维生素D3反应过程 Figure 1 The hydroxylation processes of vitamin D3 catalyzed by Vdh to convert to active form |
维生素D3羟化酶(Vdh)广泛存在于哺乳动物、昆虫及植物细胞中，能够选择性催化维生素D3的25位C发生羟基化，参与催化甾醇、脂肪酸、前列腺素等多种生物活性物质的合成，具有很高的应用潜力[12-14]。作为P450单加氧酶家族成员，Vdh由P450部分(活性中心提供电子传递的硫铁蛋白)及还原酶部分(亚铁红素催化活性中心)组成，其催化的羟化反应过程复杂，涉及多个步骤：通过电子传递系统，将电子从NAD(P)H转移到NAD(P)H——铁氧还蛋白还原酶，然后到细胞色素P450活性中心，使分子氧(O2)还原活化，随后将其中一个氧原子加到底物中，总反应式如图 2所示。
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| 图 2 P450单加氧酶催化底物的总反应式 Figure 2 Reaction equation catalyzed by P450 monooxygenase |
P450酶系催化反应进程依赖辅酶NAD(P)H及复杂的电子传递链体系。基于电子传递链各组分的复杂性及不稳定性，相对表达量低。因此，在实现Vdh 酶活性表达的基础上，利用DNA重组技术构建高效电子传递链是实现维生素D3活性转化的核心问题。本文利用基因克隆手段，在大肠杆菌细胞中可溶性诱导表达来源于自养无枝酸菌中的Vdh，以及与其偶合效率较高的铁氧化还原蛋白还原酶(FdR)和铁氧化还原蛋白(Fdx)，评价Vdh、FdR和Fdx的体外偶联活性，并进一步探究该电子传递链的辅酶偏好性，最后初步建立了以维生素D3为底物催化合成25(OH)VD3的催化反应体系。
1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 菌种与质粒羟化酶Vdh基因来源于自养无枝酸菌(Actinomycete Pseudonocardia Autotrophica NBRC 12743)基因(GeneBank：BAH58688.1)；电子传递链Fdr、Fdx基因(铁氧还蛋白还原酶-铁氧还蛋白)来源于不动杆菌(Acinetobacter sp. OC4)基因(GeneBank：AB221118.1)；大肠杆菌E.coli BL21(DE3)与质粒pET-28b为本实验室保藏。
1.1.2 培养基及试剂LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母抽提物5，氯化钠10，pH自然。LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母抽提物5，氯化钠10，琼脂20，pH自然。维生素D3、25(OH)VD3、2,6-二氯靛酚钠(DCIP)及细胞色素c购自北京百灵威科技有限公司，连二亚硫酸钠(Na2S2O4)购自西陇化工股份有限公司。
1.2 实验方法 1.2.1 菌种的构建Vdh及Fdr-Fdx基因序列由上海桑尼公司合成，并通过NdeI、XbaI限制性内切核酸酶位点连入表达载体pET28b中，如图 3所示，其中，FdR与Fdx基因序列中插入了核糖体连接位点(ribosomal binding sites，RBS)序列(GAGCTCGGTACCCGGGGATCC AAGGAGATATAC)实现串联表达。
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| 图 3 质粒pET28b-Vdh和pET28b-FdR-Fdx谱图 Figure 3 Structure diagram of pET28b-Vdh and pET28b-FdR-Fdx |
将重组大肠杆菌接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中(接种量为1%～2%)，37℃，150r/min振荡培养至OD600为0.6~0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，24℃、150r/min培养20h。诱导结束后，用0.85% NaCl洗涤，离心收集菌体。1g菌体用20ml Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬，冰上超声破碎，离心分离上清液和沉淀，上清液为粗酶提取物，利用BCA蛋白定量法及特异吸收峰的光谱吸收值定量蛋白质浓度。
1.2.3 蛋白质纯化利用镍柱亲和层析纯化Vdh、FdR、Fdx蛋白，经过离子螯合、上样、洗杂、洗脱及透析后，获得纯蛋白质，利用SDS-PAGE凝胶电泳及BCA蛋白定量法分析酶的纯化效果及酶浓度。
1.2.4 CO差光谱法测定 Vdh活性将纯化的Vdh酶液在强还原剂连二亚硫酸钠不同浓度处理后(30mmol/L、60mmol/L、90mmol/L)，缓慢通入一定时间的CO(0s、60s、90s、120s)，结束后即用酶标仪检测样品在350～550nm处的吸光值变化。
1.2.5 电子传递链的功能研究2,6-二氯靛酚钠(DCIP)可介导FdR从NAD(P)H传递过来的电子，从而可根据600nm处吸光值的降低速率来评价FdR对NAD(P)H的氧化活性，以及FdR对NADH/NADPH的偏好性；细胞色素c可接受由Fdx传递过来的电子，根据550nm处吸光值的升高速率来评价Fdx的氧化活性；NADH在340nm处有特殊吸收峰，可通过检测340nm处吸光值的变化检测NADH的消耗量。1ml反应体系中，粗酶液FdR-Fdx和Vdh均用Tris-HCl缓冲液稀释100倍，在1.5ml EP管中添加粗酶液FdR-Fdx、Vdh和Tris-HCl缓冲液后，混匀，取180μl加入96孔板，最后加20μl NADH(终浓度100μmol/L)启动电子传递反应，不添加NADH的加20μl Tris-HCl缓冲液补足体系，用酶标仪检测340nm处5min内吸光值的变化。
1.2.6 维生素D3羟化反应体系及检测方法的建立10ml催化反应体系如下：在离心管中添加9ml粗酶液(设置粗酶液比例：Vdh∶FdR-Fdx = 5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶8)、1ml NADH(终浓度10mmol/L)、100μmol/L维生素D3/50μl DMSO，每组三个平行样，30℃、150r/min水浴摇床上反应12h，反应结束后用乙酸乙酯萃取，浓缩至500μl，利用高效液相色谱法(HPLC)进行检测，流动相为甲醇，紫外检测波长为265nm，柱温40℃，流速为1ml/min。
2 结果与讨论 2.1 Vdh及FdR、Fdx重组质粒的构建、表达及纯化双酶切结果证实1 500bp片段大小的Vdh基因成功插入了表达载体pET28b中[图 4(a)]，菌落PCR法证实Fdx及FdR的重组质粒构建成功[图 4(b)、(c)]。此外，考察了BL21(DE3)/pET28b-Vdh可溶表达情况(图 5)。早期研究发现，高等动、植物的线粒体及大部分微生物的P450单加氧酶部分结构锚定于线粒体内膜上，其活性表达及完整电子传递链的构建需要线粒体膜的辅助作用，难以在缺乏内膜系统的原核细胞中实现成功表达，该酶的特性极大地限制了在廉价宿主菌(如大肠杆菌细胞)中建立高效的选择性羟化反应体系。Fujii等从自养假诺卡式菌NBRC12743中纯化并克隆出的Vdh能够高效选择催化维生素D3母核中C-1及C-25发生羟化，且其蛋白质结构不含跨膜结构域，分子质量为44.368kDa[7, 15]。为提高Vdh的稳定性，本研究在其N端添加了50个氨基酸，理论分子量为49.6kDa。从图 5可见，随着诱导温度的升高，Vdh诱导表达的沉淀比例随之上升。因此在本研究中Vdh 酶的最佳诱导条件为20℃，0.25mmol/L IPTG，诱导时间为12h。此外，电子传递链FdR-Fdx的最佳诱导条件为25℃，0.5mmol/L IPTG，诱导时间为12h，并利用镍柱纯化了Vdh、FdR及Fdx(图 6)，相对于未诱导组，Vdh纯酶液呈现红褐色，提示该酶存在亚铁红素结构域。
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| 图 4 重组片段Vdh、FdR及Fdx琼脂糖凝胶电泳检测 Figure 4 Recombination fragment of Vdh,FdR and Fdx assayed by agarose gel electrophoresis (a)Double digestion of pET28b-Vdh (b) PCR amplification of FdR in recombination plasmid of pET28b-FdR-Fdx (c) PCR amplification of Fdx in recombination plasmid of pET28b-FdR-Fdx |
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| 图 5 Vdh的诱导表达 Figure 5 Induction and expression of Vdh (a)Induction expression of Vdh by SDS-PAGE M：protein marker; 1: Non-induction suspension; 2: Induction suspension of Vdh; 3: Induction suspension of Vdh precipitate (b) The effect of induction temperature on Vdh expression 1: Induction suspension at 20℃; 2: Induction precipitate at 20℃; M: Protein maker; 3: Induction suspension at 25℃; 4: Induction precipitate at 25℃; 5: Induction suspension at 28℃; 2: Induction precipitate at 28℃; 6: Induction suspension at 37℃; 2: Induction precipitate at 37℃ (c) Comparison of pure Vdh protein and negative control in test tube |
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| 图 6 pET28b-FdR-Fdx蛋白诱导表达及纯化SDS-PAGE分析 Figure 6 SDS-PAGE analysis of pET28b-FdR-Fdx recombinant protein expression (a)Induction expression of FdR-Fdx by SDS-PAGE M：Protein marker; 1: Non-induction suspension; 2: Induction suspension of FdR-Fdx; 3: Induction suspension of FdR-Fdx precipitate (b)Analysis of FdR-FdxM purification by SDS-PAGE Analysis of FdR-FdxM purification by SDS-PAGE M: Protein marker；1: Crude enzyme of FdR-Fdx; 2:Precipitation of FdR-Fdx; 3: Unpurified protein 1; 4: Unpurified protein; 5:Unpurified protein 3; 6: Pure protein of FdR-Fdx |
作为P450超家族成员，Vdh含有亚铁红素辅基因而具有特殊的光谱吸收特征。对Vdh的纯酶进行光谱分析，如图 7(a)所示，在420nm处吸收峰为亚铁红素的低自旋状态，加入强还原剂连二亚硫酸钠后，亚铁血红素基团被还原，从而降低其在420nm处 Soret带的吸收峰。在通入CO后，还原型的Vdh在450nm处呈现特征吸收峰，从而证实Vdh在本体系中实现活性表达。此外，高浓度的连二亚硫酸钠处理能够提高Vdh在450nm吸收峰的显著性[图 7(b)]。
2.3 电子传递链的偶联活性研究 2.3.1 DCIP评价FdR对NAD(P)H的氧化活性2,6-二氯靛酚钠(DCIP)是一种氧化还原指示剂，其氧化态蓝色(600nm处有吸收峰)、还原态无色(600nm处吸收峰消失)，从而可根据600nm处吸光值的降低速率来评价FdR对NAD(P)H的氧化活性，以及FdR对NADH/NADPH的偏好性。如图 8所示，未添加NAD(P)H组中，600nm处吸光值几乎无变化，添加NAD(P)H后，600nm处吸光值呈明显下降趋势。相同时间内，以NADH为底物时吸光值的下降速率为0.029/min，以NADPH为底物时吸光值的下降速率为0.004 5/min。添加NADH组的吸光值降低速率较NADPH组高，即NADH对FdR还原的能力比NADPH更强，表明FdR偏好辅酶NADH。
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| 图 7 CO差光谱法测定Vdh活性 Figure 7 Reduced CO difference spectra assay of Vdh activity (a) The characteristic absorption peak of the prototype of Vdh at 450nm (b) Effect of different amount of reducing agent on characteristic absorption peak at 450nm for Vdh |
细胞色素c是一种含铁血红素蛋白，作为人工电子受体可接收由Fdx介导传递的电子，还原态在550nm处有特征吸收峰，可以通过其在550nm吸收峰的变化间接评价Fdx的活性，并可进一步通过辅酶NADH→FdR→Fdx→细胞色素c的电子传递顺序，评价FdR-Fdx的体外偶联作用。相较于空白对照组，加入NADH后，在550nm处吸光值显著升高[图 9(a)]，且细胞色素c吸收峰的上升速率与FdR-Fdx添加浓度成正比[图 9(b)]。以上结果证实细胞色素c接受了由Fdx介导的电子，从而证实体外可溶表达的Fdx具有生理活性。
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| 图 8 DCIP测定FdR对两种辅酶的亲和性比较 Figure 8 Comparison the affinity of FdR with NADH/NADPH by DCIP assay |
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| 图 9 细胞色素c评价Fdx、FdR的偶联活性 Figure 9 The coupling activity of Fdx-FdR evaluated by cytochrome c (a)The change curve of cytochrome c at 550nm (b)Effect of FdR-Fdx protein concentration on OD value at 550nm |
上述实验证实Vdh及其电子传递链蛋白FdR和Fdx成功实现了体外活性表达，为了进一步证实该羟化反应体系中辅酶NADH的电子能够有效地以NADH→FdR→Fdx→Vdh方向传递，考查了体外偶联活性，检测了不同体系中NADH在340nm的吸收峰变化。如图 10所示，空白对照组(仅添加了电子传递蛋白Fdx-FdR及辅酶NADH)在340nm处有较大吸收值，在加入Vdh后，340nm的吸收值减少，与未添加NADH组的吸收值接近，表明外源添加的NADH被耗尽，证实NADH上的电子可以通过FdR-Fdx介导传递至Vdh。由此可知，该电子传递链FdR-Fdx-Vdh畅通，体外偶联成功。此外，进一步考查了底物维生素D3和Vdh的结合情况。对Vdh在300～550nm处进行全波长扫描，随着底物浓度的提高，Vdh在390nm处吸光值下降(呈现谷形)，在420nm处吸光值升高(呈现峰形)，提示底物维生素D3能够与Vdh结合。
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| 图 10 FdR-Fdx、Vdh体外偶联活性 Figure 10 In vitro couple activity of FdR-Fdx and Vdh (a) The coupling activity of FdR-Fdx and Vdh in vitro (b)The binding activity of Vdh and the substrate vitamin D3 |
在体外成功表达及重建Vdh及其电子传递链的基础上，进一步尝试构建维生素D3羟化反应体系。首先，利用高效液相色谱法建立了底物维生素D3及产物25(OH)VD3的检测方法，两者的出峰时间分别为6.65min及3.29min。通过添加菌株pET28b-Vdh与pET28b-FdR-Fdx的粗酶液，并将疏水性底物维生素D3以助溶剂DMSO处理后，添加辅酶NADH启动羟化反应。图 11显示，30℃反应12h后，在3.29min处观察到产物峰，但转化效率较低，为1.14%。考虑到单加氧酶的电子传递效率是限制催化反应速率的关键限速步骤，我们进一步考查了反应体系中Vdh与FdR-Fdx的添加比例对底物转化率的影响，如表 1所示，随着FdR-Fdx在反应体系中添加比例的提高，底物的转化率从1%提高至15%左右，其中，当两者的比例达到1∶5，底物浓度为100μmol/L时，产物的转化率最高,为19.65%。
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| 图 11 维生素D3羟化反应HPLC检测结果 Figure 11 The HPLC results of VD3 hydroxylation |
| Vdh:FdR-Fdx | 底物浓度(μmol/L) | 转化率(%) |
| 5∶1 | 100 | 1.14 |
| 3∶1 | 100 | 0.51 |
| 1∶1 | 100 | 1.02 |
| 1∶3 | 100 | 2.17 |
| 1∶5 | 100 | 19.65 |
| 1∶8 | 100 | 17.40 |
3 结 论
为建立活性维生素D3生物转化合成的新工艺，本文构建了Vdh及其电子传递蛋白FdR及Fdx的重组表达质粒，优化了三种蛋白质的体外活性表达条件，通过镍柱纯化并根据P450家族蛋白及其偶联蛋白的光谱吸收特性，评价了Vdh、FdR和Fdx的体外活性，定性考查了该电子传递链的体外偶联活性及Vdh与底物维生素D3的结合能力，最后对Vdh催化维生素D3羟化反应做了初步探索。羟化酶与其电子传递链的添加比例显著影响底物的转化率，Vdh与FdR-Fdx的最佳添加摩尔比为1∶5，30℃反应12h后，100μmol/L底物的转化率最高可达到19.65%，为实现活性维生素D3生物转化工艺提供了借鉴，后续的研究可以进一步针对羟化反应体系的各反应条件及辅酶循环做深入探讨。
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