文章信息
- 陈华新, 武静, 赵瑾, 姜鹏.
- CHEN Hua-xin, WU Jing, ZHAO Jin, JIANG Peng.
- 抗人AFP单链抗体与藻胆蛋白融合蛋白的构建、表达与活性分析
- Expression and Characterization of Fusion Protein of Single-chain Variable Fragment of Alpha Fetoprotein and Allophycocyanin Alpha Subunit
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(5): 74-80
- China Biotechnology, 2016, 36(5): 74-80
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160511
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文章历史
- 收稿日期: 2015-11-09
- 修回日期: 2016-01-25
2. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室 青岛 266071;
3. 中国科学院大学 北京 100049
2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
别藻蓝蛋白作为荧光探针应用时,通常需要将其标记到抗体上。常用的方法包括直接标记和间接标记,直接标记是将别藻蓝蛋白与抗体通过化学试剂进行交联,由于别藻蓝蛋白和抗体都是蛋白质分子,因此交联方法可采用蛋白质共价交联的一般流程。间接标记一般通过两步法进行,常用的是生物素·亲和素系统(BAS)亲和标记,即通过BAS系统实现别藻蓝蛋白与抗体的结合[3]。无论是直接交联还是间接交联,都需要分别制备别藻蓝蛋白和抗体,制备过程复杂,成本较高,在交联的过程中还可能会损失抗体活性和别藻蓝蛋白的荧光特性[3]。
近年来,别藻蓝蛋白的生物合成途径已阐明。利用代谢工程的方法,在大肠杆菌中表达藻胆蛋白生物合成的关键酶,已实现别藻蓝蛋白的生物合成[4-6]。利用组合生物合成方法,获得了非天然的结合藻红胆素的别藻蓝蛋白(α亚基或β亚基),相对于结合藻蓝胆素的天然别藻蓝蛋白,结合藻红胆素的别藻蓝蛋白具有更高的荧光量子产率[7],因而具有较好的应用开发潜力。更重要的是,可以利用基因工程技术,将别藻蓝蛋白分子和其他蛋白质融合,拓展藻胆蛋白荧光探针的应用。
单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)是一种新型的重组蛋白抗体,是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15~25个氨基酸的弹性短肽(linker)连接而成[8]。单链抗体对抗原具有较高的亲和力和特异性,它具有分子小、穿透力强、体内半衰期短、免疫原性低等特点。由于分子质量小,不需要进行糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子,因此,单链抗体可以在原核表达系统中进行表达。
本研究将抗人甲胎蛋白(AFP)单链抗体基因与别藻蓝蛋白α亚基基因连接形成融合基因,实现了融合蛋白在原核细胞中的高效表达,并利用组合生物合成技术,实现藻红胆素与融合蛋白的共价连接。融合蛋白具有荧光特性和免疫学活性,有望开发为新一代藻胆蛋白荧光探针。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒E. coli菌株BL21(DE3)和质粒pUC-AFP-scFv为本实验室保存;pCDFDuet-1载体与pRSFDuet-1载体购自Novagen公司。
1.2 主要试剂和耗材异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、壮观霉素和卡那霉素购自北京索莱宝生物科技有限公司,BamHI、SacI、NdeI和XhoI购自宝生物工程(大连)有限公司,其他常规试剂为进口分装或国产分析纯。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。
1.3 实验方法 1.3.1 重组大肠杆菌的构建以质粒pUC-AFP-scFv为模板,PCR扩增获得人甲胎蛋白(AFP)单链抗体基因scFv,以蓝藻Synechococcus elongatus BP-1基因组为模板,通过PCR的方法扩增获得别藻蓝蛋白α亚基基因apcA和裂合酶基因cpcS,以Synechocystis sp. PCC6803基因组DNA为模板扩增获得藻红蛋白生物合成酶基因Ho1,通过基因人工合成的方式获得Prochlorococcus phage P-SSM2藻红蛋白生物合成酶基因pebS。
利用重组PCR,将AFP单链抗体基因scFv与apcA基因通过“GGATCCGCCG AAGCGGCCGCAAAAGAAGCTGCGGCCAAGGAAGCAGCTGCGAAAGAAGCCGCAGCTAAGGCGGAATTC” 78个碱基连接起来,形成融合基因,其中scFv在N端,apcA在C端。该融合基因经BamH I和SacI酶切处理后,连接到经同样酶切处理的pCDFDuet-1载体的第一个表达框中,构建获得质粒pCDF-HLLA。cpcS的扩增引物两端分别设计NdeI和XhoI识别位点,扩增产物酶切处理后,连接到pCDF-HLLA载体的第二个表达框中,获得质粒pCDF-HLLA-cpcS。Ho1基因的扩增引物两端分别设计BamH I和SacI识别位点,扩增产物酶切处理后,插入到pRSFDuet-1载体的第一个表达框中,获得质粒pRSF-Ho1。pebS基因扩增引物两端分别设计NdeI和XhoI识别位点,扩增产物酶切处理后,连接插入pRSF-Ho1质粒,构建获得质粒pRSF-Ho1-pebS。所有重组质粒均通过DNA测序,确保基因序列和阅读框无误。
将质粒pCDF-HLLA-cpcS和pRSF-Ho1-pebS共转化入大肠杆菌BL21(DE3),获得重组大肠杆菌。
1.3.2 诱导温度的选择取活化的种子,按2%的接种量接种于含100μg/ml卡那霉素和100μg/ml壮观霉素的TB液体培养基中。37℃,180r/min恒温摇床培养3h后,冷却至室温,加入一定终浓度为0.5mmol/L IPTG,分别置于16℃、22℃、28℃,160r/min摇床中诱导培养20h。4℃,8 000r/min条件下离心收集菌体。菌体用PBS缓冲液悬浮,用超声波细胞粉碎机破碎细胞。分别取破碎液、破碎液离心后的上清液及离心后的沉淀进行SDS-PAGE分析。
1.3.3 诱导时机的选择取活化的种子按2%的接种量接种于含100μg/ml卡那霉素和100μg/ml壮观霉素的TB液体培养基中,37℃、180r/min恒温摇床培养。分别于培养1h、2h、3h、4h、5h、6h后冷却至室温,加入一定终浓度为0.5mmol/L的IPTG,置于22℃、160r/min摇床培养20h。菌体离心、破碎及SDS-PAGE分析方法同上。
1.3.4 荧光检测诱导表达后的大肠杆菌取未诱导和经过诱导表达重组蛋白的菌液1ml,8 000r/min离心收集沉淀,用适量PBS洗涤后重悬,均匀分散于载玻片上,制成显微镜片,荧光显微镜下观察(激发光波长488nm)。
1.3.5 包涵体复性、蛋白质纯化菌体悬浮于PBS溶液中,冰浴中超声破碎,破碎液于4℃、8 000r/min条件下离心20min,弃上清液,收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,10mmol/L β-巯基乙醇,8mol/L尿素),用磁力搅拌器4℃下缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解,4℃,6 000r/min离心10min,收集复性液。将复性液倒入处理过的透析袋中,将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液中,用磁力搅拌器4℃下缓慢搅拌透析,每透析12h倒去1/2体积的透析液,加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透析,48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中,4℃,10 000r/min离心10min,收集上清液。上清液样品过结合缓冲液(500mmol/L NaCl、15.5mmol/L Na2HPO4、4.5mmol/L NaH2PO4、20mmol/L咪唑,pH 7.4)平衡好的镍柱,再用洗涤液洗涤(500mmol/L NaCl、15.5mmol/L Na2HPO4、4.5mmol/L NaH2PO4、50mmol/L咪唑,pH 7.4)镍柱,待检测不到蛋白质信号时,用洗脱液(500mmol/L NaCl、15.5mmol/L Na2HPO4、4.5mmol/L NaH2PO4、500mmol/L咪唑,pH 7.4)进行洗脱,收集流出液,再过脱盐柱,除去蛋白质样品中的咪唑。
1.3.6 重组蛋白的光谱活性检测取少量纯化后的蛋白质样品,测定其光谱活性。用紫外分光光度计对样品进行检测,在200~700nm进行扫描,观察蛋白质的特征吸收峰;用荧光分光光度计对样品的荧光光谱性质进行检测,激发波长为530nm,发射狭缝宽度为5nm,在540~650nm进行扫描,扫描速率为240nm/min。
1.3.7 重组蛋白的免疫活性检测采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性,将AFP亲本单抗和不同比例的scFv-apcA,加入包被AFP抗原的96孔酶标板,37℃孵育2h,PBST洗涤3次后加入HRP标记的抗小鼠IgG抗体50μl,37℃孵育2h,加底物显色15min后终止反应。测定A450值,设立加PBS的AFP亲本单抗作为阳性对照,每个浓度设3个复孔,方法同上。竞争抑制率(%)=(A450亲本单抗-A450scFv-apcA)/(A450亲本单抗-A450空白)。
2 结果与分析 2.1 重组表达质粒的结构重组表达质粒的结构见图1,其中质粒pCDF-HLLA含有融合基因scFv-apcA和裂合酶基因cpcS,而质粒pRSF-Ho1-pebS含有藻红胆素生物合成酶基因Ho1和pebS。pCDF-HLLA和pRSF-Ho1-pebS共转化入大肠杆菌中,经卡那霉素和壮观霉素筛选获得了重组菌株。
2.2 融合蛋白在大肠杆菌中的表达大肠杆菌中含有血红素(heme),可在Ho1和pebS的催化下转化为藻红胆素。重组大肠杆菌经IPTG诱导后,菌体颜色由灰色逐步变为粉红色,表明藻红胆素已在大肠杆菌中积累,并可能共价结合到融合蛋白上。在荧光显微镜下观察,重组大肠杆菌发出较强的橘红色荧光(图2),而在对照菌中(转化空载体的大肠杆菌)没有观察到任何荧光现象。这表明融合蛋白已在重组大肠杆菌中有效表达,并且已经共价结合藻红胆素。
2.3 诱导温度对目标蛋白表达的影响外源蛋白在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体,降低培养温度是减少包涵体的有效方法。分别在16℃、22℃、28℃下对大肠杆菌进行诱导,重组蛋白的表达情况如图3所示,在22℃和28℃条件下,蛋白质的表达量较高,但是几乎全部以包涵体的形式存在于沉淀里,而16℃条件下,蛋白质几乎没有表达。这表明,改变诱导温度并不能避免包涵体的产生。
温度对藻红胆素与脱辅基蛋白的结合具有一定的影响,结果显示,在22℃下诱导的目标蛋白荧光强度高于16℃和28℃下诱导的蛋白质(结果未列出)。因此,后续的实验都是在22℃诱导温度下进行的。
2.4 诱导时机对目标蛋白表达的影响比较了在诱导温度为22℃、分别在培养了1h、2h、3h、4h、5h、6h后加诱导剂时目的重组蛋白的表达量。由图4可以看出,诱导时机对目的蛋白的表达具有较明显的影响,在对数生长前期加入诱导剂对菌体代谢产物积累具有较强的负作用[8],在对数生长中后期,即培养4h后加入诱导剂可以获得较高的表达量,随时间的进一步延长,菌体密度过大,对目的蛋白的表达具有一定的抑制作用。
2.5 重组蛋白复性与分离纯化融合蛋白以包涵体的形式表达,为了获得重组蛋白,采用稀释法对重组蛋白进行复性,然后利用亲和层析进行纯化。图5是纯化后重组蛋白的SDS-PAGE图,经灰度扫描,重组蛋白的纯度达90%以上,重组蛋白的分子质量为40~55kDa,与理论分子质量44.7kDa相符。
2.6 光谱学性质融合蛋白的光谱学性质如图6所示,实线是重组蛋白的吸收光谱,其峰值出现在550nm左右,虚线是重组蛋白的荧光发射光谱,其峰值出现在561nm左右。融合蛋白表现出与别藻蓝蛋白α亚基相似的光谱学性质,说明scFv蛋白的融合对别藻蓝蛋白的光谱学活性没有明显影响。
2.7 重组蛋白的亲和活性图7是融合蛋白的免疫活性检测结果。随着重组scFv浓度的增加而增大,AFP亲本单抗与AFP抗原混合反应的抑制率随着scFv浓度的增加而增大,当scFv-AFP与亲本单抗浓度为16∶1时,竞争抑制率达到48%。这表明重组的scFv与AFP 亲本单抗具有相似的抗原结合特异性,别藻蓝蛋白α亚基的融合并未影响其对scFv的亲和活性。
3 讨 论藻胆蛋白荧光探针具有荧光背景小、不易猝灭、荧光保存期长等优点,应用于荧光免疫检测有30余年的历史。近年来,随着藻胆蛋白生物合成途径的阐明,在异源生物中重构藻胆蛋白生物合成途径,已成功获得了具有光谱学活性的重组藻胆蛋白[1]。大肠杆菌遗传背景清楚,能大规模发酵培养,有多种高效表达载体,成为表达外源基因的首选菌株,它具有产量高、生长速率快、操作简单、成本低等优点。我们实验室利用大肠杆菌体系,已重组合成了别藻蓝蛋白α亚基、β亚基和三聚体等多种具有荧光特性的重组藻胆蛋白分子[5-6]。
相对于天然藻胆蛋白分子,重组藻胆分子亚基分子具有分子质量小、便于进行蛋白质工程改造等优点。利用组合生物合成技术,改变藻胆色素的组成,可以获得了藻类中并不存在的人工藻胆蛋白分子[7]。在我们的前期实验中,将别藻蓝蛋白亚基分子上结合的藻蓝胆素改变为藻红胆素,其最大吸收峰由614nm变为550nm,适合用532nm激光器进行激发。此外,结合藻红胆素的藻胆蛋白分子荧光量子产率可达0.9以上[7],远大于结合藻蓝胆素的藻胆蛋白分子(0.3~0.4)[9]。因此,可以利用组合生物合成技术,构建出荧光强度更高的人工藻胆蛋白分子。
甲胎蛋白是一种重要的肿瘤相关抗原,是原发性肝癌诊断和生物治疗的一种重要的靶抗原。本研究将别藻蓝蛋白α亚基和AFP单链抗体融合,在大肠杆菌中表达,生物合成了共价结合藻红胆素的融合蛋白分子。为了避免两个蛋白质分子之间可能产生的相互影响,蛋白融合时加入了26个氨基酸的间隔序列,研究结果表明融合蛋白不但具有免疫学活性,同时具有荧光特性,融合表达并没有影响两个蛋白质分子各自的生物学活性。由于不需要分别制备藻胆蛋白和抗体,也不需要经过化学交联,融合藻胆蛋白荧光探针具有制备过程简单、成本较低的优势。
由于大肠杆菌缺乏蛋白质翻译后修饰能力,以及蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力,重组表达外源蛋白容易形成包涵体[10]。根据已有研究结果,重组单链抗体均以包涵体的形式表达[11-12],获得具有生物活性的单链抗体需要对包涵体进行复性,而结合藻胆色素的重组藻胆蛋白通常以可溶性形式表达。在本研究中,藻胆蛋白的融合并没有促进单链抗体的可溶性表达,融合蛋白还是以包涵体形式表达,通过改变温度和IPTG的诱导时机,仍不能实现融合蛋白的可溶性表达。我们利用尿素作为变性剂,采用梯度透析的方法复性,复性效果较好,获得了具有免疫活性和荧光特性的重组藻胆蛋白探针分子。
下一步,我们将通过其他方法,如共表达伴侣蛋白分子等策略,力图实现融合藻胆蛋白荧光探针分子的可溶性表达,进一步简化其制备流程。此外,我们将融合藻胆蛋白荧光探针与天然藻胆蛋白做对比研究,以评价其在荧光免疫检测与分析中的应用前景。
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