麻疯树(Jatrophacurcas L.)为大戟科麻疯树属灌木或小乔木，广泛分布于热带和亚热带地区。麻疯树种子中富含油脂(30%~45%)，其油脂可以通过转酰基作用转化为高品质生物柴油^[1]，因此麻疯树作为一种新型生柴油树种而受到世界各国的广泛关注。除了含油量较高以外，麻疯树作为生物柴油树种还有很多优点，如抗旱^[2]、生长快速、易于繁殖和环境适应能力强等^[3]。尽管麻疯树是一种优良的生物柴油树种，目前在世界范围内有大面积的麻疯树种植，但其还是一个未被驯化的野生或半野生树种^[4]，与其他能源植物，如油棕和油菜相比麻疯树种子产量较低且不稳定，这使麻疯树产业存在较大的风险^[5]，因此提高产量是麻疯树育种的主要目标。

G蛋白是细胞信号转导途径中起重要作用的GTP结合蛋白，由G_α、G_β、G_γ 3个亚基构成。G蛋白研究始于20世纪70年代，由哺乳动物中被鉴定为连接激素受体和腺苷酸环化酶途径的信号分子^[6]。90年代早期从植物中克隆出G蛋白基因，并且与动物G蛋白有相同的保守域和作用元件^[7]。随着G蛋白的研究更加深入，在植物体内，G蛋白参与多种生长发育途径的调节，包括控制生长、细胞分化、防御、气孔运动、离子通道，尤其是植物激素和糖信号的感知^[8]。研究发现，水稻G_α亚基RGA1缺失突变后会产生赤霉素响应功能的缺失^[9-10]。而拟南芥G_β亚基缺失突变主要影响叶，花和果实等器官的发育。G_β和G_γ缺失突变后会出现一些相同的表现型，如圆叶型和糖敏感等^[11]。然而，拟南芥Gγ亚基AGG3基因定点敲除和过表达的研究发现，AGG3基因参与器官大小的调节。拟南芥AGG3基因敲除的突变体长角果相对较小，并且每个长角果的种子数目更少；而过表达的植株长角果明显增多，种子数量增多等^[12]。同样在亚麻芥中表达AGG3不仅能提高种子的大小和质量，使每株植物产量增加15%~40%，还能提高植物的抗逆性^[13]。酵母的研究表明，AGG3主要通过与G_β亚基相互作用控制细胞增殖的时间，改变细胞数目来调节器官的大小^[14]。但是在植物体内AGG3的作用机制还有待进一步研究。

不同地区分布的麻疯树种子大小有较大的变异^[15-16]。使麻疯树种子增大是提高麻疯树产量的重要途径，因此对麻疯树种子大小的遗传调控途径进行研究具有重要意义。本实验克隆了麻疯树的AGG3基因，并对其进行了生物学信息分析和表达特异性分析，为进一步研究AGG3基因对麻疯树种子大小的调控提供了参考，同时也为麻疯树的遗传改良提供了一个新的方向。

1 材料与方法 1.1 材料试剂

实验所用材料取自四川省凉山彝族自治州金河乡麻疯树种植基地，取5年生麻疯树的根、茎、老叶、嫩叶、发育中的种子和成熟的种子，新鲜材料取材后迅速放入液氮罐中保存，成熟种子在干燥通风处保存。选取成熟饱满的种子进行萌发，培养基质为营养土与蛭石1∶1混合物。萌发培养条件为30℃，光照周期为16h/8h。第一片真叶完全伸展的植株用于实验处理。

pMD19-T试剂盒、反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，植物总DNA提取试剂盒、植物总RNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，qRT-PCR试剂盒iTaq^TM Universal SYBR® Green Supermix购自Bio-Rad公司，引物由北京梓熙生物科技有限公司合成。其他所用化学药品均为国产或进口分析纯试剂．

1.2 方 法

1.2.1 麻疯树核酸提取及第一链cDNA合成

按照试剂盒操作说明书提取麻疯树总RNA和基因组DNA，利用反转录试剂盒对麻疯树总RNA进行反转录获得第一链cDNA。基因组DNA和单链cDNA保存在－80℃冰箱用于后续基因扩增。

1.2.2 麻疯树JcAGG3基因克隆

从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载拟南芥AGG3蛋白序列(np_680175.2)，在麻疯树基因组数据库(http://www.kazusa.or.jp/jatropha/)中搜索拟南芥AGG3蛋白同源的基因编码序列，将搜索到的基因序列命名为JcAGG3。根据搜索到的序列设计麻疯树JcAGG3基因特异引物，上游引物Jc-AGG3-F：ATGGCTGAAAGTGACAGAG；下游引物Jc-AGG3-R：CTAAAAGAATAGACAGCATGG。分别以单链cDNA和基因组DNA为模板进行PCR反应扩增麻疯树JcAGG3编码序列和基因序列。PCR循环为：94℃ 5min，35循环(98℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 90s)，72℃ 5min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后送华大基因科技服务有限公司进行测序。

1.2.3 JcAGG3基因及启动子序列生物信息学分析

用ExPASy (http://au.expasy.org) 的Compute pI/Mw计算蛋白质的等电点、分子质量；DNAMAN软件进行氨基酸序列对比；用MEGA 4.0软件构建系统进化树；利用Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在线程序对蛋白质进行亚细胞定位预测；通过plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线程序分析启动子区域顺式作用元件。

1.2.4 JcAGG3基因组织表达分析

按照iTaq^TM Universal SYBR^® Green Supermix说明书以麻疯树第一链cDNA为模板，在Bio-Rad iCyclerMyiQ Real-Time PCR Systems平台上对JcAGG3基因进行定量表达分析。以组成型表达基因18S rRNA(Genbank登录号：AY823528.1)为内参基因。其上游引物为：5′-CAACCATAAACGATGCCGACC-3′；下游引物为：5′-CAGCCTTGCGACCATACTCCC-3′。目的基因JcAGG3上游引物为：5′-GCTGTCTTATGGGAAATGATCT-3′；下游引物为：5′-CTGAATCGGAGACTAATCGGT-3′。

1.2.5 非生物胁迫处理对JcAGG3基因表达的影响

将2个月大的麻疯树植株分别在ABA(100μmol/L)、干旱(20%PEG6000)和黑暗的条件下处理，在6h后取幼嫩叶片作为材料，以正常生长植株的幼嫩叶片为对照利用荧光定量PCR检测胁迫条件对JcAGG3基因表达的影响。

2 结果与分析 2.1 麻疯树JcAGG3基因克隆

用麻疯树JcAGG3基因特异引物对麻疯树基因组DNA和第一链cDNA进行扩增，电泳检测后分别得到大小约为1 200bp和800bp的片段(图1).测序后发现该基因全长为834bp，开放阅读框(ORF)全长为1 201bp。

2.2 麻疯树JcAGG3基因及启动子生物信息学分析

2.2.1 JcAGG3序列分析

用DNAMAN软件对JcAGG3基因的开放阅读框全长序列进行翻译，结果显示该序列编码277个氨基酸，利用ExPASy计算该蛋白质的理论等电点为8.61，分子质量大小为30.514kDa。 Cell-PLoc2.0在线程序对蛋白质亚细胞定位预测显示该蛋白质定位于细胞质膜上。利用DNAMAN软件将JcAGG3氨基酸序列与其他植物中的AGG3氨基酸序列进行对比并分析序列中的保守功能域(图2)。比对结果发现，JcAGG3在序列和功能域上与其他植物中的AGG3序列有较高的相似性，核心作用位点上存在比较保守区域 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；另外，所有序列的C端还存在一个保守的富含半胱氨酸的CAAXbox。

采用MEGA 4.0软件对来自不同物种的AGG3蛋白序列进行系统进化建树分析，结果(图3)表明麻疯JcAGG3蛋白与同属大戟科的蓖麻关系较近，而与单子叶植物水稻等亲缘关系较远，这表明单子叶植物与双子叶植物在AGG3上分化较早。

2.2.2 启动子序列顺式作用元件预测

利用植物顺式作用元件数据库plantCARE对JcAGG3起始密码子ATG上游的1 500bp序列进行顺式作用元件预测(表1)。结果显示，除了TATA- box、CAAT-box等转录必须的元件以外其他的作用元件主要有4类，光响应元件、植物激素响应元件、逆境胁迫响应元件和胚乳发育相关元件，其中与光响应相关的元件多达10个，说明该基因的表达受光调节的特性，植物激素调控相关的元件主要有ABA、乙烯、赤霉素响应元件，此外还有胚乳发育相关元件和胁迫响应元件。

2.3 JcAGG3基因表达谱分析

2.3.1 JcAGG3基因组织表达分析

采用荧光定量PCR技术检测JcAGG3基因的表达发现，JcAGG3基因在麻疯树的根、叶和种子中表达量较高，而在茎中只有极微量的表达。生长期幼叶中的表达量高于完全伸展的老叶，但是在发育中的种子表达量最高(图4)。之前在对麻疯树种子发育过程中转录组的研究发现，JcAGG3基因在种子发育的早期表达较高，而在种子发育的后期表达量降低^[17]。

2.3.2 各种非生物胁迫对JcAGG3基因表达的影响

在分析JcAGG3基因启动子序列时发现该区域还有大量与光响应相关的顺式作用元件(表1)，预测该基因的表达受光的调节，因此本实验通过对麻疯树进行暗处理后检测JcAGG3基因的表达水平，研究了基因的光调节特性，RT-PCR检测结果显示当植株在黑暗下处理6h后JcAGG3基因的表达量显著下调(图5)，这证明JcAGG3基因启动子区域与光有关的顺式作用元件参与了JcAGG3基因的表达调控。同样，在100μmol/L ABA处理6h后，JcAGG3基因的表达量增加了4.5倍；20%PEG6000干旱胁迫6h后，JcAGG3基因表达量升高2.5倍。这表明与ABA及干旱胁迫有关的顺式作用元件参与JcAGG3基因表达，提高基因的表达水平。

3 讨 论

种子大小是与产量相关的重要农艺性状。高等植物种子大小受多种因子控制，主要是来源于父本、母本和合子的影响。父本因子的影响主要是取决于父本基因组占合子基因组的比例，父本基因组过量会产生大种子，相反则产生小种子^[18]。在合子因素中，目前研究已鉴定出MINISEED3、HAIKU1、HAIKU2和SHB1等基因通过调节胚乳的发育而影响种子大小^[19-20]。母本因素对种子大小的影响主要是通过调控种子中母本来源的种皮的发育而起作用，目前在双子叶植物中发现的基因主要有WRKY 家族转录因子TRANSPARENT TESTA GLABRA2 (TTG2)、转录因子 APETALA2(AP2)、AUXIN RESPONSE FACTOR2 (ARF2)和P450s/CYP78A5^[21-24]。

本研究从麻疯树的cDNA中克隆到一个与拟南芥种子大小调控基因AGG3同源的基因，命名为JcAGG3。JcAGG3蛋白与其他物种中AGG3蛋白序列比对显示具有较高的同源性。在AGG3蛋白的N端存在G蛋白γ的保守序列、C端富含半胱氨酸的CAAXbox是该蛋白质发挥功能必不可少的结构。系统进化分析显示，麻疯树JcAGG3蛋白与蓖麻AGG3蛋白的进化关系最近，单子叶植物与双子叶植物在不同的分化支上，这说明该蛋白质在有花植物中分化较早，之后在单子叶植物和双子叶植物中独立进化。

在模式植物拟南芥中的研究表明AGG3定位于细胞质膜上，是细胞信号转导途径重要的信号分子，含有跨膜的Ca⁺通道。可以延迟细胞分裂结束的时间，使细胞数目增加，因此人们推测AGG3蛋白可以调控合成可以传递的生长信号进而促进细胞增殖^[12]。麻疯树JcAGG3蛋白在N端也存在一个细胞质膜定位序列，并且经软件预测显示JcAGG3蛋白定位于细胞质膜，因此AGG3基因在麻疯树和拟南芥中可能拥有相似的作用机制。

AGG3在拟南芥幼叶、胚和种子中表达，改变拟南芥AGG3基因的表达会使拟南芥叶片、长角果和种子的形状和大小发生变化，AGG3对拟南芥各个器官发育的影响是通过调节细胞分裂而起作用^[12]。在拟南芥中，AGG3还可以调节植物抵抗非生物胁迫的压力，尤其是脱落酸介导的反应^[13]。在麻疯树中JcAGG3基因的表达与拟南芥中AtAGG3基因的表达呈现出一致性，JcAGG3基因在种子中的表达量最高，同时幼叶中JcAGG3的表达量又显著高于老叶(图4)。各种非生物胁迫处理麻疯树的幼苗，发现100μmol/L ABA胁迫下，JcAGG3基因的表达量增加了4.5倍(图5)。同拟南芥AtAGG3基因类似，麻疯树JcAGG3基因编码的G_γ亚基与G_α和 G_β构成GTP结合蛋白，通过接受细胞内外信号，级联放大调节生物体的生长、发育，防御相关的代谢通路等。除此之外，在分析麻疯树JcAGG3基因上游启动子序列时发现该区域存在较多的光响应元件(表1)，并且经过暗处理后JcAGG3基因的表达量急剧下降(图5)，这表明AGG3基因的表达受光的调节，但是该调控途径的遗传调节网络还未见研究。

种子大小受到多因子、多途径的调控，研究麻疯树种子大小的调控机制对麻疯树提高麻疯树产量有十分重要的意义，但是这方面的报道还很少^[25]，因此对麻疯树AGG3基因调控机制的深入研究以及其他影响种子大小因子的研究十分必要。