中国生物工程杂志  2016, Vol. 36 Issue (05): 40-45 |
昆虫细胞表达系统是常用的外源蛋白质表达系统之一[1]，与原核表达系统相比，它能够进行更复杂的翻译后修饰[2]，表达哺乳动物来源的蛋白质时，更易获得可溶性蛋白质[3]。昆虫细胞表达系统常用的有果蝇表达系统和昆虫杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system，BEVS)。BEVS能够容纳较大的外源基因，得到的重组病毒易于筛选，具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力 [4-7]，与果蝇表达系统相比，其生产周期和便利性更强[8]。
BEVS由转移载体、杆状病毒载体和宿主细胞组成[9]。外源基因可通过转座整合到杆状病毒穿梭载体Bacmid中，此载体既能在大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)中低拷贝复制和稳定分离，又可以直接转染昆虫细胞。可通过筛选得到含目的基因的病毒粒子，然后将其转染昆虫细胞，即可获得重组病毒，用于高效表达外源基因。BEVS已被广泛用于生产大量(高达1 000mg/ml)的已适当翻译修饰(折叠，二硫键形成、低聚、糖基化、酰化、蛋白水解裂解)、具有生物活性的重组蛋白 [10]。
AFB1(aflatoxin B1，AFB1)可广泛污染各类农产品、食品及动物饲料，对其分析检测极其重要。本研究在抗AFB1 scFv2E6VHVL于E. coli BL21(DE3)表达的基础上，应用Bac-to-Bac BEVS系统构建抗AFB1 scFv2E6VHVL的重组Bacmid穿梭载体，并转染Sf9细胞制备重组病毒。将scFv2E6VHVL在Sf9细胞中表达、纯化，采用Western blot和ELISA对scFv2E6VHVL进行分析，以期为AFB1分析检测提供更好的抗体。
1 材料与方法 1.1 材 料AFB1：瑞士Alexis公司；杆状病毒转移质粒pFastBac 1、E. coli DH5α、 E. coli DH10Bac和昆虫Sf9 细胞：课题组保存；SFM培养液、Cellfectin 转染试剂：美国Life Technologies公司；小牛血清：中国杭州四季青生物有限公司；Easy Taq酶、Trans2K Plus DNA Marker：中国北京全式金生物技术有限公司；Ni-NTA亲和层析填料、ECL显色液：美国Thermo公司；羊抗小鼠 IgG-HRP酶标二抗：中国华美生物工程公司；质粒提取试剂盒：中国北京擎科新业生物技术有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder：美国Thermo公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒：中国北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1.2 方 法 1.2.1 引物设计与目的基因扩增以课题组保存的载体pET-3d scFv2E6VH-linker-2E6V[11]为模板，PCR扩增scFv2E6VHVL基因片段，并在目的基因N端加上Kozak序列和信号肽序列。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下：
LF1: TTTT GGATCC $\boxed{{\text{GCCGCCACCATGA}}}{\text{ }}$ AGTTCC TGGTCAACGT (划线部分为BamHI酶切位点，方框部分为Kozak序列)
LF2: AAGTTCCTGGTCAACGT GGCC $\begin{gathered} \boxed{{\text{CTGGTGTTC}}} \hfill \\ \boxed{{\text{ATGGTGGTG TA}}} \hfill \\ \end{gathered} $
LF3:$\boxed{{\text{CTGGTGTTCATGGTGGTGTA}}}$ CATCAGCTACATCTACGCCGAGGTGAA
GCTGGTGGAGTC (LF2、LF3划线部分为信号肽序列，方框部分为重复序列)
LR3: CCGCTCGAGTTAGTGGTGATGGTGATGATG(划线部分为XhoI酶切位点)。
首先以LF3和LR3为引物进行第一轮PCR，纯化回收PCR产物，而后以第一轮PCR的纯化产物为模板，以LF2和LR3为引物进行第二轮PCR，纯化回收第二轮PCR产物，最后以第二轮PCR纯化产物为模板，以LF1和LR3为引物进行第三轮PCR扩增。 PCR反应条件：94℃预变性 4min(94℃变性 30s，50～64℃梯度退火 30s，72℃延伸1min)× 30cycles，72℃延伸 7min。每轮PCR后，将5μl PCR产物与1μl 6×Loading buffer混匀，采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.2 重组质粒pFastBac 1-scFv2E6VHVL构建、鉴定将“1.2.1 ”中第三轮PCR产物以限制性内切核酸酶BamHI 和XhoI进行双酶切，克隆到同样酶切处理的质粒 pFastBac 1，并转化E. coli DH5α细胞。挑取单克隆进行菌落PCR验证，选取阳性转化子送至南京金思瑞生物技术有限公司测序。
1.2.3 E. coli DH10Bac感受态细胞制备将E. coli DH10Bac菌液以1∶250接种到含50μg/ml卡那霉素和10μg/ml四环素的LB液体培养基，过夜培养后取20μl 接种于含50μg/ml卡那霉素和10μg/ml四环素的5ml新鲜LB 液体培养基中，37℃振荡培养至OD600nm达 0.5左右；将备用的1.5ml离心管和菌液置于冰块中预冷，吸取1.2ml预冷的菌液至离心管，以5 000r/min 4℃离心5min，弃上清液，加入 800μl预冷的 50mmol/L CaCl2，轻轻悬浮并在冰上放置 30min；于4℃ 5 000r/min离心5min，弃上清液，加 100μl预冷的 50mmol/L CaCl2，轻轻悬浮，加入等体积预冷的40%甘油，吹打混匀后分装，保存在－80℃。
1.2.4 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid的筛选及鉴定抽提重组质粒pFastBac 1-scFv2E6VHVL，转化到含有Bacmid的感受态E. coli DH10Bac，而后将适量转化后的菌液涂布在含有50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素、7μg/ml庆大霉素、100μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和40μg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的LB平板上，37℃培养48h。挑取白色单菌落，以Bacmid 上的M13引物进行菌落PCR验证，PCR扩增条件为：93℃预变性5min，(9℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸3min)× 35cycles，72℃延伸10min。PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.5 抗AFB1 scFv2E6VHVL在Sf9细胞的表达与性质分析(1)昆虫Sf9细胞转染、重组杆粒制备及抗AFB1 scFv2E6VHVL预表达测试。将处于对数生长期的Sf9细胞悬浮，并以1.5×106 cell/ml接种到6孔细胞培养板，27℃培养2h，倒置显微镜下观察90%以上细胞已贴壁，弃去培养液，并用2ml不含小牛血清的SFM培养液洗涤两次。抽提“1.2.4 ”中阳性克隆子的重组杆粒，以两个不同质量的重组Bacmid杆粒DNA进行细胞转染。首先分别将1μg 和2μg两个不同量的杆粒DNA用不含小牛血清的SFM培养液稀释至100μl，同时相对应的转染试剂Cellfectin(分别为5μl 和9μl)稀释至100μl。将稀释的Cellfectin试剂滴加到稀释的杆粒DNA，轻轻吹打混合，室温孵育15~30min。加入0.8ml不含小牛血清的SFM培养液，轻轻混匀，将混合物加至含有细胞的孔中，27℃培养5h，弃去混合物。加入含5%小牛血清的SFM培养液，培养至出现明显的病毒感染症状。收集上清液，以1 000r/min离心5min，分别取上清液，此即为P1代病毒株(将1μg 杆粒DNA对应的P1代病毒命名为AP1，2μg的命名为BP1)。连续感染，获得AP2和BP2病毒株，并将收集的Sf9细胞和培养上清液用于预表达测试验证。
采用Western blot对scFv的预表达情况进行测试分析。将Sf9细胞悬浮在上样缓冲液中经煮沸5~10min直接上样。对于细胞上清液，取1ml，与经PBS缓冲溶液洗涤的80μl镍柱亲和层析填料在室温孵育0.5h，再经1ml PBS缓冲溶液洗涤3次，将镍柱亲和层析填料在上样缓冲液中经煮沸5~10min直接上样。经SDS-PAGE后，转印PVDF膜，以5%牛奶封阻PVDF膜，采用羊抗小鼠IgG-HRP酶标二抗孵育，并利用ECL显色液显色，观察结果。
(2)抗AFB1 scFv2E6VHVL性质分析。将Sf9细胞在摇瓶中28℃悬浮振荡培养至1.5×106 cell/ml密度，按体积比1∶1 000接种BP2代病毒，28℃悬浮振荡培养7天后取上清液(P3代病毒)。将10ml P3代病毒接种到200ml Sf9细胞，28℃悬浮振荡培养3天，收集细胞。以20ml PBS缓冲溶液悬浮，在冰浴条件下将细胞超声破碎(15min，2s开启，2s关闭，功率105W)，4℃下10 000r/min 离心10min，取上清液，采用镍柱亲和层析纯化上清液。参考前期报道[11]，以间接竞争ELISA检测抗AFB1 scFv2E6VHVL灵敏度。
2 结 果 2.1 目的基因scFv2E6VHVL扩增以质粒pET-3d scFv2E6VH-linker-2E6VL为模板，经前两轮PCR分别在目的基因N端加上Kozak序列和信号肽序列。以纯化的第二轮PCR产物为模板，以LF1和LR3为引物进行第三轮PCR，加上酶切位点。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，不同退火温度均得到大小约为840bp的产物，与理论值一致。
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| 图 1 抗AFB1 scFv2E6VHVL基因第三轮PCR扩增结果 Figure 1 The third round PCR results of anti-AFB1 scFv2E6VHVL gene amplification 1~4 and 5~8: PCR products obtained with different annealing temperature (50℃,51℃,52.7℃,55.2℃,58.5℃,61.2℃,62.9℃,64℃); M: Trans2K plus DNA marker |
将pFastBac 1质粒和“2.1”中回收的第三轮PCR产物分别进行BamHI和XhoI双酶切和连接反应，获得重组质粒pFastBac 1-scFv2E6VHVL。将重组质粒转化到E. coli DH5α细胞，挑取克隆子，以引物LF1和LR3进行菌落PCR验证(图2)，PCR产物大小约为840bp，与理论值一致。测序结果进一步验证重组质粒构建成功。
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| 图 2 含pFastBac 1-scFv2E6VHVL质粒的转化子PCR验证结果图 Figure 2 PCR results of transformants containing pFastBac 1-scFv2E6VHVL 1~9: Different transformants containing pFastBac 1-scFv2E6VHVL; M: Trans2K plus DNA marker |
将重组质粒pFastBac 1-scFv2E6VHVL转化至含Bacmid的E. coli DH10Bac细胞，并涂布到含IPTG和X-Gal的LB平板上进行蓝白斑筛选(图3)。含重组Bacmid的阳性E. coli DH10Bac由于Bacmid杆粒上α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。挑取白色菌落，利用Bacmid杆粒上的M13引物进行菌落PCR验证(图4)，克隆子1、4、5和12均扩增得到约3 100bp的条带，与理论值一致，重组Bacmid构建成功。
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| 图 3 含重组Bacmid的E. coli DH10Bac菌落蓝白斑筛选 Figure 3 Blue-white screening of E. coli DH10Bac containing recombinant Bacmid |
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| 图 4 含重组Bacmid的E. coli DH10Bac转化子PCR验证 Figure 4 PCR results of E. coli DH10Bac transformants containing recombinant Bacmid M: Trans2K plus DNA marker; 1~12: Different transformants containing recombinant Bacmid |
将重组杆粒侵染后的Sf9细胞和培养上清液分别处理，采用Western blot对抗AFB1 scFv2E6VHVL预表达进行测试验证，结果见图5。由图可知，含有目的基因的Sf9细胞胞内表达了能与羊抗小鼠IgG-HRP酶标二抗反应的蛋白质，该蛋白质分子质量约为28kDa，与目的蛋白理论值一致。同等上样体积，2μg重组杆粒侵染Sf9细胞后的表达量更高。但含有目的基因的Sf9细胞培养上清液未检测到目的蛋白表达。故将BP2病毒杆粒侵染Sf9细胞，用于抗AFB1 scFv2E6VHVL大量表达。
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| 图 5 抗AFB1 scFv2E6VHVL在Sf9细胞中表达的Western blot分析 Figure 5 Western blot analysis of expression of anti-AFB1 scFv2E6VHVL in Sf9 cell M: Thermo pageruler prestained protein Ladder; 1: Extracelluar protein (infected by AP2); 2: Intracellular proteins(infected by AP2); 3: Extracelluar protein (infected by BP2); 4: Intracellular proteins (infected by BP2) |
以BP2病毒杆粒侵染200ml Sf9细胞，进行目的蛋白诱导表达，并对表达产物进行镍亲和层析纯化。分别以间接非竞争ELISA和间接竞争ELISA分析纯化后的scFv。间接非竞争ELISA表明，AFB1O-OVA包被浓度为1μg/ml，抗AFB1 scFv2E6VHVL的浓度约为122μg/ml时，OD492nm约为1.0。在此条件下，以AFB1为竞争抗原，进行间接竞争ELISA，并绘制scFv2E6VHVL的间接竞争抑制曲线。由图6可知，scFv2E6VHVL的检测灵敏度约为30μg/ml。
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| 图 6 抗AFB1 scFv2E6VHVL的间接竞争ELISA抑制曲线 Figure 6 The indirect competitive inhibition curve of scFv2E6VHVL |
AFB1对人畜危害大，因此对其分析检测非常重要[12-13]。AFB1的分析检测方法主要包括理化分析法和免疫学分析法，后者因具有检测快速、灵敏、样品制备简单等优点，应用十分广泛[14-15]。抗体是建立免疫学检测方法的核心试剂，前期研究中，我们成功筛选鼠源抗AFB1单克隆细胞株，并以之为材料，构建scFv基因。将该scFv在E. coli BL21(DE3)中表达，其灵敏度仅为50μg/ml[11]。
虽然E. coli表达系统应用广泛、优势明显，但其不能对蛋白质进行有效的翻译后修饰(如二硫键形成、蛋白质折叠等)，存在一定局限性。而真核细胞表达系统的翻译后修饰机制接近天然形式，可用于不适宜E. coli表达系统的蛋白质生产。昆虫细胞表达系统的细胞生长条件简单，不需要CO2，适于高密度悬浮培养，表达水平高，含有哺乳细胞表达系统的诸多翻译后修饰通路，可生产与天然蛋白功能相似的重组蛋白。
本研究中scFv基因为鼠源性，前期研究未能从大肠杆菌表达系统获得高亲和力抗AFB1 scFv，为了获得高亲和力的重组抗AFB1 scFv，本研究采用了昆虫杆状病毒表达载体系统，构建了重组杆状病毒穿梭载体Bacmid侵染Sf9昆虫细胞，表达抗AFB1 scFv，以期提高其亲和力。经初步ELISA分析验证表明，AFB1对本研究表达的scFv的抑制中浓度(IC50)为30μg/ml，与E. coli BL21(DE3)表达的scFv相比，其检测灵敏度得到提高，scFv折叠和翻译后修饰相对充分。但与相关文献报道[16-18]仍有较大差距，分析原因主要可能是编码scFv基因自身亲和力不够高，仍需通过基因工程技术对scFv进行亲和力成熟。
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