黑色素瘤(malignant melanoma，MM)又称为恶性黑瘤，由异常黑色素细胞过度增生引起的常见皮肤瘤。近年来，我国黑色素瘤患病比例呈上升趋势，且高侵袭和转移力是其致死的主要原因^[1]。临床上采用的手术治疗、化学治疗、放射治疗，虽能取得一定疗效，但很难彻底治愈^[2]，因此尚缺乏一种抑制黑色素瘤侵袭转移的治疗手段。而随着各种癌基因及抑癌基因相继发现，分子生物学各种手段也日益发展与完善，使得基因治疗成为时下治疗肿瘤的热点。

RNAi靶向干扰在基因治疗中已引起广泛关注，Qian等^[3]通过RNAi沉默B16F10细胞MTA1基因，肿瘤细胞侵袭、迁移力和黏附力明显降低。Li 等^[4]以质粒表达的siRNA沉默小鼠恶性黑色素瘤细胞FAK基因，体内移植瘤实验表明FAK基因的沉默能够有效抑制肿瘤的生长和转移。然而肿瘤是一个多环节、多阶段受多基因调控的复杂疾病，有研究显示，多基因联合治疗效果优于单基因。Terao等^[5]利用HSV-tk/ACV系统及IL-2联合治膀胱癌，明显提高了抗癌能力，取得良好的治疗效果。Huang等^[6]利用HSV-tk/GCV系统和外源野生型p53基因联合治疗神经胶质瘤，明显促进肿瘤细胞凋亡，且联合基因比单一HSV-tk/GCV系统治疗能更早地使荷瘤鼠的肿瘤消退，效果显著。我们前期研究也显示靶向沉默MMP-9和FAK基因，体外明显抑制了黑色素瘤细胞的侵袭和转移 ^[7]。

本研究以小鼠皮下移植模型观察肿瘤的生长和肺转移模型研究MMP-9和FAK基因联合干扰对小鼠黑色素瘤体内转移的影响，从而探讨双基因治疗肿瘤的可行性。

1 材料与方法 1.1 材 料

SPF 级C57BL/6小鼠24只，由重庆医科大学实验动物中心提供，小鼠黑色素瘤高转移细胞B16F10购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，质粒PGV102购自上海吉凯基因化学技术有限公司，shRNA合成及干扰质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司构建，Endo-Free Plasmid Maxi Kit购自Omaga公司，RPMI 1640培养基、胎牛血清、PBS、0.25%胰蛋白酶、DMEM-F12培养基购自Hyclone公司，青霉素、链霉素购自华北制药公司，二甲基亚砜(DMSO)、G418购自Gibco公司，Lipofectamine^TM2000 transfection reagent、Opti-MEM I Reduced Serum Medium购自Invitrogen公司，苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自碧云天公司。

1.2 方 法

1.2.1 B16F10细胞培养及转染

B16F10细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640 培养基中，加入100U/ml青霉素和100mg/L 链霉素，37℃、5%CO₂、95%湿度孵箱中。实验分为空白对照组，未转染的B16F10细胞；Anti-MMP-9&FAK 组，转染pGV102-MMP-9-siRNA 和pGV102-FAK-siRNA 质粒后筛选的稳定表达株，按Lipofectamine ^TM2000 transfection reagent试剂盒说明进行质粒转染，收集转染后细胞，半定量RT-PCR检测两组B16F10细胞MMP-9和FAK基因的mRNA转录水平。

1.2.2 背部皮下移植观察成瘤情况

将12只C57BL/6小鼠随机分为两组并进行标号，按实验分组于每只小鼠背部皮下注射体积为100μl的5×10⁵个细胞，1周小鼠成瘤后，每天用游标卡尺测量肿瘤大小，并按公式V=0.523 6×L×W²计算肿瘤体积(V为肿瘤体积，L为肿瘤长径，W为肿瘤短径)，2周后将所有小鼠断颈处死，4%多聚甲醛固定肿瘤组织，HE染色病理分析。

1.2.3 肺转移实验观察瘤转移情况

将12只C57BL/6小鼠随机分为两组并进行标号，按实验分组于每只小鼠尾静脉注射体积为100μl的5×10⁵个细胞，注射24 天后处死所有小鼠，摘除其肝脏、肺脏及其脑，解剖显微镜下计数肺转移结节数并称取肺重，4%多聚甲醛固定肺脏、肝脏和脑，H&E染色病理分析。

1.2.4 统计学方法

使用SPSS19.0软件进行数据处理，各组数据以平均值±标准差(x± s)表示，采用独立样本t检验。

2 结 果 2.1 质粒转染对MMP-9、FAK基因mRNA水平的影响

收集空白对照组、Anti-MMP-9&FAK组细胞，Quantity one 软件分析两组细胞中MMP-9、FAK mRNA 相对表达水平发现(图 1)，与未转染的空白对照组相比，Anti-MMP-9&FAK 组细胞MMP-9 和FAK表达量明显下降，且差异极显著(P＜0.01)。

2.2 对肿瘤生长速率的影响

将B16F10细胞注射于小鼠皮下，对照组小鼠背部皮下7天后明显成瘤[图 2(a)]，Anti-MMP-9&FAK 组与对照组相比差异极显著(P＜0.01)，肿瘤体积较小，且该组小鼠从第11天开始才明显成瘤，肿瘤生长缓慢。如图 2(b)所示，对照组肿瘤肿块较大，透亮，且部分小鼠瘤体出现破溃出血后结痂的现象，而Anti-MMP-9&FAK 组肿瘤体积较小，包膜完整。取背部皮下瘤做病理组织分析(图 3)，两组黑色素瘤细胞呈巢状分布，细胞大小不一，细胞质丰富，核有异型性，可见较多的病理性核分裂，两组肿瘤细胞内外均可见大小不一的黑色素颗粒。但两组小鼠皮下黑色素瘤均未见明显侵袭下层肌肉组织的现象。

2.3 对黑色素瘤肺转移结节的影响

在小鼠尾静脉注射细胞24天后，对照组肺部布满结节，而Anti-MMP-9&FAK组几乎无肉眼可见的转移性结节[图 4(a)]。解剖镜下计数结果显示[图 4(b)]，与对照组相比，Anti-MM9-9&FAK组的肺结节数差异极为显著(P＜0.01)，具有统计学意义。通过比较两组小鼠肺重量[图 4(c)]，与对照组相比，Anti-MMP-9&FAK 组差异极显著(P0.01)。

肺组织病理切片分析发现(图 5)，对照组瘤细胞呈巢状分布，多见异型核，且有大量的黑色素颗粒成团堆积，而Anti-MMP-9&FAK 组未见明显的转移灶。

3 讨 论

研究RNAi对肿瘤生长的影响我们可以明显发现，Anti-MMP-9&FAK组肿瘤的生长明显受到抑制，说明沉默小鼠恶性黑色素瘤细胞MMP-9、FAK基因能够有效地抑制肿瘤的生长。但在侵袭方面并没有明显地侵袭现象发生，其原因是由于黑色素瘤受所处部位微环境的影响，往往在其周围形成纤维包膜，大大限制了肿瘤侵袭周围组织、血管和淋巴的能力，所以很大程度上降低了转移的概率。

从肺转移实验结果我们可以看出，Anti-MMP-9&FAK组的肺结节数和肺重量同空白对照组有显著差异，且通过组织病理分析可以得出肿瘤转移力显著下降，综合而言，通过体内的实验研究我们发现，联合干扰MMP-9和FAK基因能够有效地抑制小鼠恶性黑色素瘤体内的侵袭和转移。

在黑色素瘤侵袭和迁移关联的信号通路中，MMP-9和FAK作为关键因子，甚至直接决定肿瘤的恶性表型。对临床治疗来说，抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移是肿瘤治疗的核心。Yuan等^[8]发现，MMP-1活性的降低明显抑制了人软骨肉瘤细胞侵袭；研究报道，抑制AU-565 乳腺癌细胞FAK 表达可以有效地抑制肿瘤细胞的迁移^[9]。已有研究证实RNA干扰可以抑制组织蛋白酶B和MMP-9 表达，降低了胶质母细胞瘤细胞侵袭、肿瘤生长及血管发生^[10]。Gencer等^[11]证明MMP-3基因的沉默不仅减少了AGS细胞的侵袭力而且影响了MMP-10和MMP-15的表达。孙亚男等^[12]通过构建MMP-9 shRNA 的慢病毒载体LV2shMMP-9，转导喉癌细胞，结果发现MMP-9基因沉默对喉癌细胞体外侵袭有明显的抑制作用。在人舌癌颈淋巴结转移过程中，抑制FAK表达也可导致细胞迁移、侵袭能力降低^[13]。因此，作为黑色素瘤侵袭和转移的关键信号分子，靶向沉默小鼠恶性黑色素瘤MMP-9和FAK基因具有重要的研究价值和临床意义。

Hauck等^[14]研究发现，通过抑制人肺腺癌A549细胞FAK基因的表达使MMP-9分泌水平降低，并且降低了A549 细胞的侵袭力，其原因在于FAK基因的下调，抑制了EGF介导的MAP激酶活化途径，从而抑制了MMP-9的分泌。Chen等^[15]发现，抑制FAK在肝癌细胞中的表达，可使癌细胞黏附、侵袭、转移率显著降低，同时导致MMP-2和MMP-9的表达水平及活性明显降低。Shibata等^[16]用FAK siRNA 转染卵巢癌细胞可以通过Ras依赖的信号通路阻断整合素刺激的MMP-9表达。研究表明，MMP-9与FAK呈正相关性，但MMP-9是否作为FAK介导的信号通路的下游信号分子，或者另外的信号途径尚不清楚，且双基因联合干扰的抑制效果优于单基因的具体机制还需进一步研究。

通过体内实验研究我们可以得出结论，基因联合干扰MMP-9和FAK基因能够有效地抑制小鼠恶性黑色素瘤体内的转移，为进一步研究黑色素瘤基因治疗提供了现实依据和临床参考。RNAi的研究虽然取得了较大突破，但在其临床应用上进展缓慢，其中最大的障碍在于体内投递的siRNA、miRNA等效应分子效率低，但是随着进一步的研究深入，新型材料的开发一定能够使基因投递的效率得到较大程度地提高，使基因治疗早日应用于临床。