重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)是利用受体免疫球蛋白融合技术，把受体的细胞外区与人免疫球蛋白的Fc段基因融合得到的重组蛋白^[1]，通过与TNF-α结合，抑制TNF-α的生物学活性，在治疗银屑病、类风湿性关节炎、僵直性脊柱炎等疾病方面具有明显的疗效^[2]。重组的TNFR-Fc融合蛋白Fc段可形成二聚体结构，比天然的受体单体对TNF-α具有更大的亲和力^[3]。

蛋白糖基化是一种常见且复杂的翻译后修饰，修饰后产生数千种独特生物活性的糖蛋白。蛋白糖基化对其自身影响主要表现在亲和力、细胞毒性、药物体内代谢、免疫原性等方面。Fc区域的糖基化可以影响免疫原性(尤其是1，3 -α-半乳糖的糖类)、药代动力学、溶解性和稳定性，如果糖基化被消除，靶抗原的结合就会减少或不发生^[4-11]，Fc 段糖链对抗体与配体及抗原的结合就会减少或不发生。去糖基化的Fc段与效应配体结合会受到影响，从而影响其抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)或补体依赖的细胞毒效应(CDC)的活性^[12-13]。N-糖基化修饰在糖蛋白研究中占据着越来越重要的位置。TNFR-Fc融合蛋白糖基化通常是在重链Fc段第297位天门冬氨酸位点^[14-15]，不同低聚糖在此处与融合蛋白结合，从而形成不同的糖型，其修饰糖链主要包括末端唾液酸、末端N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、末端半乳糖等，通过影响FcγRI、FcγR II、FcγR III和c1q作用位点的空间结构进而发挥不同的生物效应。

在TNFR-Fc融合蛋白的脱糖基化研究中，我们利用PNGase F从融合蛋白Fc段完整切下N-糖苷^[16]，把融合蛋白与糖链彻底分开，以研究N-糖基化对其结构、稳定性和生物活性的影响。对优化CHO细胞培养工艺，指导TNFR-Fc 融合蛋白的生产及对TNFR-Fc的质量控制具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器

PNGase F(Sigma)，SDS-PAGE系统(Bio-Rad)，5800 MALDI-TOF/TOF(AB Sciex)，TSKgel G3000 SWXL凝胶色谱柱(Tosoh)，Ultimate 3000液相色谱仪(Dionex)，傅里叶红外变换光谱仪(BRVKER)，毛细管电泳系统(Beckman)，SYPRO Orange dye(Invitrogen)，荧光分光光度计(Perkinelmer)，荧光显微镜(OLYMPUS IX71)，酶标仪(Thermo)。

实验所用TNFR-Fc融合蛋白为本实验室自行制备，小鼠结缔组织成纤维细胞(L929)由本实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 TNFR-Fc的PNGase

F酶切实验稳定表达TNFR-Fc融合蛋白的CHO 细胞系由本实验室构建，CHO细胞培养液通过Protein A亲和层析、阴离子交换层析、疏水层析三步纯化，获得纯度高达95%以上的TNFR-Fc融合蛋白。每毫克的TNFR-Fc融合蛋白中添加275单位的PNGase F，37℃水浴条件下酶切24h，反应体系的pH保持在6~10。将酶切后的样品分别进行非还原处理和还原处理，分别选用6%和12%的SDS-PAGE进行定性检测。

1.2.2 TNFR-Fc SEC色谱法检测

选择TSKgel G3000 SWXL凝胶色谱柱检测比较PNGase F酶切前后TNFR-Fc的色谱行为。流动相：0.5mol/L NaCl、20mmol/L PB，pH 7.2；流速0.5ml/min，进样量20μl，检测波长280nm，室温运行40min。

1.2.3 质谱法检测

采用5800 MALDI TOF/TOF质谱仪检测比较PNGase F酶切前后TNFR-Fc的相对分子质量。取1μl经PNGaseF酶切和未经酶切的TNFR-Fc融合蛋白点至样品靶上，自然干燥后，再取0.6μl SA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品，在正离子模式下对样品测试范围矫正测试后测试其分子质量。

1.2.4 傅里叶变换红外光谱法分析

对PNGase F酶切处理的TNFR-Fc融合蛋白样品和未作酶切的TNFR-Fc进行冻干处理，取少量冻干样品，加入2g溴化钾研磨至肉眼观察无明显晶体透亮。压片，用傅里叶变换红外光谱仪检测(400~4 000CM-1波数)其二级结构。

1.2.5 荧光光谱法考察

采用荧光光谱法检测经PNGase F酶切和未经酶切的TNFR-Fc融合蛋白的内源荧光和外源荧光，从而比较两者的三级结构。其中内源荧光检测条件为：激发光波长295nm，发射光检测波长300~450nm，狭缝宽度3nm；外源荧光检测条件为：选用SYPRO Orange dye (宝石橙染料)作为外源性荧光试剂，激发波长为495nm，检测505~700nm波段，狭缝宽度为5nm，每个样品的检测值减去1倍浓度SYPRO 橙染料空白样数值。

1.2.6 加速稳定性实验

将糖基化的TNFR-Fc融合蛋白和去糖基化的TNFR-Fc融合蛋白经冻干成冻干粉，置于药品稳定性试验箱中，分别设置3个平行试验组，在37℃条件下，分别于1天、3天、5天、7天、9天、11天取样，用SEC-HPLC检测并对比糖基化和去糖基化的TNFR-Fc融合蛋白的纯度变化情况。

1.2.7 毛细管区带电泳法检测

采用毛细管区带电泳(Capillary Electrophoresis，CE)分析糖基化和去糖基化的TNFR-Fc融合蛋白，运用Beckman P/ACE MDQ 毛细管电泳系统，设置进样压力为5kP(0.5psi)，进样时间为5s，正向20kV分离，检测波长为214nm，熔融石英毛细管(有效长度/总长：40cm/50.2cm，内径75μm)。

1.2.8 细胞毒杀伤实验

TNF-α在放线菌素D的作用下，会杀伤L929细胞，通过L929细胞进行TNFR-Fc融合蛋白体外活性测定，比较糖基化和去糖基化的TNFR-Fc融合蛋白的抗TNF-α生物活性。将对数生长期的L929细胞消化后，用含5% FBS的1640培养基重悬，20 000个细胞/孔铺板于96孔板，37℃过夜。第二天每孔加50μl 含0.2% FBS的1640培养基(工作浓度含1ng/ml TNF-α和2μg/ml放线菌素D)，加入不同浓度的酶切前后TNFR-Fc样品，每个样品设置3个平行复孔，实验设置4组平行。37℃、5% CO₂条件下培养20h，在显微镜下观察并拍摄。吸取100μl上清液，每孔加10μl WST-8，孵育2h，测定450nm波长处OD值。

2 结果与分析 2.1 TNFR-Fc的PNGase F酶切结果

PNGase F酶能够专一作用糖肽、糖蛋白的N-糖苷键，将寡糖链和蛋白质部分分开。经SDS-PAGE，可以检测出PNGase F酶切前后TNFR-Fc相对分子质量的明显差异，如图 1所示。去糖基化的TNFR-Fc蛋白条带均略低于糖基化的蛋白质条带，说明分子质量略小于糖基化的TNFR-Fc，表明已成功切除糖链。

2.2 糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc SEC色谱行为比较

利用HPLC对糖基化和去N-糖基化的TNFR-Fc进行体积排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)分析，检测两者SEC色谱行为。因为酶切后TNFR-Fc融合蛋白的分子质量略有降低，因此在SEC-HPLC图谱(图 2)中，去糖基化的蛋白质出峰时间稍有滞后，保留时间增加，进一步说明在PNGase F酶作用下形成了去N-糖基化的TNFR-Fc。

2.3 糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc相对分子质量比较

酶切前后的TNFR-Fc通过5800 MALDI TOF/TOF检测其质荷比(m/z)，测得样品的相对分子质量如图 3所示，酶切后的TNFR-Fc分子质量比酶切前约小10kDa，说明经PNGase F作用后N-糖链已成功切除，被切除的N-糖链约为10kDa。但由于TNFR-Fc融合蛋白中还存在其他蛋白质修饰，可能使蛋白质在仪器中进行离子化时受到影响，导致飞行轨迹发生变化，从而使检测出的分子质量比理论值小，所以该质谱图仅可用于比较N-糖链是否被成功切除，不能说明TNFR-Fc融合蛋白的分子质量。

2.4 糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc 二级结构比较

将PNGase F酶切前后的样品通过傅里叶变换红外光谱进行检测，通过谱图中的吸收峰分别与分子中各基团的振动形式相互对应，可比较去N-糖基化前后TNFR-Fc的二级结构。傅里叶变换红外光谱的扫描结果显示，在1 200~2 000cm^－1波数(双键伸缩振动区，C=O键在此区有一强吸收峰)，酶切前后TNFR-Fc谱图基本保持一致(图 4)，表明去糖基化对TNFR-Fc 二级结构不会有较大影响。

2.5 糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc三级结构比较

荧光光谱法能够测定激发谱、发射谱、荧光强度、荧光寿命等物理参数，这些参数可以从不同角度反映去N-糖基化对TNFR-Fc融合蛋白三级结构的影响，本试验中测定内源和外源性荧光以检测去N-糖基化对TNFR-Fc融合蛋白三级结构的影响，结果如图 5所示。在内源性荧光检测中，糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc融合蛋白在295nm激发光下，其在350nm均有一最大荧光发射峰，且两者的荧光检测值并没有明显差异，表明Trp基团附近的微环境在PNGase F酶切前后没有大幅度波动。在外源性荧光检测中，糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc融合蛋白在495nm激发光下，两者在580nm处都有一最大荧光发射峰，荧光检测值也没有显著差异，说明TNFR-Fc CH₂结构域的疏水性在酶切前后没有明显变化。

2.6 糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc 加速稳定性比较

在本实验中，我们在37℃加速条件下研究N-糖链切除对TNFR-Fc融合蛋白稳定性的影响。由图 6分析可知，TNFR-Fc融合蛋白在去除N-糖链后的前5天，二聚体降低趋势基本相同，第5天TNFR-Fc纯度由95%降至75%，后续实验中去N-糖基化TNFR-Fc蛋白纯度降低速率明显高于糖基化蛋白。该实验中聚体的变化并不明显，均保持在3%以下，而蛋白质降解物呈逐渐上升的趋势。实验结果表明TNFR-Fc融合蛋白CH₂结构域的糖基化对蛋白质的稳定有一定的保护作用，切除N-糖链，TNFR-Fc二聚体降低速率加快。

2.7 糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc荷电性质比较

毛细管区带电泳根据质荷比差异，使不同质荷比的带电粒子在电渗流作用下流出，PNGase F切除N-糖链后，TNFR-Fc融合蛋白CE检测结果表明，糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc在毛细管区带电泳中的保留时间没有明显改变，均为2.9min，即其质荷比没有较大改变，见图 7。

2.8 糖基化和去N-糖基化TNFR-Fc 细胞毒杀伤实验比较

WST-8能被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为黄色甲臢染料，颜色的深浅与细胞的增殖成正比，而与细胞毒性成反比，其在450nm处有特异性吸收。检测结果表明，酶切前后TNFR-Fc融合蛋白都能中和TNF-α对L929细胞的杀伤作用，如图 8所示。糖基化的TNFR-Fc融合蛋白对L929细胞的EC50为2.263 0ng/ml，去N-糖基化的TNFR-Fc融合蛋白对L929细胞的EC50为2.790 2ng/ml，如图 9所示。经统计学分析，二者没有无显著性差异，即去N-糖基化对TNFR-Fc融合蛋白生物学活性无明显影响。

3 讨 论

糖基化的不均一性通常会导致蛋白质样品的不均一性，最终产品的质量、生物特性、纯度及临床效果都可能产生较大的差异^[17-20]，其中蛋白质的N-糖基化是研究最多的。N-糖基化对单克隆抗体的影响正被广泛研究，而作为最畅销的治疗性蛋白质药物之一的TNFR-Fc融合蛋白的N-糖基化研究却鲜有报道。TNFR-Fc是TNFR的胞外段与IgG1的Fc段联合的融合蛋白，表达出的蛋白质会形成类似于抗体的二聚体结构，其中TNFR段有两个潜在的糖基化位点，Fc段有一个糖基化位点。不同的生产工艺会形成不同的糖基化，有些糖基化位点未必能够形成糖基化，加之不同的糖链糖型，从而形成了蛋白质的不均一性。本文通过切除糖链研究糖基化对重组的TNFR-Fc有何影响。

研究结果显示，切除TNFR-Fc融合蛋白的N-糖链后，蛋白质的稳定性受到一定的影响。这与目前许多文献报道是一致的。例如，有许多文献报道糖基化修饰能增加蛋白质的热稳定性^[21-23]和构象稳定性，并且增强对水解酶的抵抗力 ^[24]。 Zheng等^[25]研究了糖基化对三种单克隆抗体结构和稳定性的影响，结果表明，PNGase F酶处理抗体后，去N-糖链降低了抗体CH₂结构域的热稳定性，对Gu-HCl诱导的去折叠表现出较小的阻力，对木瓜蛋白酶的水解更敏感，且去糖基化的抗体具有较高的聚集率。但在本文中，TNFR-Fc融合蛋白去N-糖基化后，虽然其稳定性也受到了影响，但蛋白质更趋向于降解。由此可见，N-糖基化对不同蛋白质的作用不尽相同，这和蛋白质本身的结构、糖链的种类、糖链的位置等都密切相关。

本研究中切除糖链TNFR-Fc融合蛋白构象和荷电性质没有明显差别，生物活性也未见显著性差异，这与Zheng等报道的，N-糖链的切除对单克隆抗体的空间构象无显著影响^[25]相一致。TNFR-Fc融合蛋白作为一种抗体类蛋白，其与单克隆抗体在糖基化影响上具有一致性，推测这种一致性的原因可能是因为N-糖链位于Fc段CH₂结构域，质量占蛋白质分子质量较小比例^[25]，N-糖链的切除，对CH₂结构域的影响可能是较局部的，所以N-糖基化的切除对TNFR-Fc融合蛋白和单克隆抗体的整体构象不会产生明显的改变。

同单克隆抗体药物的糖基化分析一样，本研究对TNFR-Fc融合蛋白N-糖基化的分析将对TNFR-Fc融合蛋白作为药物蛋白的质量研究和质量标准的建立，以及糖基化的优化和控制提供帮助。