费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)代谢合成维生素B₁₂的同时，会产生以丙酸为主的副产物，且丙酸对菌体生长具有一定的反馈抑制作用。因此，发酵过程中如何降低丙酸的反馈抑制作用，提高费氏丙酸杆菌发酵的过程经济性是一个至关重要的问题。近年来，研究人员从基因改造^{[1, 2, 3]}、反馈抑制机理^[4]等方面进行了大量的研究，并取得了一定的进展。但是，维生素B₁₂的代谢途径十分复杂，涉及30多个相关基因，70多步反应，目前还无法在分子层面进行全面阐述^[5]。因此，采用过程工程手段来解除丙酸对发酵的反馈抑制作用就显得尤为重要。

研究发现，在费氏丙酸杆菌发酵过程中引入产物原位分离技术(in situ product recovery,ISPR)，不仅可以及时移除发酵液中的丙酸，解除其对发酵的反馈抑制作用，还可以实现边分离、边发酵的半连续生产方式。南京工业大学欧阳平凯院士课题组^{[6, 7]}构建了一种多孔纤维床反应器(FBB)将Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015发酵过程中产生的丙酸及时分离出来，提高了丙酸的发酵产率。本课题组则将层析技术与ISPR分离技术结合起来，建立了一种以扩张床原位吸附(expanded bed adsorption,EBA)为特征的Propionibacterium sp.新型发酵过程，提高了维生素B₁₂和丙酸的产量^[8]。此外，本课题组还发现，采用HPLC即可跟踪监测发酵过程中腺苷钴啉醇酰胺(Ado-cbi)的合成情况^[9]。Ado-cbi是一种维生素B₁₂的代谢中间体，磷酸化后与胞内的α-吡咯核糖反应生成维生素B₁₂。由于Propionibacterium freudenreichii代谢合成α-吡咯核糖的能力较弱，限制了Ado-cbi的转化速率，并使其在胞内不断积累。实际生产过程中，为提高维生素B₁₂的合成效率，往往需要人为添加α-吡咯核糖的结构类似物5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)。

直接在发酵液中添加DMB，从而促进Ado-cbi向维生素B₁₂的转化，这在传统的批次发酵过程中是可行的。但在半连续或连续发酵过程中，DMB的残留会抑制代谢中间体Ado-cbi的合成，从而使得维生素B₁₂的积累无法通过连续发酵进行下去。为了实现费氏丙酸杆菌“边分离、边转化、边发酵”的半连续发酵生产，本课题组对能否采用细胞离位转化的方式来进行维生素B₁₂的合成开展了研究：即当发酵进行到某个时间节点时，将菌体细胞从发酵液中分离出来，转移至另一个反应体系中，加入DMB进行维生素B₁₂的合成，从而在分批补料发酵的基础上实现费氏丙酸杆菌的半连续发酵。

因此，本研究首先考察了费氏丙酸杆菌细胞离位转化合成维生素B₁₂的可行性，并从细胞分离时机、分离方式、离位转化体系等方面进行了优化，为费氏丙酸杆菌的半连续发酵耦合工艺奠定了前提条件。

费氏丙酸杆菌CICC 10019购自中国工业微生物保藏中心。

斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，玉米浆干粉10，硫酸铵2，浓氨水调节pH 6.8~7.0后加碳酸钙2，琼脂20，115 ℃灭菌20 min。

种子培养基(g/L)：葡萄糖35，玉米浆干粉21，硫酸铵5，磷酸二氢钾4，氯化钴0.005，浓氨水调节pH 6.8~7.0，120 ℃灭菌30 min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，玉米浆干粉41，硫酸铵4.6，氯化钴0.0127,浓氨水调节pH 6.8~7.0，120 ℃灭菌30 min，葡萄糖单独于115 ℃灭菌20 min。

LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,北京迪马科技有限公司)；HYG-A型电热恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；LDZX-40B1 型立式蒸汽压力灭菌器(上海申安医疗器械厂)；TGL-16C型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪试验室仪器开发有限公司)；5 L全自动搅拌式发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)；PL203 型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Delta 320型pH计(瑞士Mettler Toledo公司)。

玉米浆干粉(河北灵山鹤植物蛋白制造有限公司)，葡萄糖，氨水，冰醋酸，硫酸铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，浓硫酸，碳酸钙，乙酸钠均为国产分析纯，乙腈为色谱纯。

取斜面种子活化后，挑取一环接种于摇瓶培养基中，于30 ℃下培养48 h,然后按照10 %的接种量转接于2 L的发酵培养基中，于30 ℃条件下培养84 h。发酵培养过程中使用浓氨水调节pH，使发酵液保持pH 6.8~7.0。在发酵培养过程中不添加DMB，当葡萄糖下降到10 g/L时补糖至20 g/L。

取5 ml发酵液于10 000 r/min离心收集菌体，去离子水洗涤一次。用pH 3.5乙酸钠缓冲液重悬菌体，配成5 ml菌悬液，95 ℃水浴30 min破碎细胞，使维生素B₁₂释放，10 000 r/min离心收集上清液，0.22μm纤维素滤膜过滤。为了防止其光解，整个操作过程中需避光进行。

在发酵进行到84 h时取出菌液，置于无菌离心瓶中，4 000 r/min离心20 min。倒掉上清液后，无菌去离子水洗涤一次。分别采用新鲜发酵培养基、处理过的发酵液(丙酸浓度小于10g/L)以及离心后原发酵上清液将菌体重悬，配制成相应浓缩倍数的菌液，进行后续研究。重悬体系均已灭菌，实验全程保持无菌操作。

维生素B₁₂色谱条件：C18色谱柱，紫外显示器，紫外波长254 nm，流动相ⅠpH 3.5乙酸钠缓冲溶液，流动相Ⅱ乙腈，流速1 ml/min，柱温25 ℃，进样量为10 μl。洗脱条件：0~30 min，5%~24%乙腈梯度洗脱。

在发酵60 h时开始每隔12 h取样检测中间体含量，共取样8次，检测方法同1.4.3 。取样的同时再取出100 ml菌液于150 ml无菌锥形瓶中添加0.9 mg/L的DMB进行维生素B₁₂的转化合成，30 ℃转化培养48 h，转化过程中维持反应体系pH 6.8~7.0。

在发酵培养结束后，采用1.4.2 的方法得到3瓶500 ml的菌体重悬液。用于重悬菌体的转化体系分别为新鲜发酵培养基、处理过的发酵液(丙酸含量小于10 g/L)以及离心后的原发酵清液，转化体系均已灭菌。三个反应体系均添加0.9 mg/L DMB进行维生素B₁₂转化合成，30 ℃转化培养48 h，转化过程中使用氨水维持反应体系pH 6.8~7.0。转化结束后检测维生素B₁₂含量。

在发酵培养结束后，采用1.4.2 的方法得到5瓶100 ml的菌体重悬液，浓缩倍数为5倍浓缩、10倍浓缩、15倍浓缩和20倍浓缩，对照组为不浓缩菌悬液，转化反应体系为离心后的原发酵清液，以浓缩前菌液体积量添加0.9 mg/L DMB后30 ℃转化培养48 h，转化过程中维持反应体系pH 6.8~7.0。转化结束后检测维生素B₁₂含量。

在发酵培养结束后，采用1.4.2 的方法得到5瓶100 ml的菌体重悬液，菌体浓缩倍数为5倍，转化反应体系为离心后的原发酵清液。转化时DMB添加量分别为1.125 mg/L、2.25 mg/L、3.375 mg/L、4.5 mg/L、6.75 mg/L。30 ℃转化培养48 h，转化过程中维持反应体系pH 6.8~7.0，转化结束后检测维生素B₁₂含量。

费氏丙酸杆菌代谢合成维生素B₁₂的途径十分复杂，反应涉及到30多个基因，70多步反应^[10]。其中，代谢中间体Ado-cbi经磷酸化后，即可与胞内的α-吡咯核糖反应生成维生素B₁₂，其含量高低直接决定了维生素B₁₂的产量。王鹏等^[11]详细阐述了Ado-cbi与维生素B₁₂之间的代谢关系，发现二者是等摩尔转化的。因此，基于胞内Ado-cbi的浓度来建立维生素B₁₂的细胞离位转化工艺是可行的。而研究发现，Ado-cbi合成维生素B₁₂的过程是在酶促体系下完成的，无需保持细胞活性^{[12, 13]}，这就为细胞离位转化维生素B₁₂奠定了基础。

发酵过程中Ado-cbi首先在胞内逐渐积累，当加入DMB之后可转化成维生素B₁₂。在发酵的不同时间添加DMB，结果表明，维生素B₁₂的产量与Ado-cbi的积累量正相关，与文献报道一致^[11]，如图 1所示。当发酵时间为84 h时，Ado-cbi的量可达到10.69 mg/L，此时加入DMB之后，维生素B₁₂的产量达到了11.49 mg/L。但是，研究还发现，当Ado-cbi在胞内积累至一定浓度后便不再增加，究其原因主要是由于随着发酵的进行，菌体逐渐老化，生理活性下降所致。而过早地加入DMB，则会影响Ado-cbi的代谢合成，对维生素B₁₂的转化也是不利的。因此，DMB的添加时机直接影响着维生素B₁₂的产量。为提高费氏丙酸杆菌代谢合成维生素B₁₂的效率，选择将菌体培养至84 h时进行转化，最为适宜，而检测中间体在菌体中积累的情况也可以作为菌体转化培养的一项重要指标。

图 1 代谢中间体Ado-cbi对维生素B12产量的影响 Fig. 1 Effect on production of vitamin B12 by metabolic intermediates Ado-cbi

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转化体系对于费氏丙酸杆菌转化生产维生素B₁₂来说是必要的，合适的转化体系不仅有利于其转化，缩短转化时间，还会在后期提取时获得满意的收率。由图 2可知：菌体在处理过的发酵液转化体系中产量最低，随着转化培养时间的延长，其维生素B₁₂积累量有所下降，最终获得了10.44 mg/L。与新培养基相比，菌体在原发酵清液中17.54 mg/L的产量虽然有所不及，但比处理过的培养基产量高77.6%。菌体在新培养基转化培养过程中，维生素B₁₂的合成一直持续，但到了70h时合成速率明显降低。虽然菌体在新培养基转化体系中获得了最高产量22.07 mg/L，但过长的转化时间以及新培养基的配制都是将来制约工业生产发展的不利因素。研究发现，发酵液中的丙酸对费氏丙酸杆菌转化生成维生素B₁₂有一定的影响^{[14, 15]}。而此时旧培养基中的丙酸含量恰好是25 g/L,对维生素B₁₂的合成有促进作用。因此，通过考虑转化产量以及转化时间这两个重要因素，选择原发酵清液作为转化体系是最合适的。

图 2 不同转化体系对维生素B12合成的影响 Fig. 2 Effect on vitamin B12 synthesis by different transformation culture medium

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将费氏丙酸杆菌离位浓缩然后再进行转化，是首次尝试。从图 3可看出，浓缩倍数越高，产量越高。无论浓缩情况如何，转化培养都在48 h时基本完成，而且产量的增加也与浓缩倍数成比例关系，在20倍浓缩时得到最高产量207.49 mg/L。但是从结果可以看出，随着浓缩倍数的增长，维生素B₁₂转化效率逐渐降低，中间体的剩余量越来越高。在5倍浓缩时的转化效率最高，此时中间体的消耗率最高达到74.6%，维生素B₁₂的产率为2.26 mg/(Lh)。同时，虽然浓缩程度越高，产量越高，但是高倍浓缩的菌液会变得非常粘稠，粘稠的菌液会影响传质速率，对DMB的摄取产生消极的影响。浓缩程度越大，菌体密集程度越高，相互之间的竞争也会更加激烈。综合考虑产量以及转化效率，浓缩倍数为5倍最适宜。

图 3 浓缩倍数对维生素B12合成的影响 Fig. 3 Effect on vitamin B12 yield by different concentrations

图选项

维生素B₁₂转化过程中，胞内的α-吡咯核糖浓度是一个关键的限速步骤，直接影响着维生素B₁₂合成效率^[16]。为提高维生素B₁₂的转化效率，往往需要添加α-吡咯核糖的结构类似物DMB来提高B₁₂的合成效率。在传统发酵过程中，DMB用量一般为 0.9 mg/L,为提高离位转化效率，考察了离位浓缩状态下的菌体合成维生素B₁₂对DMB的需求量。

由图 4可知不同DMB的添加量在一定范围内对维生素B₁₂产量的影响很大，少量的DMB因不足以消耗菌体产生的中间体，因此产量很低，此时的菌体不再积累维生素B₁₂，菌体中既存留中间体Ado-cbi，也积累了一定量的维生素B₁₂。但过量的DMB与足量的DMB效果一样，原因是细胞内的中间体都消耗完全，不再转化成维生素B₁₂。而菌体在摄入DMB的同时，也不再继续合成中间体。因此，离位浓缩转化时最适DMB的添加量为4.5 mg/L。提高菌体的浓缩倍数，就要提高相应的DMB添加浓度。菌体虽然被浓缩，减小了体积，但对DMB的需求量并不会减少。而由于摄入DMB后菌体不再合成中间体，产物维生素B₁₂的积累不再增加时意味着转化的结束，因此添加过量的DMB是无意义的。

图 4 DMB添加量对维生素B12合成的影响 Fig. 4 Effect on vitamin B12 yield by different DMB addition

图选项

探讨了费氏丙酸杆菌细胞离位转化合成维生素B₁₂的可行性，优化了离位转化工艺。结果表明，费氏丙酸杆菌菌体细胞分离的最佳时间为84 h，浓缩倍数为5倍，DMB的添加量为4.5 mg/L，转化时间为48 h,维生素B₁₂的产量为108.06 mg/L。

费氏丙酸杆菌细胞离位转化合成维生素B₁₂，不仅解决了工业生产过程中发酵废液的回用问题，降低了废水的排放量，节约了生产成本；还有助于费氏丙酸杆菌“边分离、边转化、边发酵”的半连续发酵工艺的建立，实现维生素B₁₂和丙酸的双产物耦合发酵，提高了费氏丙酸杆菌发酵的过程经济性。