棘球蚴病又称包虫病,主要是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病,呈全球性分布^[1]。我国是棘球蚴病发病最高的国家之一^[2]，至今已在25个省、市、自治区的人、畜间发现原发性棘球蚴病，该病为牧区第一大寄生虫病。其中以我国西部和北部的新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙古、四川省等地最为严重^[3]。目前包虫病的治疗主要以手术和药物治疗为主，然而手术治疗后复发率高且对人体损伤较大，而药物存在一定的毒副作用，部分患者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。所以无法从根本上消灭包虫病，因此该病仍未得到有力的控制已成为我国西部严重危害农牧民健康的疾病之一。因此，对包虫病的早期诊断和免疫预防也就成为当前的研究重点^[4]。预防为主是防治本病的根本方针，采取免疫和预防方法控制棘球蚴病是最经济、快速和有效控制该病的实用方法。日本学者Katoh等^{[5, 6]}在研究多房棘球蚴绦虫时，发现一些疫苗候选蛋白具有分泌功能和膜表面锚定作用，它们通常都具有位于氨基末端疏水的信号肽和羧基末端疏水的跨膜区域，并与寄生虫和宿主的相互作用有关。这些跨膜蛋白质有利于寄生虫穿透宿主的细胞膜侵入宿主的体内和调节宿主的免疫应答。因此，可以将这些分泌型蛋白质作为候选疫苗或用于诊断疾病并命名为EMY162抗原，且发现emY162重组抗原可以诱导大鼠产生74.3％的免疫保护作用,同时EMY162重组抗原在泡型包虫病患者血清中阳性率也明显高于em95，在多房棘球蚴绦虫的四个发育阶段(原头节，续绦期，幼虫，成虫)均有emY162抗原蛋白表达。用多房棘球蚴病犬的血清进行Western blots分析显示，该抗原产生很强的IgG免疫反应。现在已经证明emY162是分泌型蛋白质，能够刺激犬的免疫系统产生有效的免疫应答，因此emY162抗原被认为是理想的候选疫苗。

但是，在细粒棘球绦虫是否存在类似的抗原—EgG1Y162抗原及其是否可以作为理想的保护性抗原，国内外均未见报道。因此本研究首次从细粒棘球蚴成虫、生发层阶段、原头蚴和虫卵中克隆EgG1Y162抗原基因，构建了PET-41a/EgG1Y162原核表达质粒并对其进行了初步诱导表达和抗原性检测的研究。为进一步开展免疫保护作用的研究及重组疫苗的研制奠定基础，希望能为包虫病的防治寻找更有效的保护性抗原。

本研究经本院医学伦理委员会审批同意；细粒棘球绦虫原头蚴是科研组在前期研究中在液氮中保存的。PUCm-T克隆质粒购自大连宝生物TaKaRa公司；菌种.E.coli DH5-α由本课题组保存。

DNA提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；(IPTG)异丙基硫代-β-D-半乳糖苷购于Promega公司；限制性内切酶EcoRI和HindⅢ、PCR试剂盒、T4 DNA连接酶、DL2000/λ-HindⅢ DNA标志物均购自TaKaRa公司；X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)等其它生化试剂均购自Sangon公司；引物由上海Sangon公司合成；DNA回收试剂盒与质粒提取试剂盒均购自上海捷瑞公司。SV Total RNA Isolation System RNA提取试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。

根据文献^[20]报道的emY162 cDNA序列(GenBank序列号：AB303298)，利用DNAman软件设计上下游引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物的设计如下： 上游引物：5′-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3′，下游引物：5′-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3′。分别加入EcoR I 和Hind Ⅲ酶切位点(下划线斜体字)。

细粒棘球蚴成虫、生发层阶段、原头蚴和虫卵DNA与RNA的提取在细粒棘球蚴四个阶段中进行，具体操作步骤见DNA和RNA试剂盒说明书。

以细粒棘球绦虫4个阶段cDNA为模板,同时进行荧光定量PCR，根据标准品已知的拷贝数及标准曲线，电脑自动计算出未知样品cDNA的最终拷贝数(SQ Mean)和CT值的均数。进而比较各阶段的表达情况。

将提取的RNA反转录成cDNA,以cDNA和DNA为模板经行扩增，扩增产物进1.0%琼脂凝胶中电泳，经DC2000橡胶成像分析仪观察分析结果。

利用PUCm-T载体的特性进行TA克隆。将经RT-PCR方法合成的cDNA为模板扩增的PCR产物与克隆载体PUCm-T在T4连接酶作用下，在16℃连接16h，连接产物转化至E. coli DH5α中，涂布于预先用7.0 μl(0.lmol/L IPTG)和70μl(20mg/ml )X-gal处理的氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上，37℃培养过夜。经蓝白斑筛选、增菌培养后抽提质粒，进行PCR扩增和EcoR I、Hind Ⅲ双酶切鉴定,并送华大基因公司测序。

对测序结果正确的pUCm-T/EgG1Y162进行双酶切，通过12%琼脂糖凝胶电泳回收大小正确的EgG1Y162片段，酶切pET41a载体后，将回收酶切后的片段用T4 DNA连接酶使目的片段和载体连接，成功克隆并构建pET41a-EgG1Y162原核表达质粒，经基因转化、细菌培养和质粒小量提取后，用PCR法扩增和双酶切法鉴定重组质粒pET41a-EgG1Y162，并送华大基因公司再次测序。

测序正确的PET-41a/EgG1Y162原核表达质粒,30℃，经IPTG(终浓度为0.5mmol/L) 诱导0h、2h、4h、6h，收集菌体，经4℃、12 000 r/min离心10 min后,12% SDS-PAGE检测表达情况。在蛋白大量表达时，进行大量诱导和超声，利用His柱纯化，用含不同浓度Elution buffer(100、200、300、500 mmol/L，pH7.4)的洗脱缓冲液分步多管洗脱，12%SDS-PAGE检测洗脱物纯度。将洗脱浓度最高，最纯的洗脱液进行收集，在pH=8.0的PBS缓冲液中透析24h，其间换3次透析液，收集透析后的蛋白。然后用浓缩柱进行浓缩，浓缩后的蛋白用BradFord蛋白定量试剂盒进行定量，纯化后的蛋白冻存－80℃备用。

用诱导表达的pET41a-EgG1Y162蛋白为抗原，以感染包虫病的阳性和阴性人和犬血清标本为一抗，抗人/抗狗的血清作为二抗，进行免疫印迹实验。

利用DNAman软件及GeneBank的序列比对功能(BLAST)对序列进行分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。利用网上Spidey (http://www.ncbi.nih.gov/spidey)分析EgG1Y162 cDNA的外显子组成。运用MEGA4软件对细粒棘球蚴EgG1Y162基因的进化关系进行分析。

利用SPSS16.0统计软件，两组实验数据均为方差齐因此采用单因素方差分析(one-way，ANOVA)，实验数据表示为x±s，P＜0.05 差异有统计学意义。

从细粒棘球绦虫的不同发育阶段组织中用RNA提取试剂盒按说明书提取总RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8~2.0之间，总RNA经变性琼脂糖凝胶电泳结果(图 1)显示：28S和18S条带清晰，表明RNA提取完整，无降解和蛋白残留，可用于后续实验研究。

图 1 总RNA琼脂糖凝胶电泳 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis result of total RNA1:RNA from Adolt worms; 2:RNA from prodoscoleces; 3:RNA from gemminal lays; 4:RNA from eggs

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将egActⅡ qRT-PCR 反应的产物进行融解曲线测定，融解曲线出现明显的主峰，无杂峰，结果见图 2a；从荧光定量RT-PCR 反应标准曲线可见(图 2b)，R2为0.996，大于0.990甚至接近于1，结果可靠，满意。将EgG1Y162 qRT-PCR PCR反应的产物进行融解曲线测定，融解曲线出现明显的主峰，无杂峰，结果见图 2c；从荧光定量 RT-PCR 反应标准曲线可见(图 2d)，R²为0.990，结果可靠，满意。将qRT-PCR完成后系统所给的cDNA拷贝数SQ Mean 列表，根据表中数据，将EgG1Y162在不同阶段的拷贝数均与管家基因egActⅡ作比值(标准化结果)，根据比值进行分析，结果见表 1和图 3。从表中可以看出，EgG1Y162在成虫、生发层阶段、原头蚴和虫卵阶段均有不同程度的表达。但是EgG1Y162在成虫中表达量最多，相对值为19.526，差异有统计学意义(P＜0.01)，其次生发层阶段，为5.122，再次在原头蚴阶段，相对值为5.083，而在虫卵阶段最少，为1.6588。

图 2 EgG1Y162基因与egActⅡ基因在细粒棘球绦虫四个不同发育阶段表达的溶解曲线和标准曲线 Fig. 2 Dissolved and standard curves of the expression of EgG1Y162 gene and egActⅡ gene of Echinococcus granulosus in four different developmental stages

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图 3 EgG1Y162基因在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达 Fig. 3 Expression of EgG1Y162 gene of Echinococcus granulosus in different developmental stages

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以基因组DNA为模板用EgG1Y162引物进行PCR扩增，可得到大约为1 600 bp的片段；以四个发育阶段的总RNA为模板，通过RT-PCR，利用特异性引物，扩增EgG1Y162目的片段，EgG1Y162 cDNA的扩增产物大约为350bp。

将PCR扩增产物EgG1Y162目的基因与pUCm-T载体在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，成功构建重组质粒pUCm-T/EgG1Y162，在铺有氨苄抗生素和TPTG及X-gal的抗性筛选板上进行蓝白斑和抗生素抗性筛选，获得白斑菌落。随机各挑选2个pUCm-T/EgG1Y162重组质粒，分别用EcoRI和Hind Ⅲ双酶切,可以切出大小约为1 600bp及350bp的特异条带，然后委托北京华大基因公司测序。

经测序结果显示送测序的两个克隆片段分别为1 648bp和360bp。对测序结果正确的pUCm-T/EgG1Y162和pET41a质粒进行双酶切，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳回收360bp正确的EgG1Y162片段，酶切pET41a载体后，回收酶切后的片段，用T4 DNA连接酶将目的片段和载体进行连接，成功克隆并构建pET41a-EgG1Y162原核表达质粒，经基因转化、细菌培养和质粒小量提取后，用PCR法扩增和双酶切法鉴定pET41a-EgG1Y162重组质粒目的片段在360bp左右的特异条带，并委托北京华大基因公司测序。

将测序正确的重组pET41a-EgG1Y162 原核表达质粒经IPTG 诱导表达后，由于pET41a 质粒所带标签蛋白分子量为32.29kDa，推测表达的重组蛋白分子量约44kDa。SDS-PAGE 电泳结果显示，在44kDa 处可见egG1Y162重组蛋白表达，且蛋白表达量随诱导时间延长而逐渐增加，说明成功诱导表达出EgG1Y162重组蛋白SDS-PAGE电泳结果显示EgG1Y162 重组蛋白得到了稳定的高效表达(图 4)。分别用不同浓度的咪唑洗柱，结果通过SDS-PAGE 电泳分析发现，500mmol/L咪唑的浓度为最佳的洗脱液。而且SDS-PAGE电泳结果显示抗原成分较纯(图 5)。

图 4 EgG1Y162重组蛋白SDS-PAGE 电泳分析结果 Fig. 4 Results of SDS-PAGE electrophoresis analysis of EgG1Y162 recombinant protein

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图 5 EgG1Y162重组蛋白纯化后SDS-PAGE 电泳分析结果 Fig. 5 Results of SDS-PAGE electrophoresis after purification of EgG1Y162 recombinant protein

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一抗、二抗分别经1∶300，1∶3 000稀释后，只在44.0kDa处出现边缘清晰的特异性条带，EgG1Y162重组蛋白可被感染细粒棘球绦虫犬的阳性血清特异性识别，且不与未感染细粒棘球绦虫犬血清反应，这一结果表明EgG1Y162重组蛋白具有良好的抗原性(图 6)。6只感染犬血清均为阳性反应，另外6只未感染犬血清均为阴性反应。

图 6 犬血清Western blot检测结果 Fig. 6 Detection results of serum Western blot in dogs

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包虫病人(CE)的血清分析EgG1Y162的抗原性。用Western blot 分析了11个包虫病人血清样本并以10个正常人的血清样本作为对照。结果只在44.0kDa处出现清晰的特异性阳性条带，EgG1Y162重组蛋白与包虫病人血清样本中有10个阳性反应(1~11)，而正常人血清没有阳性反应(见图 7、图 8)。

图 7 Western blot检测包虫病人血清 1：蛋白分子量标志物；2～12：包虫病人的血清 Fig. 7 Western blot detected in sera from patients with hydatidosis

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图 8 Western blot检测正常人血清结果 1：蛋白分子量标志物；2～11：正常人的血清 Fig. 8 Western blot detection of serum results in human serum

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经DNAman软件分析测序结果表明，EgG1Y162基因长度为1 648 bp，cDNA长度为459 bp，EgG1Y162基因与GenBank中emY162基因序列(GenBank序列号为AB303297)，EgG1Y162的cDNA与GenBank中emY162的cDNA(GenBank序列号为AB303298)同源比较发现，EgG1Y162基因是在细粒棘球绦虫中发现的一种新基因，已将其基因序列和cDNA序列，分别登录GenBank，登录号为AB458258和AB45825。通过网上Spidey分析显示，EgG1Y162基因序列由3个外显子和2个内含子组成(图 9)，根据GenBank中emY162的基因序列，其转录起始还包括三个核苷酸，所以序列外显子区域分别为4～73，1 067～1 384和1 581～1 651。通过网上Blast分析显示，比对结果发现EgG1Y162与emY162的核苷酸序列有20个核苷酸变异位点，分别位于27g(a)，41c(t)，55a(g)，58a(g)，78g(a)，94g(a)，100a(c)，195a(g)，238a(t)，240c(a)，245a(g)，331t(c)，333t(c)，339a(-)，342-(a)，347c(g)，354t(a)，369c(t)，352a(g)，424t(c)，括号中是emY162的序列。EgG1Y162的cDNA序列与emY162的cDNA有95%的相似性，EgG1Y162与EG95氨基酸序列有30.61%的相似性，EgG1Y162与EM95氨基酸序列有33.58%的相似性(图 10)。通过MEGA4软件对EgG1Y162抗原与细粒棘球蚴其它抗原和多房棘球蚴的emY162抗原进行同源性分析发现它与emY162抗原同源性最接近(图 11)。

图 9 egG1Y162基因分析 Fig. 9 egG1Y162 gene analysis

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图 10 氨基酸序列BLAST分析结果 Fig. 10 Analysis results of amino acid sequence BLAST

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图 11 EgG1Y162基因进化树分析 Fig. 11 Gene evolution tree analysis of EgG1Y162 gene

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包虫病在中东、南欧、拉丁美洲、中亚、澳大利亚和非洲部分国家流行，包虫病在我国主要分布于新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏、及四川^{[7, 8, 9, 10]}。随着现代社会的发展，人口流动增加，宠物(犬)和经济动物(狐狸)养殖数量增加，导致包虫病蔓延扩散，很多省(区)均发现包虫病病人。世界各国均投入大量的人力、物力、财力，通过各种途径开展包虫病的防治研究，由于分子生物学技术的飞速发展，研制分子疫苗的条件已经成熟，采用基因工程疫苗及DNA疫苗可能是彻底控制包虫病流行的最有效的方法之一^{[11, 12, 13]}。Akira等^[14]于2002年发现了Em95抗原基因，并证明其可以诱导宿主的免疫保护反应，em95和eg95抗原已经作为第一候选疫苗来预防棘球蚴中间宿主的感染。目前重组疫苗的研制虽然有了一定进展^{[15, 16, 17, 18]}，但是没有取得理想的预防和保护效果，尚待发现更有效的保护性抗原 。

本研究首次在细粒棘球蚴中发现新抗原并命名为EgG1Y162。通过DNA序列分析及同源性分析发现EgG1Y162与emY162基因序列的差异性主要存在于内含子区域，保持了编码序列的保守性及蛋白抗原的稳定性。EgG1Y162抗原基因存在于细粒棘球蚴的四个阶段，同时通过进化树分析发现EgG1Y162蛋白亲缘性关系最接近emY162，可以成为终末宿主的保护性抗原。EgG1Y162新抗原基因的发现，为细粒棘球绦虫的疫苗研究开辟了一条新途径，为进一步研究EgG1Y162蛋白质在中间宿主和终宿主抗棘球绦虫感染中的保护能力奠定实验基础。经EgG1Y162 基因在细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个不同发育阶段的表达的荧光定量PCR结果分析，不管是从实时荧光定量PCR SQ绝对值上来看还是从与管家基因SQ比较后的相对值来看,EgG1Y162在生发层和成虫阶段都有较高水平的表达,在成虫阶段的表达占有绝对优势,说明EgG1Y162抗原在Eg 4个发育阶段的表达有明显差异,这种差异可能与其在不同阶段的功能有关,这为今后对该寄生虫感染的终宿主犬(包虫病主要传染源) 和包虫病患者的免疫学诊断选择最佳重组抗原提供了一定的理论依据。进一步通过分子生物学技术对EgG1Y162抗原进行原核表达，通过Western blot检测，发现6只感染犬血清在44kDa处与EgG1Y162重组蛋白发生特异性反应，形成清晰可见的阳性条带(6/6)，而6只未感染犬血清均为阴性反应(0/6)。这表明本研究获得的EgG1Y162重组蛋白具有高度的特异性和敏感性，EgG1Y162抗原基因在终末宿主犬的细粒棘球绦虫和中间宿主病人的原头蚴中起重要作用，在细粒棘球绦虫与宿主的相互作用中扮演着一个非常重要的角色。研究发现emY162重组抗原可以诱导大鼠产生74.3％的免疫保护作用，同时EMY162重组抗原在泡型包虫病患者血清中阳性率也明显高于em95，推测EgG1Y162重组抗原也可能诱导宿主产生显著的免疫保护作用^{[19, 20]}。本研究证实EgG1Y162重组抗原在细粒棘球绦虫成虫和原头蚴两个发育阶段均有表达，可能对中间宿主和终末宿主都有免疫保护和预防作用。蛋白序列结构分析和Western blot检测结果表明EgG1Y162抗原在终末宿主具有很高的抗原特异性，同时在中间宿主也有一定的抗原性。因此，EgG1Y162重组抗原可以作为一个新的减少人类包虫病感染风险的候选疫苗，为进一步开展中间宿主和终末宿主抗棘球绦虫感染的免疫保护能力实验，为开发研制新的有效疫苗提供了一条新途径，也为防治牧区棘球蚴绦虫感染奠定实验基础。