RNAi(RNA interference)即RNA干扰，是外源或内源的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应基因序列的表达使其沉默的现象。它主要通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的dsRNA，从而诱导内源靶基因mRNA的降解，达到靶基因沉默的目的^[1]。

RNAi技术在研究基因功能方面具有多种特点，如高效性^[2]、特异性、可传播性^[3]等。它在昆虫中的应用比较多，最早用于黑腹果蝇基因功能的研究，在果蝇中鉴定了与信号转导途径、胚胎发育以及其他与生命过程相关的基因功能^[4]。Beye等^[5]利用RNAi技术首次在调控靶基因表达方面开展应用，成功阻断了目的基因在胚胎中的表达。随后研究者利用RNA干扰技术成功抑制了蜜蜂卵黄蛋白基因的表达^[6]，降低了蜜蜂咽下腺淀粉酶的活性^[7]，沉默csp5基因，发现csp5是蜜蜂的一个外胚层基因^[8]等。另外，RNAi技术在蜜蜂抵抗病毒病传播方面也得到应用，Beeolofics公司利用RNAi技术研发了一系列用于蜜蜂健康方面的产品，其中Remebee^®产品可有效地阻止以色列急性麻痹病病毒(IAPV)，且特异性好，无毒，对所有的蜜蜂病毒都有潜在的适用性^[9]。

10-羟基-2癸烯酸(10-Hydroxy-2-Decenoic acid，简称10-HDA)，是由蜜蜂上颚腺分泌的，是蜂王浆的主要生物活性物质，也是评价蜂王浆质量的主要标准，具有抗癌、抗衰老、治疗急性辐射损伤^[10]等生理功能，广泛应用于医药和保健产品中。10-HDA在市场中的社会需求量很大，但在蜂王浆中的含量并不高，一般占1.4%~2.0%左右^[11]，因此探寻一种提高10-HDA产量的方法，以期实现10-HDA的工业化生产成为研究者关注的焦点。3-酮酯酰CoA硫解酶(3-ketoacyl-CoA thioase，KAT)是前期我们利用蛋白质组学的方法从蜜蜂头部上颚腺中鉴定出来的差异蛋白，它具有多种功能，主要催化脂肪酸β-氧化循环中的硫解反应，影响脂质的合成、降解以及能量的产生^{[12, 13]}，因此，可初步判断KAT可能在10-HDA的生物合成途径中起着重要的作用，但其具体的影响过程尚不清楚。目前，KAT基因在拟南芥^{[14, 15]}、南瓜^[16]、番茄等植物中得到了克隆，同时在一些半翅目昆虫^[17]中的表达也得到了初步研究。但是，KAT基因在蜜蜂体内的的研究尚未有相关报道。

本研究选择当地已驯化的意大利蜜蜂为材料，首次在蜜蜂体外设计KAT基因的特异性引物，以PCR扩增的目的片段为模板合成dsRNA，采用注射的方式将其注射到蜜蜂体内进行RNA干扰，探讨dsRNA对靶基因的沉默效果以及对蜜蜂合成10-HDA的影响。

当地驯化后的意大利蜜蜂(Apismellifera ligustica)。

TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，购自北京艾德莱生物科技有限公司；2×Taq PCR MasterMix，购自北京艾德莱生物科技有限公司；UNIQ柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，购自生工生物工程股份有限公司；水饱和酚、Tris饱和酚购自Solarbio公司；无水乙醇，购自青岛四方区化学试剂厂；盐酸，购自天津大茂化学试剂厂；甲醇，购自天津四友精细化学品有限公司；10-HDA标准品(纯度≥98%)，购自damas-beta；T7 RiboMAX^TM Express RNAi System，购自Promega公司。

PCR仪购自Applied Biosystems，高速冷冻离心机购自Eppendorf公司，LC-1200高效液相色谱仪购自美国Agilent公司，10μl注射器购自HAMILON公司，ChampGel5500凝胶成像系统购自北京赛智创业科技有限公司，超微量分光光度计购自IMPLEN公司。

选择群蜂势力相当的蜂箱，随机挑选200只刚羽化的蜜蜂，在其背部用不同颜色的荧光笔做好标记作为0日龄，放回原蜂箱。5天后分别采集相应颜色的标记蜂，并在其体内注射dsKAT和DEPC水，重新放回蜂箱，采集RNA干扰3天、5天、7天的注射蜂。对注射蜂的表征变化跟踪观察。

利用T7 RiboMAX^TM Express RNAi System试剂盒制备dsRNA，将得到的dsRNA产物通过酚-氯仿抽提法进行纯化，然后使用超微量分光光度计检测其浓度，并取适量经1%的琼脂糖凝胶电泳检测其长度，后冻于－80℃的冰箱中保存备用。

利用灭菌后的微型注射器在注射蜂腹部第三关节处注射等体积的dsKAT和DEPC水，注射3、5、7天后，分别比较注射剂量为1μl、2μl、3μl、4μl时蜜蜂的成活率，根据成活率选择最佳的注射剂量。其中双链RNA的浓度为2μg/μl，每次注射结束后，观察注射蜂2min再放回原蜂箱，并对其跟踪观察。

根据已知的KAT(GI：571554458)、actin(GI：297591984) 的基因序列分别设计特异性引物，扩增目的片段的长度分别为506bp、182bp。引物序列分别为：KAT-F：5′-AGGAGGAGTAGAAAACATGAG-3′；KAT-R：5′-CAACACTATATCCCACCAAAC-3′；actin-F:5′-CACTCCTGCTATGTATGTCGC-3′；actin-R:5′-GGTAGTCAGTCAAATCACGGC-3′。

KAT和actin基因半定量RT-PCR的反应条件中，循环数分别为28、27个，actin基因的退火温度为56℃ ，其余条件同1.2.2 。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并通过Quantity One软件对灰度值进行分析，计算目的基因与actin基因PCR产物的灰度值比值，从而确定靶基因的mRNA表达情况。

分别配制浓度为0.8、4、40、160、280、400 μg/ml 的10-HDA标准溶液，利用高效液相色谱法^[18]，测定其浓度，绘制标准曲线，并计算样品溶液10-HDA的含量，色谱检测所用波长为212 nm；流动相由甲醇、0.01 mol/L 盐酸、超纯水按体积比55∶10∶35组成；流速为1.0 ml/min；进样量10 μl；柱温为25℃。

将解剖得到的工蜂上颚腺用灭菌的蒸馏水清洗2~3次，浸泡于盛有2.5%的戊二醛固定液的平板中，4℃，2~3h。将固定好的样品用蒸馏水清洗3次，每次5~10min，然后依次置于浓度为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精中脱水置换，时间一般为10~15min。放到冷冻干燥箱中进行干燥，最后分别在200 μm 600×的扫描电子显微镜下观察。

以蜜蜂的cDNA为模板，利用KAT基因的上下游引物进行PCR扩增得到约为500bp的目的片段(图 1)，长度与预期片段大小相符。对该克隆测序并经NCBI分析，确定与KAT基因的目的片段区域序列一致。表明目的基因克隆成功，此后可按照此体系进行大批量扩增目的基因用于合成dsRNA。

图 1 PCR产物电泳分析 Fig. 1 Electrophoretic analysis of PCR products 1~2: PCR products of KAT gene; M: DNA marker

图选项

以PCR扩增产物为模板，按照T7 RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)的操作步骤合成dsRNA。并用1%的琼脂糖凝胶电泳对其片段大小进行检测(图 2)，得到约为500bp大小的目的片段，与预期值相符。纯化后经超微量分光光度计测定其浓度，浓度为2.11μg/μl。

图 2 dsRNA的制备 Fig. 2 Preparation of Double-stranded RNA 1: The double-stranded RNA of KAT gene; M: DNA marker

图选项

在蜜蜂体内分别注射体积为1、2、3、4μl，浓度为2μg/μl的dsKAT，比较相应注射时间段内蜜蜂的成活率。结果表明，注射剂量影响蜜蜂的成活率，当注射剂量为2μl，注射时间为3天时，蜜蜂的成活率最高(图 3)，高达75%。随着注射剂量的增加，蜜蜂的成活率下降。综合考虑自然条件对蜜蜂的影响、RNA干扰效果和蜜蜂对外界物质的承受力，最终选择注射剂量为2μl。

图 3 注射dsRNA的时间和剂量对蜜蜂成活率的影响 Fig. 3 Effects of time and dose of injecting dsRNA on the survival rate of bees

图选项

在蜜蜂体内注射dsKAT进行RNA干扰，并以注射DEPC水的蜜蜂为对照组，5天之后采集相应日龄段的注射蜂，提取总RNA，进行半定量RT-PCR，检测KAT基因的沉默情况，分析dsKAT对蜜蜂头部KAT基因表达的影响，结果如图 4。

在蜜蜂的腹部注射dsKAT后，与空白对照组相比，KAT基因的表达量均下降，说明dsKAT在蜜蜂体内成功地进行了RNA干扰。另外，双链RNA注射的时间不同，目的基因的表达量也不同，其中注射dsRNA 5天后，目的基因的mRNA表达量下降效果显著(P＜0.05)，说明注射双链RNA的时间影响基因沉默效果，且注射5天能较满意地抑制目的基因的表达。

图 4 RNA干扰检测KAT基因的表达 Fig. 4 Detection of KAT mRNA expression by RNAi

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KAT基因可能参与蜜蜂10-HDA的合成途径，而蜜蜂头部是合成10-HDA的主要部位，因此分别检测RNA干扰3天、5天和7天后，蜜蜂头部10-HDA合成量的变化，可初步推测KAT基因与工蜂合成10-HDA的关系。由图 5可知，与空白组相对比，在蜜蜂体内注射dsKAT 5天后，相应日龄段蜜蜂头部10-HDA的分泌量下降效果显著(P＜0.05)，每只工蜂10-HDA合成量降低18.43%。而RNA干扰3天和7天后，其合成量分别降低3.09%、14.1%。结果表明，沉默KAT基因能降低蜜蜂头部10-HDA的合成量，且KAT基因的表达量越少，10-HDA的分泌量越低，可初步推测KAT基因可能参与蜜蜂体内10-HDA的合成途径。

图 5 RNAi对蜜蜂合成10-HDA的影响 Fig. 5 Effect of RNAi on bees synthesizing 10-HDA

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工蜂上颚腺的形态与其功能密切相关，在蜜蜂体内注射KAT基因的双链RNA，比较RNA干扰前后蜜蜂上颚腺的形态的变化，进一步分析靶基因对蜜蜂上颚腺合成10-HDA的影响。如图 6所示，以注射DEPC水后蜜蜂上颚腺的形态为对照组，其上颚腺表面分布许多葡萄串状的小腺体，排列紧密，体积较大，相对饱满。而注射dsKAT之后，小腺体变得干瘪，疏松。由此可以推测出沉默KAT基因能干扰蜜蜂上颚腺10-HDA的合成过程，降低10-HDA的产量。

图 6 KAT基因的dsRNA对蜜蜂上颚腺形态的影响 Fig. 6 Effects of the knockdown of KAT on the mandibular gland morphology of the bees (a) The Mandibular gland morphology was observed with scanning electron microscope under the conditions of 200 μm 600 × after injecting DEPC water (b) The mandibular gland morphology was observed under the same conditions by RNAi

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RNAi技术是研究基因功能的新手段，目前在蜂学研究方面，该技术主要应用于调控靶基因表达、研究蜜蜂级型分化现象、防止蜜蜂病毒病等领域^[19]。本实验在蜜蜂体外成功合成KAT的双链RNA，并采用体外注射的方法，在蜜蜂体内注射dsKAT，成功阻断了KAT基因的表达。实际操作中发现，在蜜蜂体内注射体积为2μl，浓度为2μg/μl的dsKAT时，蜜蜂的成活率最高，且RNA干扰5天后，靶基因的沉默效果最佳。

另外，在10-HDA的生物合成途径中，存在多种酶的催化作用。本实验在蜜蜂体内沉默KAT基因，分析基因沉默前后蜜蜂头部10-HDA产量的变化和对其上颚腺的形态的影响，结果发现阻断靶基因的表达能使蜜蜂10-HDA的分泌量降低，且上颚腺表面的小腺体由原来的饱满、紧致变得干瘪、疏松。由此可初步判断KAT基因参与蜜蜂10-HDA的合成途径，这为完善10-HDA的生物合成途径奠定了基础，为通过影响基因表达来提高10-HDA产量提供了依据，但具体的分子调控过程尚需作进一步的研究。