2002年底到2003年，一种严重的急性呼吸综合征肆虐全球，导致全球33个国家和地区的至少8 000人发病，高达近千人死亡^[1]。WHO将这种疾病命名为严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS)，它是由SARS冠状病毒(SARS-CoV)引起的，SARS冠状病毒是一种全新的冠状病毒，为单股正链RNA病毒，是目前报道的RNA病毒中基因组最大的病毒^[2]。从2012年夏天开始，另一新型冠状病毒出现并引起严重的中东呼吸综合征(MERS)，表明冠状病毒已经对人类健康构成了持续的重大威胁^[3]。SARS冠状病毒虽然随着“非典”的过去淡出人们的视野，然而由于自然界野生动物群体中还广泛存在SARS冠状病毒，SARS再次爆发的危险依然存在^[4]。因此，阐明并利用它们的复制机制，甄选潜在的药物靶点，筛选、设计与储备抗SARS的有效药物依然是一个严峻的课题^[5]。SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS-CoV M^pro)作为SARS病毒的主要蛋白水解酶，能够将SARS-CoV复制酶多聚蛋白切割成病毒复制所必需的功能蛋白，在病毒生命周期中发挥重要作用，因此该酶是抗SARS病毒药物的一个理想靶点^{[6, 7]}。

SARS冠状病毒主蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，蛋白共有306个氨基酸残基，分子量大小为33kDa左右。其活性形式为二聚体结构，催化活性中心是由145位的半胱氨酸(Cys145)和41位的组氨酸(His41)形成催化二价体^[8]。由于冠状病毒主蛋白酶与小核糖体病毒的3C蛋白酶存在一定相似性，因此也被称为3C样蛋白酶(3C-like proteinase，3CL pro)^[9]。

到目前为止，依然没有针对SARS的特效药，为了应对SARS再次爆发的可能，有效的抗SARS疫苗或药物是迫切需要的^[10]。因此关于SARS-CoV M^pro 抑制剂的研究从未停止过，主要从三个方面进行：基于SARS-CoV M^pro结构的化合物虚拟筛选，化合物(包括小分子片段)及其衍生物的筛选以及天然化合物库的筛选。德国Lubeck大学生物化学研究所^[11]根据SARS冠状病毒主蛋白酶的三级结构，得到其底物类似物Cbz-VNSTLQ-CMK(Cbz：苄氧羰基，CMK：氯甲基酮)，这种抑制剂可以结合到SARS-CoV M^pro的特定区域，阻止酶发挥作用。Pillaiyar等^[12]设计并合成了针对SARS冠状病毒主蛋白酶的低分子肽抑制剂，其中26m和26n表现出较好的抑制活性，其Ki值分别为0.39μmol/L和0.33μmol/L，能够促进强效肽抑制剂的进一步发展。Wu等^[13]从1 000多种化合物中筛选出的一种HIV蛋白酶抑制剂显示出了一定的M^pro抑制活性(Ki=0.6μmol/L)，模型研究显示这个化合物可以特异地与蛋白酶的活性位点结合。Bacha等^[14]报道了一类双活性芳基硼酸化合物可以与M^pro的活性位点附近的丝氨酸残基簇(Ser139，Ser144，Ser147)结合，从而可逆地抑制M^pro的活性。Jon等^[15]对NIH分子库进行了高通量筛选，发现了对SARS冠状病毒主蛋白酶具有较好抑制作用的化合物ML188，它是第一类真正的中等分子量的非共价SARS-CoV M^pro抑制剂，并具有IC₅₀小于2 μmol/L的良好的抑制效果，对于通过非共价机制对SARS-CoV M^pro抑制剂的设计和完善，ML188是一个很好的起点。Young等^[16]从东北雷公藤中分离出4种化合物，发现iguestrin的抑制效果最好，其IC₅₀值为2.6μmol/L。因此，本文以SARS冠状病毒主蛋白酶为靶点，对我单位收集、设计、储藏的蛋白酶抑制剂聚焦库进行体外药物筛选，以期发现SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂，并着重从酶动力学的角度探讨抑制剂与SARS-CoV M^pro的作用模式。

携带SARS-M^pro(NP_828863.1)核酸编码片段的pGEX-6p-1-SARS-M^pro重组质粒由清华大学饶子和课题组提供。氯化钠、甘油、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)均购自上海生工生物工程有限公司，Ni²⁺离子金属螯合层析柱购自Novagen公司，二甲基亚砜(DMSO)购自天津市化学试剂六厂，其余试剂均为国产分析纯。

JN-300 低温超高压连续流细胞破碎仪购自广州聚能生物技术有限公司，AKTA FPLC 蛋白自动纯化系统购自GE Healthcare公司，Fluoroskan Ascent FL荧光分析仪购自Thermo Labsysterms公司，其余均为国产常规设备。

将pGEX-6p-1-SARS-M^pro重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。挑取单克隆接种于5ml含氨苄(100μg/ml)的LB培养基中，37 ℃过夜培养，转接至800ml含氨苄(100μg/ml)LB培养基的摇瓶中，37 ℃培养至OD₆₀₀=0.6~1.0。加入终浓度为0.5mmol/L 的IPTG，16 ℃诱导表达16~20h。4℃，5 500r/min离心培养液收集菌体，用裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，500mmol/L NaCl，10% 甘油)重悬后由低温超高压细胞破碎仪裂解。12 000r/min高速离心裂解液，将上清液进行镍离子金属螯合层析，以Washing Buffer(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，500mmol/L NaCl，10% 甘油，15mmol/L 咪唑)除去杂蛋白，以Elution Buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，500 mmol/L NaCl，10% 甘油，200 mmol/L 咪唑)洗脱目的蛋白。将洗脱的目的蛋白溶液进行Resource Q阴离子交换层析分离。通过SDS-PAGE检测蛋白纯度后将其分装并于－80℃保存。

以SARS冠状病毒主蛋白酶为靶点的药物筛选原理：根据SARS冠状病毒主蛋白酶可以识别的天然底物，合成多肽序列AVLQSGFRKK，在多肽的两端分别加上MCA荧光基团和Dnp荧光淬灭基团。SARS冠状病毒主蛋白酶在P1位谷氨酰胺残基(Q)和P1′位丝氨酸残基(S)之间进行序列切割后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团在320nm激发光下可以产生405nm的发射光；如酶活性被候选药物抑制，序列无法被切割，淬灭基团对荧光基团有抑制作用，不会产生405nm的发射光(图 1)。通过荧光分析仪检测体系中荧光强度的变化，可以反映化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。SARS冠状病毒主蛋白酶体外筛选模型各组分如表 1所示。

图 1 以SARS冠状病毒主蛋白酶为靶点的药物筛选原理 Fig. 1 Drug screening principle of SARS coronavirus main proteinase target

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具体方法：在U型检测板中，依次加入97μl蛋白溶液，1μl化合物，震荡孵育30s，然后加入底物，振荡10s，进行荧光检测。同时设定不含化合物(以95% DMSO取代)的孔为阴性对照。反应在30℃下进行，平行测定3次。阴性对照组酶反应初速率为V₀，实验组为V_i，V_i/V₀表示加入化合物后酶的剩余活性，化合物对蛋白酶的抑制率(抑制活性)Ir＝1－V_i/V₀。为了排除假阳性的干扰，对于抑制率>80%的药物进行荧光淬灭(fluorescence quenching)的检测。首先在体系中加入蛋白和底物让体系的荧光值达到最大值Q₁，然后向体系中加入化合物后测定荧光值为Q₂，通过公式(Q₁－Q₂)/Q₁计算得到淬灭率Qr。选择抑制率>80%，淬灭率<20%的化合物，为阳性结果。将阳性化合物进行梯度稀释，测定不同浓度下化合物对蛋白酶的抑制率，用GraphPad Prism 5软件进行分析得出化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)。

按照1.2.2 的酶活检测体系，分析在不同浓度抑制剂存在的条件下，酶活性与酶浓度、酶量的关系，区分化合物的可逆与不可逆抑制作用。

通过Lineweaver-Burk双倒数作图，分析在不同浓度抑制剂存在的条件下，动力学参数Km和Vmax的变化，区分可逆抑制剂对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制类型；通过Dixon作图法，计算竞争型抑制剂的抑制常数Ki的值。

按照1.2.2的酶活检测体系，检测不同底物浓度条件下抑制剂的IC₅₀值；比较抑制常数Ki值与IC₅₀值的关系，对抑制剂的抑制类型进行验证。

经Resource Q型阴离子交换层析分离纯化所得蛋白溶液，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳纯度检验。从图 2可以看出目的蛋白的纯度可达95%以上。

图 2 SDS-PAGE 分析结果(a)及Western blot 检测结果(b) Fig. 2 Result of SDS-PAGE analysis (a) and test result of Western blot (b) M: Protein maker; SARS: Purified target protein

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图 3为抑制剂筛选模型，其中横坐标为反应时间，纵坐标表示荧光强度；曲线斜率即为酶促反应速率，其中直线部分(一般认为产物生成量小于总量10%部分)斜率认为是酶促反应初速度；从图 3中我们可发现加入有抑制活性的样品后，酶促反应初速率低于阴性对照，通过计算即可获得抑制率。测定不同底物浓度下酶促反应的初速率，用GraphPad Prism 5软件进行分析得出米氏常数Km值为34.62μmol/L，最大反应速率Vmax为298.2μmol/L·s(图 4)。

图 3 抑制剂筛选模型 Fig. 3 The model of screening inhibitors

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图 4 SARS冠状病毒主蛋白酶的动力学参数Km值和Vmax值 Fig. 4 SARS-CoV Mpro kinetic parameter Km and Vmax

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按照1.2.2 的酶活检测体系，对蛋白酶抑制剂库96种化合物进行筛选，其中抑制率大于80%且淬灭率小于20%的化合物共5种，其IC₅₀值分别为0.69±0.05μmol/L、1.19±0.41μmol/L、0.14±0.01μmol/L、1.36±0.07μmol/L、0.36±0.03μmol/L。高通量筛选结果如表 2所示，不同化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性的量效关系如图 5所示。

图 5 不同化合物的量效关系图 Fig. 5 Dose-effect relationship of different compounds (a) P-1-08 (b) P-1-19 (c) P-2-24 (d) P-2-28 (e) P-2-54

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由图 6(a)、6(b)、6(c)、6(e)可知在有抑制剂存在的测活体系中，SARS主蛋白酶的酶活性(反应初速率)与加入酶量的关系为一组平行的直线，随着抑制剂浓度的增加，酶反应速率下降，曲线的斜率不受影响，横坐标截距增大，说明P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-54这4种化合物在酶促反应初期对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制属于不可逆抑制。这4种抑制剂能够与酶分子某些必需基团以牢固的共价键结合，使酶永久失活减少有效酶量。图 6(d)中均为通过原点的直线，随着抑制剂浓度的增加，直线的斜率减小，酶促反应速率下降，酶活逐步降低，化合物P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制属于可逆抑制。抑制剂与酶以非共价键的方式结合而引起酶活降低，但并不导致酶分子结构永久改变。

图 6 在不同浓度抑制剂下酶活力和酶量的关系 Fig. 6 Relationship of enzyme activity and the amount of enzyme at different inhibitors concentrations (a) P-1-08 (b) P-1-19 (c) P-2-24 (d) P-2-28 (e) P-2-54

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根据抑制剂、底物和酶三者的相互关系，可逆抑制又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制4种类型，可通过Lineweaver-Burk双倒数作图法进行判断^[17]。由图 7的Lineweaver-Burk曲线可以看出，在添加不同浓度的P-2-28时，得到一组相交于Y轴的斜率不同，截距相同的直线，随着P-2-28浓度的增大，Vmax不变，Km值增大，说明化合物P-2-28的抑制类型为竞争性。P-2-28在反应体系中与底物竞争和酶的同一活性中心结合，从而干扰酶与底物的结合，使酶的催化活性降低。

图 7 P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线 Fig. 7 Lineweaver-Burk curve of P-2-28 inhibition for SARS-CoV Mpro

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竞争性抑制的抑制常数Ki可以通过Dixon作图法求得，在不同的底物浓度下以抑制剂的浓度为横坐标，酶活反应速率的倒数为纵坐标作图。两条直线交点的横坐标即为-Ki^[18]，结果如图 8所示。根据图中两条直线的交点，由横坐标得出抑制剂P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶的竞争性抑制常数Ki为0.81μmol/L。

图 8 P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制作用的Dixon图 Fig. 8 Dixon curve of P-2-28 inhibition for SARS-CoV Mpro

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由Cheng-Prusoff 公式可知，竞争性抑制剂的IC₅₀与Ki的关系，如公式(1)所示^[19]。

结合图 4和图 9计算不同底物浓度的IC₅₀值与Ki的关系符合公式(1)，IC₅₀随底物浓度升高而增加，验证了化合物P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制类型为竞争型。

图 9 不同底物浓度下P-2-28的IC50值 Fig. 9 IC50 value of P-2-28 under different substrate concentrations

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(1)通过对SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS-CoV M^pro)的异源表达与纯化，获得了纯度较高的SARS冠状病毒主蛋白酶，然后以其为靶点，利用基于荧光共振能量转移(FRET)技术的体外药物筛选模型，对蛋白酶抑制剂库96种待测化合物进行了筛选，获得抑制率大于80%、淬灭率小于20%的化合物5种，分别为P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-28、P-2-54。其半数有效抑制浓度(IC₅₀)分别为：0.69±0.05μmol/L、1.19±0.41μmol/L、0.14±0.01μmol/L、1.36±0.07μmol/L、0.36±0.03μmol/L。

(2)从动力学的角度探讨筛选出来的5种化合物对SARS-CoV M^pro的抑制作用。其中P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-54这4种化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制作用为不可逆抑制。P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制作用为可逆抑制，根据Lineweaver-Burk图和Dixon图的研究，发现它对SARS冠状病毒主蛋白酶呈竞争性抑制，抑制常数Ki为0.81μmol/L。通过对底物浓度，IC₅₀值及Ki值关系的研究，验证了P-2-28的抑制作用为竞争性抑制。该抑制剂的发现为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的研究打下基础，为抗SARS病毒药物开发提供了先导化合物。