文章信息
- 吕珊珊, 侯运华, 闫孟节, 钟耀华
- LV Shan-shan, HOU Yun-hua, YAN Meng-jie, ZHONG Yao-hua
- 工业真菌高效产酶突变技术与高产机制
- Recent Progress in Mutagenesis Strategies and High-yielding Mechanism for Enzyme Production in Industrial Fungi
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(3): 111-119
- China Biotechnology, 2016, 36(3): 111-119
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160316
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文章历史
- 收稿日期: 2015-10-08
- 修回日期: 2015-11-19
2. 山东大学生命科学学院 微生物技术国家重点实验室 济南 250100
2. State Key Laboratory of Microbial Technology, School of Life Sciences, Shandong University, Jinan 250100, China
工业真菌是一类在工业生产上具有重要应用价值的真核微生物,尤其在酶制剂方面占据核心地位[1]。酶在工业上主要用于食品加工、纺织、制革、洗涤剂及生物质资源转化等[2]。常用的工业真菌主要是丝状真菌,包括木霉、曲霉、青霉、毛霉、根霉等,以及单细胞的酵母菌[3]。近几年由于对酶制剂,尤其是生物质转化用酶,如纤维素酶、半纤维素酶等需求的急剧增加,工业上对真菌的种类和性能提出了更高的要求。而工业真菌的源头菌株是自然条件下筛选出来的真菌,它们往往不能满足工业的需要,所以其性能的提高,尤其是产酶能力的提升,需要靠诱变育种技术进行改良。传统的诱变方法包括常规的物化诱变技术、原生质体融合技术等[4, 5],随着现代生物技术的不断发展,又出现了基因工程技术、基因组改组技术及最近发展起来的分子标签插入突变技术等,已成功用于工业真菌的育种改良[6, 7, 8]。而突变株高产机制的探索一直是该领域研究的热点,尤其是近几年后基因组学技术在阐明高产机制方面取得了显著进展,这为菌种的进一步理性改良提供了重要依据。本文系统综述了工业真菌在产酶的应用、突变育种策略进展,并以产纤维素酶真菌为主要例子总结了高产机制分析方法,尤其是近年来后基因组学时代的组学技术在分析突变机制上的应用。
1 产酶工业真菌及其应用真菌通常利用工业发酵来大规模生产各种各样的酶制剂,这些酶类主要包括纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、漆酶/木素酶、植酸酶、蛋白酶、酯酶和葡糖氧化酶等[2](表 1),表现的市场价值超过了5亿美元[9]。
纤维素酶是外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的统称,主要应用于纺织、生物冶炼、食品行业等。能够产生这些酶类的真菌非常广泛,包括子囊菌,如里氏木霉(Trichoderma reesei)、草酸青霉(Penicillium oxalicum);担子菌中的白腐真菌如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)和褐腐菌[如癞拟层孔(Fomitopsis palustris)];还有一些在反刍动物的肠胃道里降解纤维素的厌氧菌,如根囊鞭菌属(Orpinomyces sp.)[10]。但是能够在工业上生产纤维素酶的真菌主要有里氏木霉、草酸青霉和曲霉属等[11]。例如,里氏木霉纤维素酶高产菌株RUT-C30能产20g/L以上的胞外蛋白,其中90%是纤维素酶[4]。另外,嗜热真菌纤维素酶也是很有前途的酶,其有效值范围在为pH4.0~7.0,有效温度也高达50~80℃,与其它真菌产生的纤维素酶相比,显示了卓越的热稳定性,可以最佳化工业过程,如生物量降解和生物燃料制作等[12]。
淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、异淀粉酶和葡糖淀粉酶,用于食品、药物、纺织、洗涤剂等。淀粉酶应用广泛,占据了酶类领域的30%[13]。例如,大量助消化药物含有淀粉酶,洗涤剂也包含淀粉酶用来除去污渍。生产淀粉酶的真菌主要是曲霉属和青霉属。最近利用深层发酵技术瘿青霉能够生产α-淀粉酶,利用固态发酵扩展青霉MT-1能够生产淀粉酶[14]。用来工业性生产淀粉酶的真菌主要是曲霉属,包括米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(A. niger)和泡盛曲霉(A. awamori)[15]。
Enzyme | Catalytic site | Strain | Application | |
Cellulolytic enzymes | 纤维素酶 | 纤维素分子内部的β-1,4-糖苷键 | 木霉属、曲霉属、腐质霉属、青霉属 | 纺织、纤维素降解、生物乙醇、食品行业 |
葡聚糖酶 | β-葡聚糖的1,3及1,4-糖苷键 | 毛壳属、曲霉属、腐质霉属、青霉属 | 制糖、酿造和果汁澄清 | |
半纤维素酶 | 木糖分子间的β-1,4-糖苷键 | 曲霉属 | 纤维素降解,食品行业 | |
木聚糖酶 | 木聚糖分子内的β-1,4-糖苷键 | 曲霉属、青霉属、木霉属、腐质霉属 | 降解木聚糖,如酿造行业 | |
漆酶/木素酶 | 醚键、碳-碳键 | 多孔菌属、梭孢壳属、栓菌属 | 木质素降解,用于酿造和饮料工业 | |
Amylose hydrolases | α-淀粉酶 | 淀粉链的α-1,4-糖苷键 | 曲霉属 | 制糖、纺织品退浆、发酵原料处理和食品加工 |
β-淀粉酶 | 从非还原性末端依次切开淀粉链相隔的α-1,4-键 | 曲霉属、根霉属 | 制糖、乙醇品退浆、发酵原料处理和食品加工 | |
葡糖淀粉酶 | α-1,4-糖苷键 | 曲霉属 | 制糖、酒精生产、发酵原料处理 | |
葡糖氧化酶 | 葡萄糖醛基 | 曲霉属、青霉属 | 除去葡萄糖,与过氧化氢酶协同作用把葡萄糖生成葡萄糖酸 | |
葡糖基转移酶 | 葡萄糖的糖苷键 | 曲霉属 | 生产低卡路里聚糖 | |
Proteolytic enzymes | 蛋白酶 | 蛋白质肽键 | 曲霉属、丛赤科属、青霉属、毛霉属、根霉属 | 洗涤剂、食品、皮革行业 |
氨肽酶 | 从多肽链的N端逐个水解 | 曲霉属、根霉属 | 蛋白水解:增加香味、脱苦 | |
羧肽酶 | 从多肽链的C端逐个水解 | 曲霉属 | 蛋白水解:增加香味、脱苦 | |
氨基酰化酶 | 催化氨基的酰化反应 | 曲霉属 | 合成L-氨基酸 | |
天冬酰胺酶 | 水解天冬酰胺 | 曲霉属 | 降低丙烯酰胺的形成,用于烘烤行业 | |
转谷氨酰胺酶 | 催化转酰基反应 | 轮值链霉菌 | 肉类和奶酪加工 | |
Lipid hydrolases | 脂肪酶 | 酯键 | 曲霉属、青霉属、毛霉属、根霉属 | 食品、药品、皮革、日用化工 |
磷酸酶 | 磷酸酯键 | 曲霉属 | 脱磷酸作用,如豆类加工和烘烤 | |
植酸酶 | 磷酸酯键 | 曲霉属 | 脱磷酸作用,如豆类加工和烘烤 | |
Other enzymes | 磷酸二酯酶 | 水解环磷酸腺苷 | 孢属、青霉属 | 用于鲜味增强剂 |
果胶酶 | D-聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键 | 曲霉属、青霉素、根霉属、木霉属 | 在食品和酿造行业进行果胶的降解与修饰 | |
果胶甲酯酶 | 果胶脱甲基 | 曲霉属、木霉属、青霉素、根霉属 | 在食品和酿造行业进行果胶的降解与修饰 | |
过氧化氢酶 | 催化过氧化氢分解 | 曲霉属 | 除去过氧化氢,增加食品保藏 | |
菊粉酶 | β-2,1-D-果聚糖果糖苷键 | 曲霉属 | 生产果糖和低聚糖,可以被用作益生元 |
蛋白酶在清洗剂、食品、皮革和制药行业有着广泛应用。它们主要的生产者是真菌,比细菌酶种类更丰富。例如,米曲霉生产酸性、中性和碱性蛋白酶,并且具有广泛的底物专一性。另外,毛霉菌中有两个与接合菌很相近的物种为微小毛霉(Mucor pusillus)和米黑毛霉(M. miehei),这两种霉分泌一种天冬氨酸蛋白酶,称为毛霉凝乳酶。这个酶具有较高的牛奶结块能力和较低的蛋白质水解活性,在干酪制作工业被用作牛凝乳酶的替代物[16]。
另外,丝状真菌分泌的多种多样水解酶还可以用来降解废弃有机材料。它们的作用范围主要是降解蛋白质和植物衍生多糖,包括纤维素、半纤维素、果胶、淀粉。其他主要碳聚合物木质素不受水解酶降解的影响,但是会被一些真菌产生的氧化酶类消化[17]。在N端有纤维素结合领域的真菌蛋白称为膨胀素(swollenin),这种蛋白质及其类似物在食品制作方面也有一定应用[18]。很多来自真菌的植物细胞壁降解酶被发现在水果和蔬菜加工中有广泛的应用。例如,木聚糖酶可用来提高面团的质量,并在净化果汁、制备木糖及木糖低聚物上用作食品添加剂。同样地,果胶酶用于澄清果汁,也用来生产果胶单体以作为转化其他产品的原始材料。以上可见,酶制剂在不同的工业领域具有广泛的应用,但自然条件筛选出的真菌往往不能满足生产的需要,所以其工业真菌的不断改良一直受到高度关注。
2 诱变育种在工业真菌中的应用工业生产菌株通常并不是自然条件下直接筛选出来的菌株,这是因为无论在产量上还是质量上它们都不能满足工业的要求,所以为了提高产酶的产量、简化工艺条件、开发新品种,通过诱变方法改善菌种特性是工业上首选的育种策略。目前,国内外酶制剂生产菌株绝大部分是靠诱变育种得到的。诱变育种方法从传统的理化诱变、原生质体融合等不断发展到现代的基因工程技术、基因组改组技术和分子标签的插入突变技术等。
2.1 常规的理化诱变技术常规的理化诱变技术是采用物理或化学诱变方式选育出高活力突变株。许多纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等生产菌就是靠理化诱变技术提高其产酶能力的。在此以纤维素酶生产菌里氏木霉的理化诱变过程这一典型实例进行说明。里氏木霉最初是在第二次世界大战时期从所罗门群岛分离出来的,被命名为QM6a,被发现是纤维素酶的很好生产者。之后,美国陆军Natick实验室Mandels等将野生型里氏木霉QM6a通过直线加速器照射孢子得到一株高纤维素酶生产突变株QM9414[4]。其胞外蛋白和纤维素酶生产水平是QM6a的2~4 倍,但是保留代谢阻遏[19]。此后,高纤维素酶突变株Rut-C30经过了三步程序获得[4, 19](图 1)。首先,里氏木霉QM6a经过紫外线诱变筛选到代谢脱阻遏突变株M7。之后,经过N-亚硝基胍诱变分离到部分代谢脱阻遏菌株NG14,此菌株产生的胞外蛋白、滤纸酶活(filter paper activity,FPA)、β-葡萄糖苷酶活、内切葡聚糖酶活分别为QM9414的2倍、5倍、2倍和2倍。之后又经过一轮紫外线诱变,筛选到高纤维素酶活和代谢脱阻遏菌株Rut-C30,代谢脱阻遏是通过抵制抗代谢物2-脱氧葡萄糖筛选到的。
另外,Qu 等通过诱变草酸青霉114-2筛选获得了碳代谢物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)抑制菌株UV11[20],之后又经过多轮的诱变和筛选产生了突变株JU-A10-T,此菌生产力已达到160IU/(L·h)[11]。
理化诱变技术在其它真菌中也有广泛应用。例如,Li 等[21]用紫外线和γ射线协同诱变黑曲霉D2-26,选育出高温乳糖酶高产突变株,酶活力可达16.27U/ml。郭继平和马莺等[22]用紫外线诱变米曲霉K61得到一株高蛋白酶活力突变株,中性蛋白酶活力可达9 180.98U/g。
常规的理化诱变育种具有操作简便、可用于大规模突变筛选等优点,但是大部分工业真菌已经对传统诱变源具有抗性饱和,要深入挖掘工业真菌的产酶潜能具有一定难度。
2.2 原生质体融合技术原生质体融合技术是指通过人为的方法,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合,借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。Ferenezy 等[23]于1974年首次报道了白地霉 (Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体融合,从此之后原生质体融合技术在丝状真菌中广泛开展。日本外山信男等(H. Toyama)利用原生质体融合技术研究里氏木霉的遗传,选育QM9414等作为亲本,得到的融合子CMCase活性比亲本高出1 倍。Wu 等[5]最近利用递归原生质体融合技术选育异酒香酵母(Brettanomyces anomalus),得到一株β-葡糖苷酶高产菌株F3-25,酶活可以达到4 790U/L,比出发菌株提高了8 倍。另外,原生质体融合技术也可以与原生质体诱变技术结合,它是以原生质体融合为基础,然后采用物理及化学诱变剂处理后,经过再生培养,从而选育出高产突变株的一门技术,已经应用于酶制剂、氨基酸、抗素等的菌种选育中[24]。尽管原生质体融合技术具有不需要了解亲本详细遗传背景,可有目的地选择亲株以选育理想的融合株和便于操作等优点,然而该技术也有其局限性。例如,目前只限于两个菌株之间的融合,融合后染色体的重组是随机的,种属间细胞对异源 DNA的限制作用和染色体 DNA 的非同源性,仍限制着原生质体融合技术的发展。
2.3 基因工程技术基因工程技术作为人工改造的遗传手段,可以快速、定向地改造已有的功能基因或调控因子,获得高产工业真菌。通常真菌中天然的酶系统不能很好的降解底物,需要通过基因工程进一步改良。例如,里氏木霉酶系统经常表现较低的β-葡萄糖苷酶活性,导致纤维二糖在纤维素水解中积累,以至于抑制纤维素酶的生产。这个限制因素可以通过β-葡萄糖苷酶基因同源或异源过表达而克服[25]。Zhang 等[6]过表达了里氏木霉RUT-C30菌株的BG基因,在玉米秸秆为底物时,等蛋白的纤维素酶活比出发菌株的提高了21%~34%。Dashtban 等[26]最近也在里氏木霉QM9414中异源基因表达黑团孢属的BG基因,在微晶纤维素或秸秆培养条件下,等蛋白的纤维素酶活比出发菌株的提高了30%~155%。与此相似,通过增加强启动子过表达曲霉属A. cellulolyticus酶系统β-葡萄糖苷酶,会使其活性显著提高[27]。由此可以看出,基因工程具有理性改良菌株的优势,随着基因学的发展,在此基础上进一步发展起来的代谢工程和系统生物学也已经成功应用到菌种改良中。但其也有一定缺点,在真菌中过表达一些酶会导致其它本源酶类的表达减少[6]。
2.4 基因组改组技术基因组改组技术是先通过经典的诱变育种方法获得初始突变株,然后将若干正突变的突变株作为第一轮原生质体融合的出发菌株,经过递推式的多轮融合,使引起正突变的不同基因重组融合到同一个细胞株中,从而在短时间内获得优良菌株的方法[28]。例如,Zhao 等[7]以灰绿曲霉HGZ-2的紫外诱变菌株为出发菌株,利用基因组改组技术,筛选出一株纤维素酶高产菌株,FPase和CMCNase活力分别达到71U/ml和70U/ml,比出发菌株分别提高了1.95倍和1.72倍。最近,Stephens 等[29]以嗜热真菌DSM 5826的木聚糖酶耐热突变株G41和木聚糖酶耐碱突变株G53为出发菌株,采用基因组改组技术,筛选出耐热和耐碱木聚糖酶突变株S325,产生的木聚糖酶在80℃有85%活性,在pH 10有60%活性。因此基因组改组技术可以快速、高效地筛选出优良菌株,增加遗传多样性,缩短了育种周期,是诱变育种上一个很好的选择。
2.5 分子标签的插入突变技术分子标签的插入突变技术是通过基因插入失活以获得能覆盖整个基因组的突变体库,其包括限制酶介导整合(REMI)技术和农杆菌介导的T-DNA插入突变。与化学突变和放射突变相比,插入突变技术最明显的优势在于突变基因能够通过插入元件进行标记,可以鉴定被破坏的基因或两边的序列[30]。例如,Larsen 等[31]利用REMI技术选择突变β-半乳糖苷酶超分泌的毕赤酵母,获得一株突变体bgs13,其大部分的重组蛋白分泌增强。Yaver 等[30]利用REMI技术诱变脂肪酶生产菌株米曲霉HowB430,选育出的突变株脂肪酶生产能力比出发菌株提高出145%。Zhong 等[8]最近利用T-DNA标签的插入突变技术改良里氏木霉QM9414,筛选的突变子TB-87的纤维素酶总活力比出发菌株高了51%。因此利用分子标签技术获得突变体己成为进行基因克隆和遗传学分析最有效的方法之一。
3 工业真菌高效产酶突变菌株的高产机制分析虽然酶制剂在工业上广泛应用,但其存在的瓶颈是工业真菌蛋白分泌机制的研究。要解决这个问题首先要经过生物学性状分析来区别高效产酶突变株与出发菌株在表型或酶系分泌的不同,为以后分子机制的探索打下良好的基础,然后再通过基因组学、转录组学,蛋白质组学等组学技术,以及不断积累的生化、分子、转录和生理学证明来揭示突变株经过随机诱变到底经历了哪些变化,并且这些变化对菌株的改良起了哪些作用。另外,高产突变机制为更好的菌种改造奠定了基础。
3.1 生物学性状分析生物学性状主要包括表型观察和菌株产酶能力分析。其中表型观察又包括对突变体生长速率测定、产孢能力测定、菌落菌丝形态观察等。高产突变株往往伴随孢子、菌丝形态等的变化。例如,里氏木霉突变株Rut-C30孢子是浅绿色,在琼脂平板上生长的菌体底部颜色缺乏黄色,而野生型菌株QM6a孢子是绿色,在琼脂平板上生长的菌体底部颜色为黄色[4]。此外,草酸青霉野生型114-2产生的孢子是深绿色,而突变株JU-A10-T产生的孢子非常少并且是粉红色[27]。本实验室通过紫外诱变里氏木霉Rut-C30,最近选育出一株高产突变株孢子是纯白色,还选育出一株纤维素酶高产菌株CU7-14(专利号:201510484372.0),产孢量明显降低,并且孢子颜色变浅。突变株表型的变化分析有助于理解其功能变化的机制。
产酶能力是衡量突变株性能的一个重要指标,也是工业真菌高效产酶诱变育种的主要目的。例如,草酸青霉突变株JU-A10-T,在纤维素-麦麸培养基中产生的纤维素酶活、木聚糖酶和总蛋白质分别比野生菌株114-2提高了9倍、8倍和4倍[27]。另外,本实验诱变育种获得的纤维素酶高产突变株CU7-4,摇瓶培养条件下最高滤纸酶活、纤维素内切酶酶活和β-葡萄糖苷酶酶活分别为8.28IU/ml、158.44IU/ml和16.18IU/ml,分别是出发菌株的3.43倍、4.10倍和6.97倍。最近,郭承义等[32]利用紫外诱变获得的米曲霉突变菌株Y3在麸皮培养基中产生的酸性蛋白酶活、碱性蛋白酶活、中性蛋白酶活、淀粉酶活分别为986U/g、10 385U/g、9 034U/g和412U/g,分别比出发菌株J2提高了215%、49.7%、59.2%和45.1%。
生物学性状分析为工业真菌分子机制的明确作出了重要指标,但是由于高产突变株诱变育种的随机性,对其高产机制的深入研究造成了一定的困难,这也是长期以来困扰诱变育种研究的难题。随着近年来基因组学和后基因组学技术在真菌领域的应用,高效产酶机制的探索取得了许多新进展。
3.2 基因组分析基因组学分析是在基因组图谱和测序的基础上,对已知基因和基因组结构进行比较,从而了解基因的功能、表达机制和物种进化的策略[33]。最近几年,真菌基因组学测序工作发展迅速,大量的真菌全基因组被陆续测序,因此真菌基因组资源的获得和相关技术的进步为突变株高产机制 的探讨拉开了序幕。例如,最近基因组测序发现里氏木霉突变株Rut-C30的碳代谢物阻遏蛋白Cre1部分基因(CRE1-96)被切除[34],使其失去了原先碳代谢物阻遏作用,并使更多的染色体处于开放的状态,从而促进了产酶活力升高。测序还发现,Rut-C30缺失了一个85kb的基因片段[35],这些缺失基因编码的蛋白质涉及运输蛋白(如麦芽糖通透酶、芳香族氨基酸通透酶等)、胞外酶(如酰亚胺酶、1,6-β-葡聚糖苷酶)及胞外解毒蛋白(如多药外排泵、谷胱甘肽S-转移酶)等。草酸青霉突变株JU-A10-T的基因组分析发现,在碳代谢物阻遏蛋白CreA编码基因的C端有移码突变,且其他突变基因序列富含在转录因子活性区,尤其显著的是,其基因组缺失了3个半纤维素酶编码基因(PDE_08036、PDE_08037和PDE_08038)[27]。最近,Liu等[9]利用比较基因组学手段,对高产淀粉酶的米曲霉菌株与酿酒酵母、黑曲霉进行了系统的比对分析。结果表明,米曲霉的121个蛋白质分泌相关基因与酿酒酵母对应成分超过80%的同源性,另有125个基因与黑曲霉蛋白分泌相关组分具有显著同源性,从而首次全面确立了米曲霉与高产淀粉酶(分泌蛋白)相关的遗传组分。所以通过基因组学分析,可以在高产菌株中发现大量的基因组成差异或基因突变,进而可进一步推测这些变化对其高产机制作出了哪些贡献。
3.3 转录组分析转录组学的分析依赖于完整的基因组序列的可用性,其常用方法有寡核苷酸阵列、cDNA阵列、EST(expressed sequence tag,EST)分析、基因表达的系统分析和差异显示等[33]。转录组学已经广泛应用在很多领域并具有高可靠性和再现性,并能够揭示高产菌株的酶系变化的内在机制。例如,转录组分析发现在草酸青霉出发菌株114-2中34个纤维素酶和半纤维素酶占总转录形式的1.07%,但在突变株JU-A10-T中却增加到9.03%,所以JU-A10-T表现出高纤维素酶活[27]。另外,与野生型菌株114-2相比,JU-A10-T有567个基因明显的上调,其中明显上调的基因主要编码胞外多聚糖水解酶、蛋白折叠相关蛋白等。最近,Liu 等[9]利用cDNA微阵列技术分析米曲霉高产淀粉酶的不同菌株A16、CF1.1、CF32的转录组响应发现,与蛋白分泌有关的基因明显上调,主要包含蛋白质N-糖基化、内质网的转运和折叠、信号肽处理、内质网到高尔基体或高尔基体到内质网逆行的囊泡运输等,这表明在米曲霉高效淀粉酶生产菌株中的UPR (unfolded protein response,UPR) 效应被激活,从而显著提高了蛋白分泌水平。这些转录组的研究成果为深入认识的蛋白质组分析提供了分子基础,为实现菌株改良提供了重要信息。
3.4 蛋白质组分析蛋白质组分析有助于在分子水平上系统理解高效产酶菌株整体事件的发生,其研究方法包括双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel elecrophoresis,2D PAGE)和质谱测定结合,其中质谱测量包括基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法和电子喷雾电离质谱测量法,另外还有同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ) 技术,以及其他研究蛋白质相互作用的方法如双杂交体系等相关技术等[33]。利用2D PAGE和质谱测定结合分析发现,在由乳糖为唯一碳源条件培养下,Rut-C30分泌蛋白质组大部分成分是CBH1,而另一突变株CL847分泌蛋白质组更加的多种多样,有较少的CBH1,更多的是β-葡糖苷酶、甘露聚糖酶和木聚糖相关的酶。另外,用质谱分析为基础的“霰弹枪”蛋白组分析法发现在玉米秸秆上培养的Rut-C30分泌蛋白组大部分也是CBH1,并鉴定出6~10个新的胞外蛋白酶[36]。通过糖组学分析,在里氏木霉Rut-C30分泌的主要纤维素酶CBH1的N端多聚糖处发现携带非正常α-1.3-葡萄糖残基,经研究证实是gls2α基因的突变导致了分泌蛋白反常的糖基化[4]。在工业真菌中,如果目标蛋白过载分泌,细胞可能需要改变它的分泌蛋白质组来适应分泌机制的处理能力。最近利用液相色谱-串联质谱仪分析(liquid chromatograph-mass spectrometer-mass spectrometer,LC-MS/MS)发现,草酸青霉突变株JU-A10-T增加了木质纤维素酶的分泌,但降低了淀粉酶和蛋白酶的分泌[27]。Oda 等[37]利用基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法分析米曲霉在固态培养和深层培养中的胞外蛋白区别,共鉴定了29种。其可分为4类,第一类是在固态培养条件下产生,如葡糖糖化酶B和丙氨酰二肽酶。第二类是在深层培养下产生,如葡糖糖化酶A和木聚糖酶G2。第三类是这两种条件下都产生,如木聚糖酶G1。第四类是在固态培养中能分泌,而在深层培养中却与细胞壁结合的蛋白,如α-淀粉酶和β-葡糖苷酶。对其中的7个基因进行Northern分析,发现在深层培养基中α-淀粉酶和β-葡糖苷酶的分泌被细胞壁上蛋白调控。而在固态培养中葡糖糖化酶A和木聚糖酶G2的分泌是通过转录水平调控的。
结合基因组、转录组数据及完整的分泌蛋白质组成分,我们加深了对工业真菌高效产酶机制的系统理解。最近越来越多的预测分泌蛋白的作用在实验上被确定,丰富的组分部件为工业真菌中更多蛋白分泌途径的机制研究提供了更好的平台,并为挖掘高产潜力和以后菌株改良打下理论基础。
4 工业真菌高产机制在菌种改良上的应用根据菌株性状和功能基因组学的分析,揭示了其转录和分泌途径的变化,从而我们可以靶向提高酶活的关键基因和调控因子,这样就可以用基因工程最低限度的改变遗传内容并获得最高的效果。例如,在脂肪酶生产菌株米曲霉突变株DEBY10.3中发现破坏palB基因有利于脂肪酶的生产,目前的研究还发现,在其它丝状真菌中删除palB基因也会影响异源蛋白的表达[30]。在草酸青霉突变株JU-A10-T中发现的CreA在诱导条件下对纤维素酶表达具有抑制影响,所以△creA菌株表现了比出发菌株高1.7 倍的滤纸酶活和3.4 倍的淀粉酶活[27]。同样里氏木霉中的cre1也有类似的作用,RUT-C30的cre1基因因cre96缺失,导致其表现为代谢脱阻遏并且纤维素酶活提高,所以我们实验室根据其原理,敲掉里氏木霉SN1菌株的cre96部分,结果其在葡萄糖存在下表现为脱阻遏,在碳源抑制条件下可以产生纤维素酶和半纤维素酶(结果待发表)。另外,前期实验结果已经证明,在里氏木霉中,通过破坏转录抑制因子ACE1或CRE1,过表达激活因子XlnR或正调节蛋白LAE1,或人工改造其它转录因子,木质纤维素水解基因的转录水平会明显提高,并使胞外木质纤维素酶产量提高[38, 39, 40]。
5 结论与展望工业真菌在传统的发酵工业和以基因工程为核心的现代生物技术中都扮演着重要的角色。其遗传特性可以通过传统物化诱变技术、原生质体融合技术,以及现代基因工程技术、基因组改组技术和不断创新发展的分子标签插入突变技术等育种策略加以改进。而随着基因组学、转录组学和蛋白质组学等系统生物学技术手段的快速发展,选育出的高效产酶突变株的高产机制也将通过组学技术的发展而逐渐揭晓,并从中找到高效产酶菌株中起重要作用的靶向基因,为以后利用代谢工程、系统生物学甚至合成生物学创造理想的产酶工业菌株打下良好基础。
致谢 本课题组的相关研究工作也受到山东大学基本科研业务费专项资金(2015CJ005)和山东省农业科技成果转化资金项目(2014-45)的资助支持,在此特表感谢。
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