地球上超过80%的生态环境处于常年或周期性低温状态^[1]。在这些低温环境中生存着丰富多样的微生物，这些在低温条件下生长良好的微生物被称为低温微生物，其中最高生长温度高于20℃、最适生长温度高于15℃、在0~5℃可生长繁殖的被称为耐冷菌(psychrotrophic bacteria)^[2]。低温导致物质扩散速率降低、溶质黏度增加、细胞膜流动性降低、细胞内活性氧量增加，以及DNA和RNA二级结构稳定，从而影响细胞的DNA复制、转录和翻译等各种重要的生物学过程^[3]。研究耐低温菌的耐低温机制有利于我们开发这一类丰富的资源，近年来这成为研究热点。

研究者们通过蛋白质组学、转录组学、基因突变等方法对多株耐低温模式菌的低温适应机制进行了研究。结果表明，微生物通过多种方式调整细胞活动来适应低温环境，不同微生物的低温适应机制可能会有差异，但它们有很多通用的适应机制，主要包括：①增加膜脂的不饱和程度来提高细胞膜在低温下的流动性^[4]；②合成RNA分子伴侣以防止RNA在低温下形成不需要的二级结构阻碍蛋白质翻译过程^[5]；③抗自由氧相关酶合成增加，酶的结构柔韧性增加以提高低温下的酶活性等^{[5, 6, 7]}；④产生冷休克蛋白，协助低温下蛋白质折叠或做冷冻保护剂^[8]。

对南极分离的低温菌Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125的蛋白质组学研究结果表明，蛋白质合成是低温生长的限速步骤，该菌株的主要低温诱导蛋白质为参与蛋白质合成和折叠的TF(trigger factor)^[9]。革兰氏阴性菌外膜蛋白在细胞质中合成，需要跨过内膜、周质空间后折叠并整合到外膜上。因此，外膜蛋白的生物合成过程和折叠可能更容易受低温影响，但关于低温微生物外膜蛋白折叠相关研究还很少^{[10, 11, 12, 13]}。

原位研究膜蛋白难度很大，体外折叠技术是研究膜蛋白折叠机制的主要手段^{[12, 13]}。外膜蛋白体外折叠的主要原理为高倍数的稀释变性剂，同时提供合适的亲水疏水的双相介质^[14]。如上文所述，外膜蛋白具有疏水和亲水两相结构，需高浓度的尿素和SDS等作为强变性剂溶解包涵体，并让外膜蛋白处于完全变性的状态。然后用高于临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)值的非离子表面活性剂形成的具有疏水和亲水双相界面的胶束(micelle)或磷脂酸形成的脂质体(liposome)作为折叠介质。经变性的外膜蛋白用折叠溶液稀释后，变性剂浓度大幅度降低，蛋白质在胶束或脂质体中重新折叠形成具有热修饰性的天然结构。

本文选取革兰氏阴性耐低温细菌Shewanella sp.的OmpA同源外膜蛋白Omp74 (GenBank 登录号: BAF64763)作为研究对象，预测了该蛋白质的结构，建立了其体外表达、纯化和在表面活性剂中重折叠的体系，并通过与OmpA对比研究，初步探讨了其C端结构域在Omp74低温折叠中的可能作用。

耐低温菌Shewanella sp. 由本实验室保存；表达质粒pET-21a(+)购自Novagen公司。

表面活性剂十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)、月桂酰基麦芽糖苷(N-dodecyl-β-maltoside，DDM)、十二烷基磺酸钠(SDS)购自Sigma公司，限制性内切核酸酶购自宝生物工程(大连)有限公司，KOD plus购自东洋纺(上海)有限公司，其它试剂购自上海生物工程股份有限公司。

将Omp74蛋白序列上传至外膜蛋白预测服务器PRED-TMBB，选择Posterior Decoding方法进行结构预测^[13]。

用SingalP3.0预测Omp74的信号肽序列，以耐低温菌Shewanella sp.总DNA为模板，设计引物(正向引物 5′-CTAGCTAGCATGGCACAAGAATTAACACCTTG-3′，反向引物 5′-GCGGGATCCTTAACGTAATACTACGCGCTTTTC AG-3′)PCR扩增不包含信号肽序列的Omp74的全基因序列，或Omp74的N端跨膜结构域基因序列(正向引物同上，反向引物为5′-GGAATTCTTACGCATGGCCT TGAACAGATACAGT-3′)。以E. coli基因组DNA为模板，正向引物5′-GGAATTCCATATGGCTCCGAAAGATA ACACCT-3′和反向引物5′-GGAATTCTTAAGCCTGCGGC TGAGT-3′ PCR扩增E. coli的ompA基因。扩增体系为：KOD plus 1μl、10×Buffer 5μl，2mmol/L dNTPs 5μl，25mmol/L MgSO₄ 2μl、正反向引物10pmol/μl、模板DNA 100ng，加ddH₂O至整个体系50μl。 扩增条件：预变性 94℃，2min；变性 94℃，15s；退火温度50℃，30s；延伸温度68℃，1.5min；30个循环。

扩增产物经琼脂糖电泳确认后切胶回收(Omega,Gel Extraction Kit)。omp74的扩增产物用NheI 和BamHI双酶切，ompA的扩增产物用NdeI 和EcoRI双酶切，再次跑琼脂糖电泳切胶回收，与经相同酶双酶切的pET-21a(+)质粒进行连接(Takara,High Ligation V3.0)，转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布添加100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃培养至单菌落长出，菌落PCR筛选阳性质粒，并对选取的阳性质粒进行双向测序，确认PCR扩增过程中没有引入突变位点。构建的Omp74全基因表达质粒命名为pET-21a-omp74，N端结构域表达质粒命名为pET-21a-N-omp74。

采用热击法^[14]将构建的质粒pET-21a-omp74和pET-21a-N-omp74转入E. coli BL21(DE3)，转化子接种至LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀=1.0，然后在 20℃培养1h后，向培养液中添加0.4mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 后继续在20℃培养过夜。4℃、8 000g离心30min收集细胞，用灭菌的0.9% (m/V) NaCl溶液清洗细胞两次，重悬细胞于TED (20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、2mmol/L DTT,pH 8.0) 缓冲液中，超声波破碎细胞后 8 000g 离心30min获得包涵体粗沉淀。

用1% (V/V) Triton X-100重悬包涵体粗沉淀，8 000g离心30min以去除细胞膜碎片等杂质，然后再用TED缓冲液清洗包涵体沉淀两次去除残留的Triton X-100即获得纯化的包涵体。

分别用8mol/L的尿素、1%的强阴离子表面活性剂SDS或1%的Sarkosyl溶解包涵体，4℃、20 000g 离心30min去除不溶物。重折叠时，将溶解后的蛋白质溶液按稀释20倍的比例加入折叠介质溶液中，立即混匀，在实验设定的温度下放置相应的时间，加入SDS-PAGE上样缓冲液终止折叠，经100℃加热或不加热的样品跑SDS-PAGE电泳，根据是否出现热修饰(heat modifiability)现象判断折叠情况^[15]。

在10μl Omp74的重折叠体系中添加蛋白酶K (Sigma) 至终浓度5μg/ml，在18℃ 降解5min或10min后，添加终浓度为10mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)终止反应，降解后的样品用于SDS-PAGE分析。

荧光分光光度计的激发波长设为295nm，狭缝宽度设为5nm，测定了Omp74在310~380nm的荧光吸收谱，并以添加折叠介质的TED缓冲液在该波段范围的荧光吸收谱作为背景值。

测定了Omp74远紫外圆二色谱图 (circular dichroism,CD)，测定波长为在200~250nm，测定温度为18℃，测定用比色皿光学通路厚度为1mm，以添加折叠介质的TED缓冲液作为空白对照。

革兰氏阴性菌的外膜蛋白几乎都有由8~24个β-片层(β-sheet)围成的内部亲水、外部疏水面向脂多糖和磷脂组成的双分子膜的β-桶装结构(β-barrel)，因此外膜蛋白具有亲水和疏水双相性^[15]。OmpA家族蛋白由C端跨膜结构域和位于N端周质空间的结构域组成^[15]。采用PRED- TMBB的 Posterior decoding方法在线预测Omp74的结构，结果如图 1(a)所示，横坐标为氨基酸残基数，纵坐标为形成 β-片层的序列分值。从图中可以看出，Omp74的C端跨膜结构域可能由12个β-片层组成，N端周质空间结构域不形成β-片层结构，可见Omp74是典型的OmpA家族蛋白。根据预测结果和氨基酸序列绘制了如图 1(b)所示的二维结构图，以更形象地展示Omp74的结构，图中黑色字母标出的氨基酸残基部分为周质空间结构域。

图 1 PRED-TMBB的 Posterior decoding方法预测的Omp74结构图 Fig. 1 Predicted structure of Omp74 by posterior decoding method of PRED- TMBB (a) Prediction result from PRED-TMBB (b) Structure diagram drawing according to the prediction result and amino acid sequence of OmpA

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大多数外膜蛋白具有热修饰性，即在含SDS电泳上样缓冲液中的外膜蛋白经加热(>95℃)再进行SDS-PAGE电泳时，其在凝胶中的泳动速率明显较不加热样品减慢，这一特性常用来判断OMPs是否正确折叠^{[15, 16]}。图 2左边电泳图显示了从Shewanella sp. 抽提的细胞膜组分在经加热(boiled)或不加热(unboiled)处理样品中Omp74泳动速率发生的改变，加热变性(unfolded)后Omp74的移动速率较未变性蛋白(folded)的移动速率慢，即Omp74也具有热修饰性，本文即利用Omp74的这一特性来判断折叠的效果。

图 2 重折叠的Omp74与细胞膜组分中Omp74的SDS-PAGE电泳图比较 Fig. 2 Comparison between native Omp74 extracted from cells and recombinant Omp74 refolded with 1% DDM by SDS-PAGE

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图 2右边的电泳图为重组表达、纯化和在1%DDM中重折叠的Omp74，从图中可以看出，Omp74的纯度较高，重折叠后表现出热修饰特性，折叠的蛋白质移动特性与细胞中抽提的Omp74一致，但仅一部分蛋白质被折叠，说明Omp74可以在DDM中重新折叠成天然结构，但是需要进一步优化折叠条件以提高折叠效率。

整合到表面活性剂胶束或磷脂双分子膜中的疏水区域的跨膜结构域对亲水性的蛋白酶降解具有一定的抵抗能力，因此限制性酶解(limited proteolysis)也被作为判断重折叠的蛋白质是否正确折叠的方法^[12]。图 3显示重折叠Omp74和细胞膜组分中的Omp74经5min和10min限制性蛋白酶降解后的电泳结果，从图中可以看到经5min蛋白酶解后，未折叠的Omp74被完全降解，而重折叠的Omp74与膜组分分离的Omp74显示出相似的酶解图谱，该结果也表明Omp74重折叠的正确性。

图 3 经5min和15min蛋白酶降解后重折叠Omp74和细胞膜组分中Omp74的SDS-PAGE电泳图 Fig. 3 SDS-PAGE of refolded and native Omp74 after being digested with proteinase K for 5min and 15min

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为进一步确认Omp74 的重折叠效果，测定了折叠后的Omp74的色氨酸荧光色谱。外膜蛋白的跨膜区域通常都含有数个色氨酸残基，具有将蛋白质“锚定”在水/脂膜界面的功能^[12]，Omp74的氨基酸序列中含有6个色氨酸残基，根据结构预测的结果，其中4个位于水/脂膜界面(图 1)。色氨酸荧光对其所处环境的疏水性和亲水性变化非常灵敏，因此常常用于判断膜蛋白结构变化和折叠效果。图 4(a)显示了去折叠Omp74和重折叠Omp74的色氨酸荧光色谱，重折叠Omp74的最大荧光发射峰约为330nm，表明Omp74的色氨酸残基折叠到疏水环境中，而加热去折叠后，荧光强度降低，最大荧光发射峰移至345nm处，表明加热破坏了Omp74的结构，色氨酸残基暴露在亲水环境中。

图 4 重折叠和加热去折叠Omp74的色氨酸荧光扫描图谱(a)和圆二色谱图(b) Fig. 4 Tryptophan fluorescence spectroscopy (a) and circular dichroism (CD) spectroscopy (b) analysis of refolded Omp74 and unfolded one by boiling

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图 4(b)显示了重折叠和热变性Omp74的CD谱图。从图中可以看到，重折叠Omp74的CD图谱具有典型的β-片层二级结构特征，在约215nm处有一个负峰，加热变性后，重折叠的蛋白质变成无序(random coil)结构，CD图谱无明显特征峰。

SDS-PAGE、色氨酸荧光图谱和CD图谱的结果都表明重折叠的Omp74结构与该蛋白质的天然结构一致。

图 5显示了用尿素和SDS溶解的重组Omp74和OmpA分别在0℃和37℃条件下，1%DDM溶液中折叠2h后的折叠效果。从图中可以看出，OmpA的折叠效率受温度影响很明显，37℃条件下的折叠效率显著高于0℃条件下的，而Omp74的折叠效率受温度影响很小，但是受溶解蛋白质的溶剂的影响很明显，用SDS溶解的蛋白质在0℃和37℃都表现出更高的折叠效率。Omp74折叠对温度的不敏感性可能是其适应低温环境的结果，具体机制有待深入研究。

图 5 尿素或SDS溶解的Omp74和OmpA在0℃(a)和37℃(b)，1%的DDM中重折叠2h后的SDS-PAGE电泳图 Fig. 5 SDS-PAGE of urea or SDS dissolved OmpA and Omp74 refolded into micelles of DDM at 0℃ (a) or 37℃ (b) for 2h

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已报道的研究中，主要通过调整折叠介质，如折叠用的表面活性剂、磷脂酸等的浓度和种类来获得更好的体外折叠效果，本文首次在外膜折叠研究中发现低浓度的阴离子表面活性剂能促进蛋白质折叠。细菌的膜磷脂分子，如磷脂酰甘油带负电荷。SDS是强阴离子表面活性剂，不能支持外膜蛋白的重折叠^[17]，可能经DDM溶液稀释后，一些SDS分子嵌入到DDM的胶束，形成表面带负电荷的胶束，在一定程度上模拟了细胞膜表面，从而促进了Omp74的折叠，这也可能是Omp74在低温条件下细胞内折叠的作用机制。

为获得更高的折叠效率，探讨了不同浓度的阴离子表明活性剂对折叠率的影响。因折叠后SDS很难从体系中去除，后期将尿素溶解变性的Omp74用0.5%或1%DDM中混合有0.02%、0.04%、0.08%、0.1%、0.2%或0.4% Sarkosyl的溶液稀释折叠。结果如图 6所示，Omp74的折叠效率随Sarkosyl/DDM比率的增加而提高，在DDM浓度为0.5%，Sarkosyl浓度为0.4%时，折叠效率最高，折叠率接近100%。

图 6 Omp74在0.5%和1%的DDM和不同浓度十二烷基肌氨酸钠中的折叠情况 Fig. 6 Omp74 refolded with 0.5% or 1% DDM mixed with different concentrations of sarkosyl DDM:Lauryl-β-D-maltoside

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为了确认不是Sarkosyl的胶束促进了Omp74的折叠，将Sarkosyl浓度提高到其CMC值0.48%以上折叠，结果如图 7(a)所示。当Sarkosyl浓度大于0.4%，Omp74的折叠效率随Sarkosyl浓度增高而下降，可见不是Sarkosyl的胶束促进了Omp74的折叠。

图 7 Omp74全序列(a)和N端跨膜结构域 (b) 在0.5%的DDM和不同浓度的十二烷基肌氨酸钠混合溶液中折叠后的SDS-PAGE电泳图 Fig. 7 SDS-PAGE of wild type Omp74 (a) and the N-terminal transmembrane domain of Omp74 (b) refolded into micelles of 0.5% DDM mixed with different concentrations of sarkosyl

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Omp74的C端周质空间结构域中富含带正电荷的氨基酸(图 1)，推测C端结构域可能在与负电荷的折叠介质表面相互作用中发挥作用。体外表达不含C端的Omp74-N跨膜结构域，用不同浓度的Sarkosyl和0.5% DDM混合溶液折叠，结果如图 7(b)所示。Omp74-N的折叠效率高于野生型Omp74，Sarkosyl对其折叠没有明显的促进作用，当Sarkosyl浓度为0.4%时折叠效率就开始降低，而野生型Omp74在0.4%Sarkosyl存在的条件下折叠效率最高。可见C端结构域可能在Omp74的折叠中起抑制作用，Sarkosyl可能通过与C端相互作用减少这种抑制作用来促进野生型Omp74的折叠。关于OmpA的研究结果表明，其C端周质空间结构域通过防止蛋白质聚集而促进OmpA的折叠^[18]。Omp74虽然是OmpA家族蛋白，但是其氨基酸序列分布与OmpA有很大差异，Omp74的N端跨膜结构域的PI值为4.5，C端结构域的PI值高达10.5。OmpA刚好相反，其N端跨膜结构域的PI值为8.2，C端结构域的PI值为5.4。本文使用的折叠缓冲液pH为8.0，OmpA和Omp74的各结构域在缓冲液中所带净电荷不一致，故在浓度低于CMC值时Sarkosyl能促进Omp74的折叠，而对OmpA的折叠没有明显的影响。Omp74在低温下的高折叠效率的机制可能就归因于其特殊的氨基酸序列分布。

通过本文的研究，可得出以下结论：①Omp74的折叠受温度影响不显著，而来源于大肠杆菌的OmpA的体外折叠效率随温度升高增加显著；②低于CMC浓度的阴离子表面活性剂能促外膜蛋白Omp74的折叠，但不能促进OmpA的折叠，阴离子表面活性剂的促进作用与Omp74的C端结构域有关；③用0.5%的中性表面活性剂DDM加0.4%的Sarkosyl能获得完全折叠的Omp74。