核小体是构成真核生物染色质的基本结构。H2A、H2B、H3和H4四种组蛋白各2个拷贝组成八聚体核心颗粒，约147bp DNA序列以左手螺旋的方式在其上缠绕约1.75圈，在组蛋白H1的协助下形成稳定的染色质高级结构。在真核生物DNA复制和基因转录过程中，染色质结构及其动态变化过程会影响反式调控因子与DNA序列的结合及相关蛋白质的招募^[1]。H2A.Z和H3.3是两类染色质结构上较为常见的组蛋白变体，进化上序列高度保守，对染色质结构动态变化和基因转录起着非常重要的调控作用^[2]。

组蛋白变体H2A.Z与常规组蛋白H2A序列相似度仅为60%，研究认为，H2A.Z在基因快速启动转录过程中发挥作用，也有少量报道发现，在基因转录过程中H2A.Z起抑制作用^{[3, 4]}。组蛋白变体H3.3与常规组蛋白H3仅有4个氨基酸不同，大量的研究发现，H3.3在转录活性较高的基因、启动子及转录调控元件区域的染色质上占据水平较高^{[5, 6]}。在体内，组蛋白变体H2A.Z和H3.3可以协同构建特定的染色质构象调控基因的转录^{[1, 5]}。

在染色质层次上研究这些变体对基因表达调控的影响时，体内实验易受到较多因素的影响。在体外重构含有H2A.Z和H3.3变体的核小体及染色质结构，可以排除体内众多调控因子的影响，有针对性地考察特定DNA序列与组蛋白变体的结合作用，还可以通过对实验体系添加调控因子，分析调控因子对染色质结构的影响。本实验利用体外盐透析的方法，重构了含有H2A.Z和H3.3变体的核小体结构，结合荧光标记检测手段，计算了DNA序列与组蛋白变体结合过程的吉布斯自由能变化，定量的评价了DNA序列对组蛋白变体的亲和性。

大肠杆菌DH5α、BL21由本实验室保存，重组质粒pUCCS1、pUCCS2、pUCCS3由本实验室构建，含有组蛋白H2A、H2B、H3、H4、H2AZ和H3.3基因的pET重组质粒由中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室李国红研究员课题组赠送。

质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自上海生工，Taq酶、限制性内切核酸酶购自TaKaRa公司，NaCl购自Amresco公司。

层析柜(Thermo，REVCO)、高速冷冻离心机(Thermo，MULTIFUGE X1R；Thermo，LYNX400)、荧光凝胶成像仪(GE，Amersham Imager 600RGB)、紫外分光光度计(NanoDrop 2000)、蛋白质纯化系统(GE，AKTA pure)、摇床(Thermo，MAXQ5000)。

根据核小体定位的DNA序列10bp周期性及序列保守特性^[7]，设计了3条用于体外组装核小体的DNA序列，分别命名为CS1、CS2和CS3，具体序列信息见表 1。由上海生工化学合成目的DNA序列，连接到质粒pUC19的Hind III和EcoR I位点，重组质粒命名为pUCCS1、pUCCS2和pUCCS3。

采用PCR扩增的方法大量获取目的DNA序列。3条序列的PCR扩增引物相同，分别为CS-Forward：ACGGCCAGTGAATTCGAGG；CS-Reverse：GCCAAGCTT CTGAGATCGGAT，由上海生工合成。在合成引物时，上游引物的5′端标记Cy3荧光分子，用于后续实验检测。

DNA序列的PCR扩增程序为：95℃ 5min; 95℃ 20s、62℃ 20s,72℃ 30s,30个循环；72℃ 10min; 4℃ 保存。

PCR扩增产物经1.2%琼脂糖电泳后，利用上海生工胶回收试剂盒回收目的DNA片段，紫外分光光度计测定浓度，用于体外组装核小体实验。

按照参考文献^[8]中的方法分别表达纯化了6种组蛋白，将6种组蛋白测定浓度后，进行复性和装配组蛋白八聚体。与文献中略有不同的是利用H2AZ替代H2A装配了含有H2AZ的组蛋白八聚体，H3.3替代H3装配了含有H3.3的组蛋白八聚体。

将纯化的组蛋白八聚体与目的DNA片段以一定的比例加入到含有2mol/L NaCl的TE缓冲液中混匀，总体系为30μl，然后加入透析管(Thermo,6000~8000 MWCO)中，放入含2mol/L NaCl的TE透析液中避光透析16h，在此过程中用恒流泵将TE缓冲液匀速滴入透析液中，使其中NaCl的浓度降到0.6mol/L；将透析管转入到不含有NaCl的TE缓冲液中避光透析3~6h。

(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳。组装的样品在5%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳后分别进行Cy3荧光信号检测、EB染色、考马斯亮蓝染色检测。

(2)Cy3荧光信号检测。电泳后在荧光凝胶成像系统中520nm的激发光下检测Cy3的信号，拍照，利用凝胶成像分析软件(GE,ImageQuant TL)定量分析条带的荧光信号值。

(3)EB染色检测。检测Cy3荧光信号后，将凝胶置于EB中染色，在凝胶成像系统中拍照，同样利用软件(GE,ImageQuant TL)定量分析。

(4)考马斯亮蓝染色检测。组装的核小体样品检测Cy3信号后，将凝胶置于考马斯亮蓝中染色，检测凝胶中的组蛋白，脱色后拍照，与Cy3检测结果对照分析。

组装的核小体样品在泳道中会形成两条条带，分别是未形成核小体的DNA与形成核小体的DNA序列。定义未形成核小体的自由DNA为D，形成核小体的DNA为N。经检测Cy3信号或EB染色结果，自由DNA条带和核小体DNA条带的量化值分别为V_D和V_N，则反应过程的表观平衡常数为K_eq=V_N/V_D、吉布斯自由能变化为ΔG⁰=－RT^*ln(K_eq)、相对吉布斯自由能为ΔΔG⁰=ΔG⁰_sampce－ΔG⁰_refernce^[9]。DNA序列与组蛋白亲和力越大，该序列形成核小体的能力越强；组装过程吉布斯自由能越小，该序列对组蛋白八聚体的亲和力越大，在同等条件下越易形成核小体 ^[10]。

将理论设计的目的序列CS1、CS2和CS3化学合成后克隆到pUC19的多克隆位点Hind III和EcoR I之间，构建了重组质粒[图 1(a)]。利用Cy3荧光分子标记的PCR引物大量扩增目的序列，回收后测定浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Cy3的荧光信号[图 1(b)]。结果显示，DNA序列的纯度较高，无任何杂带，可以用于后续组装核小体的实验。

图 1 重组质粒结构示意及Cy3标记DNA序列的检测 Fig. 1 Schematic diagram of the reconstituted plasmids and detection of Cy3-labeled DNA sequences(a)The schematic diagram of the reconstituted plasmids. CS sequences were inserted in between the Hind III and EcoR I site of pUC19 (b) Native-PAGE analysis of Cy3-labeled CS sequences

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将含有6种组蛋白基因的重组质粒转入大肠杆菌DE1中，经IPTG诱导表达，收集蛋白质，SDS-PAGE检测结果见图 2。H4的分子质量约为14kDa，H2A、H2B的分子质量约为15kDa，而H3、H3.3、H2AZ的分子质量约为17kDa，从图中可以看出，各组蛋白的条带位置与理论值相符。蛋白质样品中含有少量的杂蛋白，可能是由于超声破碎细胞不彻底引起的。在后续纯化过程中，经过蛋白质的复性和凝胶层析过滤可以去除杂蛋白。

图 2 SDS-PAGE检测6种表达的组蛋白 Fig. 2 SDS-PAGE results of expressed histones

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蛋白质表达后，测定浓度，等分子比透析复性。在复性的过程，H2AZ、H2B、H3、H4各两个拷贝会形成含有H2AZ的组蛋白八聚体，H2A、H2B、H3.3、H4各两个拷贝会形成含有H3.3的组蛋白八聚体，同时，组蛋白之间可能会形成较大的团聚，以及H2A/H2B、H2AZ/H2B二聚体和H3/H4、H3.3/H4四聚体。复性样品经过凝胶层析过滤后的结果见图 3(a)和图 4(b)。从图中可看出，在280nm波长下检测洗脱样品的紫外吸收，曲线呈现出三个峰，第一个峰为组蛋白之间形成大的团聚物和样品中的杂蛋白，第二个峰为组蛋白八聚体，第三个峰为四聚体及二聚体。将组蛋白八聚体对应的第二个峰的洗脱样品分别进行SDS-PAGE电泳检测，结果见图 3(b)和图 4(b)。从图中可以看出，八聚体样品中组蛋白的条带位置及相对含量与理论预期一致，且样品中没有杂蛋白存在，纯度较高。利用紫外分光光度计测定八聚体的浓度，用于后续的核小体体外组装实验。

图 3 含有H2A.Z的组蛋白八聚体纯化及检测 Fig. 3 Purification and detection of histones octamer containing H2A.Z(a) Separation of recombinant histone octamer containing variant H2A.Z on HPLC by size exclusion chromatography. Superdex 200 column was used (b)SDS-PAGE analysis of reconstituted histone octamer containing variant H2A.Z

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图 4 含有H3.3的组蛋白八聚体纯化及检测 Fig. 4 Purification and detection of histones octamer containing H3.3(a) Separation of recombinant histone octamer containing variant H3.3 on HPLC by size exclusion chromatography. Superdex 200 column was used (b)SDS-PAGE analysis of reconstituted histone octamer containing variant H3.3

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分别将组蛋白八聚体和CS3序列以0.6、0.8和1.0三个比例组装形成核小体，电泳后首先检测Cy3荧光信号[图 5(a)]。从图中可以看出，组装的样品在电泳中会分离成两条带，电泳速率较快的条带是未形成核小体的DNA。由于组蛋白的存在，形成核小体的DNA泳动速率较慢。随着反应体系中组蛋白比例的增加，核小体的组装效率也在增大。

图 5 Cy3标记与EB染色检测组装核小体的结果 Fig. 5 Detection results of reconstituted nucleosome by Cy3 labeling and EB staining(a)Reconstituted nucleosomes containing histone variant were analyzed by native-PAGE and Cy3 labeling (b)Reconstituted nucleosomes containing histone variant were analyzed by native-PAGE and ethidium bromide staining

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将凝胶置于EB中染色，可以确定条带的位置，结果见图 5(b)，形成含H2A.Z的核小体的位置在400~500bp，含H3.3的核小体的位置在400bp左右。对于游离的DNA，EB染色与Cy3标记检测的亮度差异不大，当DNA缠绕在组蛋白上形成核小体，EB染色检测的灵敏度会受到较大影响。

为了定量地考察不同比例下核小体形成的效率，以及EB染色和Cy3标记检测方法的差异，利用分析软件将电泳中的条带进行了定量。结果如图 6所示，图中横坐标是组蛋白和DNA的不同比例，纵坐标是形成核小体的DNA和游离的DNA的比值，H2A.Z变体形成的核小体对EB染色影响较为显著(见图 6中“*”所示统计检验结果，paired-sample T test)，而两种方法检测H3.3变体组装效率差异不大。反应体系中组蛋白与DNA比例不同，H2A.Z形成核小体效率的差异也较大；而H3.3反应体系中，0.6和0.8两个比例下核小体形成效率差异不大，当比例增加到1.0时，形成的核小体明显增多。

图 6 不同比例下组装核小体的效率对比 Fig. 6 Formation efficiency of nucleosome in different ratio of histone to DNA(a)Formation efficiency comparison of nucleosome containing histone variant H2A.Z was analyzed by Cy3 labeling and ethidium bromide staining (b)Formation efficiency comparison of nucleosome containing histone variant H2A.Z was analyzed by Cy3 labeling and ethidium bromide staining. In this figure,one star denote P＜0.1; two stars denote P＜0.05; three stars denote P＜0.01

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实验同时从组蛋白的角度对组装的核小体样品进行了检测。组装样品经过native-PAGE电泳后，检测荧光信号[图 7(a)]，将凝胶置于考马斯亮蓝中染色，结果见图 7(b)。从图中对比可以看出，在图 7(a)对应的核小体条带位置，考马斯亮蓝也呈现出对应的蛋白质染色条带。

图 7 Cy3标记与考马斯亮蓝染色检测组装核小体的对比 Fig. 7 Detection results of reconstituted nucleosome by Cy3 labeling and Coomassie blue staining(a)Reconstituted nucleosomes containing histone variant were analyzed by native-PAGE and Cy3 labeling (b)Reconstituted nucleosomes containing histone variant were analyzed by native-PAGE and Coomassie brilliant blue staining

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盐透析法体外组装单个核小体的实验方法可以用来研究不同DNA序列对组蛋白的亲和性或是比较不同序列核小体形成能力的强弱。实验将CS1、CS2和CS3三条序列测定浓度后，在同样的条件下组装了核小体结构。Cy3标记检测结果如图 8所示，这三条序列形成核小体的能力不同，其中CS2和CS3较强，而CS1对组蛋白的亲和性较差。

图 8 不同DNA序列组装核小体的Cy3标记检测结果 Fig. 8 Detection results of nucleosome on different DNA sequences by Cy3 labeling(a)Reconstituted nucleosomes containing histone variant H2A.Z were analyzed by native-PAGE and Cy3 labeling (b)Reconstituted nucleosomes containing histone variant H3.3 were analyzed by native-PAGE and Cy3 labeling

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将图 8中各条带定量后，以CS1为对比样品，分别计算了三条序列形成核小体过程的吉布斯自由能和相对吉布斯自由能(表 2)。相对于CS1，CS2和CS3的相对吉布斯自由能均小于0，说明CS2和CS3形成含有H2A.Z和H3.3的核小体的能力均比CS1强，对组蛋白变体的亲和性更大。

目前国际上体外组装常规核小体的方法主要有两类，一是依赖于ATP水解能量的作用，在染色质装配因子(如NAP-1、ACF)驱动下装配核小体及染色质结构，组装体系中核小体定位主要依赖于蛋白质因子的作用，产生的染色质中的核小体不仅规范而且呈周期性排列，形成规律的念珠状的染色质结构^[11]。另一种方式是本实验采用的盐透析法，在盐离子驱动下DNA序列可以缠绕到组蛋白上形成单个核小体，该体系中没有其他蛋白质因子的作用，组装效率主要取决于DNA序列特性，若DNA模板不同或是非周期性的序列，由于DNA序列形成核小体的能力不同，则会产生不均匀的核小体或染色质结构^[11]。

利用盐透析法体外重构核小体结构，在盐离子浓度逐渐下降的过程中，首先H3/H4或H3.3/H4四聚体与DNA序列结合，2个拷贝的H2A/H2B或H2A.Z/H2B二聚体在分别结合上去形成一个稳定的核小体结构。

DNA序列对组蛋白的亲和性不同，组装核小体的效率也有所差异。体外组装形成核小体后，样品中的DNA存在游离和形成核小体两种状态，如何精确地检测二者比例是研究核小体定位的关键问题之一。早期研究过程中常采用EB染色的方法检测，但是发现DNA缠绕到组蛋白上会影响EB嵌入DNA的效率。一种方法是采用同位素标记DNA的方法可以准确地定量分析形成核小体的效率，由于同位素半衰期的特性，使得实验过程需要定期更换DNA样品，但是在组装核小体实验过程，需要大量摸索条件，更换DNA样品对组装核小体实验体系影响较大。另一种方法是采用生物素标记DNA进行检测，生物素标记检测虽然比较灵敏，但是在样品电泳后，需要转膜、抗体结合识别等多个环节处理，过程繁琐且易引起实验误差。本实验采用的荧光分子标记DNA进行核小体形成效率的检测，一次准备大量的DNA标记样品，荧光信号稳定、灵敏，电泳后直接扫描凝胶中的荧光信号，不需要其他环节处理。从实验中可以发现，组蛋白的结合明显的影响了EB染色检测的效果(图 6)，采用Cy3标记检测灵敏度要优于EB染色的结果。

DNA序列特征是体内影响核小体定位的主要因素之一，研究认为DNA序列上TA 10bp周期性规律和一些序列模体有利于形成核小体，而polyA对核小体有较强的排斥作用^{[7, 12, 13, 14]}。本实验基于核小体定位的DNA序列依赖性，设计了三条DNA序列，其中CS1序列具有CG或TG的10.5bp周期性，CS2和CS3序列具有TA 10.5bp周期性，CS2与CS1序列的其余碱基信息均相同，同时，这三条序列都符合以色列科学家Trifonov教授提出的核小体定位(R5Y5)_n序列特征。从实验的吉布斯自由能计算结果可以看出，CS2和CS3序列形成核小体的能力明显强于CS1序列，这可能主要是由于DNA序列上TA 10bp周期性规律所致。

盐透析法常用于构建含有常规组蛋白的核小体及染色质结构，组蛋白变体的体外实验研究相对较少。通过体外组装含有H2A.Z和H3.3的核小体结构，可以探讨DNA序列特性对含有H2A.Z和H3.3的核小体及染色质结构的影响。对组装的核小体体系添加调控蛋白因子，可以进一步分析H2A.Z和H3.3变体参与的诸如染色质重塑、核小体滑动、组蛋白置换、转录因子招募等生物学过程。

总之，本实验基于体外组装核小体的实验技术，通过组蛋白变体的表达纯化、复性及八聚体的装配，理论设计了易于形成核小体的DNA序列，体外组装了含有H2A.Z和H3.3的核小体结构，利用荧光标记方法，定量地检测分析了含有组蛋白变体的核小体形成效率及过程的吉布斯自由能变化。该方法的建立对研究组蛋白变体相关的结构生物学及转录调控等领域的问题具有一定的意义。

致谢 本实验工作得到了中国科学院生物物理研究所李国红研究的指导，在此表示感谢；同时受内蒙古科技大学创新基金(2014QDL012)资助。