番茄红素(lycopene)属于异戊二烯类化合物，具有抗氧化性和抗恶性肿瘤增生的作用^[1]，常用在保健品和食品领域，具有很高的应用价值。近年来，微生物发酵法由于其周期短、产量高等优点成为获得番茄红素的重要途径。目前，用于工业化生产番茄红素的微生物为三孢布拉霉(Blakeslea trispora)，但是其缺乏成熟的分子操作系统，只能通过复杂的发酵模式和添加化学抑制剂获得和提高番茄红素产量^{[2, 3]}。卷枝毛霉(Mucor circinelloides)的主要次级代谢产物包括β-胡萝卜素，番茄红素及其他类胡萝卜素^[4]，其具有高效可靠的遗传操作工具^[5]，并且基因组信息已经公布(http://genome.jgi.doe.gov/Mucci2/Mucci2.home.html)，这为利用分子操作手段改造卷枝毛霉以获得高产番茄红素的菌株提供了可能。

卷枝毛霉MU616为本实验室通过一系列分子改造获得的目前番茄红素产量最高的卷枝毛霉菌株，为了使其更具成为微生物发酵工业化生产番茄红素潜力的菌株，还需进行进一步的改造。然而，因为经过多轮改造，MU616的基因型被恢复成原养型，由于筛选标记的限制，无法继续进行外源基因的导入操作，为实现多次基因转化实验，必须再次将MU616改造为营养缺陷型菌株，以便转化子的筛选。尿嘧啶缺陷菌株是分子生物学实验中一种常见的营养缺陷型菌株，在多个菌种中被证明是一种有效的基因转化受体。由pyrG基因编码的乳清酸核苷-磷酸盐脱羧酶(orotidine-5′-monophosphate decarboxylase，OMPdecase；4.1.1 .23 )是尿嘧啶合成过程中的关键酶之一^[6]，OMPdecase失活使菌株无法合成尿嘧啶并且对5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid，5-FOA)产生抗性^[7]。而野生型菌株则会合成有毒的5-氟尿嘧啶单磷酸盐(5-fluoro-uridine monophosphate，5-FUMP)，造成细胞毒性。王连会等^[8]利用紫外诱变和5-FOA筛选获得了8株香菇L26的尿嘧啶缺陷型，经验证其中2株为pyrG基因突变造成的尿嘧啶营养缺陷。王宇光等^[9]同样通过诱变得到了海洋红酵母(Rhodotorula benthica)S8的尿嘧啶缺陷型菌株ST5用于下一步海洋红酵母工程菌的构建。对于卷枝毛霉，Navarro等^[10]曾通过化学诱变的方法获得过多株亮氨酸和甲硫氨酸缺陷型菌株。因此，可以通过化学诱变的手段并利用5-FOA来筛选获得由pyrG基因突变产生的卷枝毛霉尿嘧啶缺陷型菌株。

本实验拟通过化学诱变的方法获得卷枝毛霉尿嘧啶缺陷型菌株，并且通过转化带有pyrG基因的质粒回补缺陷型菌株以确定其为pyrG基因缺陷突变株，同时考察缺陷型菌株生长特性及产番茄红素性能，以期获得性状与出发菌株无明显差异的带有遗传标记的卷枝毛霉受体菌。

卷枝毛霉MU616来源于卷枝毛霉R7B(亮氨酸缺陷型)，通过分子改造获得，基因型为原养型。质粒pEPM1^[11]中含有来源于卷枝毛霉的编码OMPdecase的pyrG基因，用于回补突变株的尿嘧啶缺陷。卷枝毛霉R7B和质粒pEPM1均由西班牙穆尔西亚大学生物学院真菌遗传学系Victoriano Garre教授赠予。

YNB培养基^[12]，MMC培养基^[13]根据需要添加2g/L 5-FOA、20μg/ml亮氨酸或200μg/ml尿嘧啶。pH调节至3.2或4.5，分别用于菌落和菌丝体的生长。LB培养基用于大肠杆菌的培养，根据需要添加氨苄青霉素(50μg/ml)。5-FOA、尿嘧啶和诱变剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)均购于Sigma公司，其他试剂均为市售化学纯。质粒提取试剂盒购于Qiagen公司。

将5×10⁶左右的孢子重悬于柠檬酸/磷酸盐缓冲液(PCS)中，加入0.5ml NTG溶液(0.1mg/ml)，混匀，置于室温。每隔15min取出1ml混合液，离心终止诱变，超纯水洗涤两次，并用0.9ml超纯水重悬。稀释500倍后取100μl涂布于YNB培养基，26℃培养两天后进行菌落计数，每个样品重复三次。没有添加NTG诱变剂的孢子液作为空白对照。根据处理后孢子的萌发率绘制NTG致死时间曲线,确定最适处理时间。

根据1.2.1 中确定的最适诱变时间对MU616的孢子进行处理，处理后的孢子液涂布于添加了尿嘧啶的YNB培养基，26℃培养5天左右。收集孢子，将孢子液涂布于同时添加了尿嘧啶和5-FOA的YNB选择培养基，培养10~15天。挑取平板上比较明显的菌落，同时分别接种于没有添加尿嘧啶的基本培养基和添加了尿嘧啶和5-FOA的选择培养基上。26℃培养5天左右，在基本培养基上无法生长，但是在选择培养基上可以生长的菌落为无法合成尿嘧啶核苷的突变株。

将1.2.2 中获得的突变株同时分别在基本培养基和选择培养基上连续传代三次，26℃培养，观察其生长状况，得到连续传代三次后仍然不能在基本培养基上生长但可以在选择培养基上稳定生长的突变株。为进一步确定突变株的稳定性，接种突变株的孢子液于液体基本培养基中，26℃、200r/min培养5天，观察生长情况，重复三次。

参照Gutierrez等^[5]的方法收集孢子，用15μg/ml壳聚糖酶(chitosanase RD，US Biologicals，MA)和0.5mg/ml溶壁酶 (L-1412；Sigma-Aldrich，MO)制备原生质体。提取质粒pEPM1，加至制备好的原生质体中，进行电击转化。电击条件为场强0.8kV、电容25μF、电阻400Ω。电击后将原生质体涂布于MMC培养基上，26℃培养3天。

挑取转化子扩大培养，提取总DNA。根据质粒pEPM1的序列，设计引物pEPM1-F(CCTGGGGTGCCTAATGAGTG)和pEPM1-R(ATCCTGT TACCAGTGGCTGC)用于扩增pEPM1上的一段特异序列。以转化子总DNA为模板扩增pEPM1上的特异序列以确认质粒是否转入突变株，出发菌株总DNA为阴性对照，质粒pEPM1为阳性对照。

接种各突变株孢子液于添加尿嘧啶的YNB液体培养基中，使孢子终浓度为10⁷/ml，26℃，200r/min培养3天。收集菌体，冻干称重并记录生物量。

挑取各突变株菌丝，接种于添加尿嘧啶的YNB固体培养基中央，分别在光照和黑暗条件下培养3天，观察菌落形态。

将3株pyrG突变株及出发菌株MU616在光照和黑暗条件下分别培养84h，收集菌体，液氮研磨并冷冻干燥。称取干燥菌体0.02g，加入2ml甲醇和2ml石油醚，振荡混匀，2 000r/min离心10min。将石油醚层转移至新的离心管中，在原离心管中继续添加2ml石油醚抽提，直至菌体完全失去颜色。合并石油醚层，参照Davies^[14]的方法，用分光光度法测定番茄红素含量。整个过程需要在避光条件下进行。

对NTG处理后的MU616活菌数进行计数，计算不同处理时间下孢子的存活率，设定0min孢子的存活率为100%(图 1)。结果显示，随着时间增加，孢子存活率降低，当处理时间为60min时存活率仅为7.8%。菌株的正向突变往往发生在存活率较低的高剂量区，通常选择存活率10%及以下的剂量用于诱变实验，故选择60min作为本实验的诱变时间。

图 1 NTG不同处理时间下卷枝毛霉孢子存活率 Fig. 1 Survival rate of M.circinelloides treated with NTG by different time Cell counts were performed in triplicates

图选项

根据2.1所述的最适时间对孢子进行诱变，获得的孢子液涂布于添加尿嘧啶的YNB培养基产孢，5天左右后收集孢子。将孢子液涂布于选择培养基上，10天后观察到约有200个明显菌落，挑取后分别同时接种于基本培养基和选择培养基上。培养5天后发现有5个菌落在基本培养基上几乎不能生长，而在选择培养基上却能正常生长。基本培养基中没有尿嘧啶成分，选择培养基为添加了尿嘧啶和5-FOA的YNB培养基，5-FOA对几乎所有的生物体都有毒性，它是乳清酸(orotic acid，OA)的结构类似物，可代替OA进入嘧啶合成通路，在OMPdecase、胸苷酸(uridine monophosphate，UMP)合成酶等一系列酶作用下产生对细胞有毒性的物质，从而导致细胞死亡^[15]。因此，在外源添加尿嘧啶满足生长需要的情况下，阻断嘧啶合成通路可使细胞对5-FOA产生抗性。这可以作为尿嘧啶缺陷型筛选的依据。本实验通过基本培养基和添加了5-FOA及尿嘧啶的选择培养基筛选获得了5株尿嘧啶缺陷型菌株。

将这5株突变株同时分别在基本培养基和选择培养基上连续传代三次后，仍能在选择培养基上正常生长，但在基本培养基上无法生长(图 2)。为进一步确定其稳定性，将这5株突变株的孢子液接种于液体基本培养基中，26℃、200r/min培养5天后均不能生长，说明它们确为无法合成尿嘧啶的稳定突变株。

图 2 卷枝毛霉MU616及其突变株在选择培养基和基本培养基上的生长情况 Fig. 2 Growth of MU616 and the mutants on selective medium and minimal medium (a) Selective medium (b) Minimal medium

图选项

在酵母和丝状真菌中，通常通过突变OMPdecase阻断嘧啶合成通路，制备尿嘧啶缺陷型菌株^{[16, 17, 18]}。质粒pEPM1上包括一段编码OMPdecase的pyrG基因序列，在卷枝毛霉pyrG突变株中补回pEPM1可以使其恢复合成尿嘧啶的能力。化学诱变为随机突变，在所获得的5株尿嘧啶缺陷型中，突变可能并未发生在OMPdecase上而是在通路中的其他酶上。为了确定已获得的5株尿嘧啶缺陷型菌株为pyrG突变株，质粒pEPM1被分别转化至5株突变株中。基本培养基YNB为筛选培养基。转化后，在筛选培养基上，突变株Mt2、Mt3并没有转化子出现，而Mt1、Mt4和Mt5在每个平板上分别约有73个、86个和57个转化子，转化效率达到219T/μg DNA、258T/μg DNA和171T/μg DNA。分别挑取一个转化子，扩大培养后提取总DNA，以其为模板扩增质粒pEPM1上的一段序列，出发菌株MU616为阴性对照，质粒pEPM1为阳性对照。结果显示(图 3)，与阴性对照相比，三个转化子都有一段700bp左右的条带，这与阳性对照一致，说明质粒已经成功转化至Mt1、Mt4和Mt5中，Mt1、Mt4和Mt5为pyrG突变株。

图 3 PCR 验证pyrG回补突变株 Fig. 3 PCR analysis of the complementation of the pyrG mutants M：DNA marker；1：MU616；2：pEPM1；3：Mt1；4：Mt4；5：Mt5

图选项

YNB固体培养基上，突变株Mt1、Mt4和Mt5的表型与MU616相似，光照条件下菌体的颜色比黑暗条件的深，说明在突变株中，光照刺激合成类胡萝卜素机制没有被破坏。但是，与MU616以及其他两株突变株相比Mt1的菌丝延伸形成的蛛网状较松散，菌落边缘较透明，说明诱变可能造成了不利于菌体生长的突变。生物量测定结果(表 1)也显示突变株Mt1的生物量只有(8.1±0.4)g/L，与MU616、Mt4及Mt5相比明显降低，说明确实发生了不利于菌体生长的突变。另外，通过肉眼观察发现其颜色与MU616相比略浅，另外两株突变株则与MU616颜色相近。

化学诱变可能会导致类胡萝卜素合成路径中结构基因或调控基因的突变，从而导致类胡萝卜素含量的变化。为了确定本实验所获得的突变株在失去合成尿嘧啶能力的同时番茄红素的含量没有降低，测定了突变株Mt1、Mt4和Mt5的番茄红素产量，以出发菌株MU616为对照。结果显示(图 4)，Mt1、Mt5的番茄红素含量与出发菌株MU616相比显著降低，而Mt4积累番茄红素的能力与MU616相当，说明在Mt4中并未发生不利于番茄红素合成的突变。因为产番茄红素性能的稳定和尿嘧啶缺陷型的产生，Mt4可用于下一步分子改造以获得番茄红素产量更高的菌株。

图 4 pyrG突变株的番茄红素含量分析 Fig. 4 Lycopene analysis of the pyrG mutants

图选项

本实验利用NTG成功诱变了卷枝毛霉MU616，通过5-FOA筛选和同源转化获得3株pyrG基因突变引起的尿嘧啶缺陷型卷枝毛霉菌株，在此基础上对突变株的生长特性和番茄红素产量进行研究，确定其中一株突变株Mt4为带有遗传标记且生长特性和产番茄红素性状与出发菌株相比无明显差异的菌株，适宜作为进行卷枝毛霉转化的受体菌。这为后续高产番茄红素工程菌株的构建打下了基础。