纤维素酶是一种复合酶，在分解纤维素时起生物催化作用，其广泛存在于自然界的生物体内。一般用于生产纤维素酶的菌主要为丝状真菌^[1]。纤维素酶由三种酶协同作用降解纤维素。其中，内切葡聚糖苷酶(EG)，随机水解可溶性纤维素内部糖苷键，产生大量的纤维素短链；外切葡聚糖苷酶(CBH)作用于纤维素分子链两端，释放纤维二糖分子；β-葡萄糖苷酶(BG)则作用于纤维二糖将其分解成葡萄糖^[2]。纤维素酶系的组成及比例对三者协同水解纤维素起着至关重要的作用。酶活力及产量是纤维素酶工业生产的关键点，国内外研究中常通过理性设计对纤维素酶系组分进行改进^{[3, 4]}或采用基因工程方法构建高产菌株^[5]来实现。目前，纤维素酶的研究已深入到基因转录调控领域。Amore等^[6]研究发现纤维素酶的转录受多个调控因子的协同作用，包括正调控因子(XYR1、ACE2)和负调控因子(ACE1、CRE1^[7])。其中，CRE为酵母和丝状真菌中普遍存在的一种碳代谢抑制因子^[8]，其主要结构为Cys2His2锌指蛋白，对纤维素酶和木聚糖酶基因均存在负调控作用^[9]。

碳代谢阻遏是纤维素酶生产中一种重要的调控机制，当简单碳源，如葡萄糖存在时，许多参与复杂碳源利用的酶基因表达受到抑制^[10]。丝状真菌分泌的纤维素酶酶系完全，但产酶周期较长。通过对碳代谢调控的削弱，使用简易碳源缩短生产周期，低成本产酶，对工业生产有着深远的意义。故而，碳源代谢阻遏的研究成为了当前纤维素酶研究的热点之一。

本实验室从黄山生态林中采集并分离出一株高产纤维素酶的匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer)，本文以其为出发菌株进行研究。从基因组DNA中克隆得到cre基因，利用重叠PCR将潮霉素抗性基因插入其中，转化原菌获得CRE缺失菌株，并就其对纤维素酶基因转录调控特性展开研究。

匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)、质粒pRS303H、大肠杆菌DH5α均保藏于安徽工程大学可再生资源研究实验室。

胰蛋白胨、酵母粉购自上海生工；RNA抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、Taq酶、pUCm-T载体、dNTP、T4 DNA ligase、EcoRⅠ、IPTG、氨苄青霉素、X-gal、潮霉素、HEPES、乙酸锂、DNA Marker均购自宝生物(大连)有限公司；基因测序由上海生工完成，其他药品均为国药分析纯。

CTAB抽提缓冲液：2%CTAB (m/V)，100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，2% (V/V) β-巯基乙醇，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA。

PDA培养基：将200g去皮马铃薯于沸水中煮0.5h后过滤，在滤液中添加20g葡萄糖，定容至1 000ml，pH自然。

发酵培养基：葡萄糖，(NH₄)₂SO₄ 1.4g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，CaCl₂·2H₂O 0.3g/L；微量元素液：FeSO₄·7H₂O 0.005g/L，MnSO₄·H₂O 0.001 5g/L，ZnSO₄·H₂O 0.001 4g/L，CoCl₂ 0.002g/L。

LB培养基：蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L。

电击缓冲液：Tris-HCl (pH7.5) 10mmol/L，蔗糖 270mmol/L，CH₃COOLi 1mmol/L。

YEPD培养基：酵母粉 10g/L，蛋白胨 20g/L，葡萄糖 20g/L，自然pH。

YED培养基：酵母粉 10g/L，葡萄糖 20g/L，HEPES 20mmol/L，使用1mol/L氢氧化钠调pH至8.0。

筛选平板：PDA固体培养基添加潮霉素B至终浓度为180μg/ml。

将匍枝根霉TP-02于PDA液体培养基中培养20h后收集菌体，冷冻干燥后研磨成粉末，采用CTAB法^[11]提取基因组DNA以备后用。

根据GenBank上已公布的cre基因序列进行比对分析，应用Primer5.0软件设计引物。以基因组DNA为模板，PCR扩增全长(25μl体系)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，上游引物(cre-AF：5′-ATGCCGCMMCCRGS HTCKTCA-3′)1.0μl，下游引物(cre-BF：5′-TCDGCCAR RTCRCCRCCVGC-3′)1.0μl，Taq酶 0.15μl，ddH₂O补至25μl。

反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物经切胶回收后与pUCm-T载体过夜连接，转化大肠杆菌DH5α。经蓝白斑筛选，挑取转化子酶切验证后，送上海生工测序。利用DNAMAN6.0和DNASTAR，完成对cre的生物信息学分析。

利用质粒抽提试剂盒提取pRS303H质粒。

PCR扩增hygB全长(25μl体系)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，上游引物(Hygro-F：5′-ATGAAAAA GCCTGAACTCACCGCG-3′)1.0μl，下游引物(Hygro-R：5′-CTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGT-3′)1.0μl，Taq酶0.15μl，ddH₂O补至25μl。

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。

根据生物信息学分析结果，确定与抗性基因的整合位点如图 1所示。利用重叠PCR完成cre基因与hygB基因的融合，具体引物如表 1所示。将融合基因连接pUCm-T载体，并转化大肠杆菌DH5α。

图 1 重叠PCR示意图 Fig. 1 The diagram of overlapping PCR

图选项

将匍枝根霉孢子经无菌水洗涤，接种于YEPD培养基中萌发8~9h，用预冷的电极缓冲液悬浮萌发孢子。孢子悬液与质粒DNA(pUCm-T-cre-hygB)混合，在1.5kV电压下进行转化^[12]。

取冷冻干燥后的菌丝体100mg，用预冷的研钵(180℃干燥6h灭RNA酶)快速研磨后，利用试剂盒提取得到匍枝根霉总RNA。以此为模板，利用反转录试剂盒进行cDNA的单链合成。根据实验室早先获得的纤维素酶基因设计引物，具体见表 2。将cDNA溶液稀释20倍作为模板，以SYBR为荧光染料进行RT-qPCR。利用LightCycler 96分析实验数据，以18S rRNA作为内参基因，并用2^-△△C_T法计算mRNA水平。

采用DNS法测定内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和纤维素酶总酶活。在各个酶的催化下，每分钟分别水解羧甲基纤维素钠(CMC)、水杨苷、滤纸(1cm×6cm)生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位IU。

从匍枝根霉基因组DNA中克隆得到cre全长序列，共1 284bp。其编码蛋白CRE为碳代谢阻遏蛋白，可结合5′-SYGGRG-3′序列。

根据测序结果，设计引物，分别用creF-creHygF2和creHygR1-creR扩增cre两端序列(图 2)，并用引物creHygF1-creHygR2扩增hygB，通过重叠PCR成功构建cre-hygB融合基因，大小为2 310bp(图 2)。

图 2 cre同源序列和融合基因的琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of cre homologous sequences and fusion geneM:5 000bp DNA marker; 1,2: cre-hygB PCR products; 3~6: cre homologous sequences

图选项

将融合基因cre-hygB转化匍枝根霉萌发孢子，初筛获得阳性克隆。提取转化子染色体DNA，利用引物creHygF1-creHygR2扩增hygB基因序列，验证所筛菌株带有潮霉素抗性基因(图 3)。同时，利用引物creF-creR进行扩增全长，目的条带单一，大小一致(图 3)。PCR验证结果显示，△CRE菌株构建成功。

图 3 转化子的PCR验证 Fig. 3 PCR validation of the transformants M：5 000bp DNA marker；1~3： Full-length gene PCR of transformants；4,5：Resistance gene of the PCR product

图选项

为进一步验证△CRE菌株中外源片段发生同源重组时该转化片段在染色体中的拷贝数，提取筛选到的5株转化子进行RT-qPCR分析。结果显示，只有一株未检测到原始菌株cre基因的拷贝数，即同源重组成功。

分别提取△CRE突变株和原菌总RNA进行反转录，利用RT-qPCR对纤维素酶基因转录水平进行研究。结果显示，△CRE中已无CRE核心区域，且各纤维素酶基因的转录水平均不同程度的提高了(图 4)。其中，eg提高了48.75%，bg提高了26%，cbh1提高了5.6%，cbh2提高了38.6%。该突变株缺失了CRE的核心区，理论上应该能有效克服碳代谢阻遏，从而在高糖环境下可保证，甚至提高微生物各基因的转录。

图 4 各个基因的转录水平 Fig. 4 The transcription level of different genes

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为排除干扰，采用单一碳源对匍枝根霉原菌和△CRE突变株纤维素酶表达情况进行研究。分别以1%、2%、3%、4%和5%葡萄糖作为单一碳源，对发酵过程中纤维素酶的活力进行测定，分析碳阻遏因子的缺失对菌株产酶的影响。其中，1%葡萄糖仅供菌体生长，4%和5%的葡萄糖由于浓度过高，对菌体本身存在伤害，故最终以2%和3%糖浓度进行深入分析。

如图 5所示，△CRE突变株的滤纸酶活整体高于原始菌株。2%葡萄糖作为碳源时，△CRE突变株在发酵前期基本与原菌保持一致；培养24h后均达到最高点，前者为1.45IU/ml，后者仅1.09IU/ml，即突变株的总酶活提高了33%。以3%葡萄糖作为碳源时，原菌仍在24h达到酶活最高点(1.56IU/ml)，而突变株在糖浓度增加的情况下，未受碳代谢阻遏的影响，将酶活高峰期推迟到了30h，最大值为1.90IU/ml，提高了21.8%。结果显示，cre基因的破坏明显削弱了CRE因子对纤维素酶表达的抑制作用。

图 5 △CRE菌株与TP-02菌株的滤纸酶活 Fig. 5 Filter paper activity produced by △CRE strain and TP-02 strain

图选项

CRE的破坏对内切葡聚糖酶的影响最为明显。如图 6所示，2%糖浓度下，△CRE突变株在30h达到最大值为2.84IU/ml，原菌则在24h达到最大值2.34IU/ml，最终较原菌提高了21.36%。3%糖浓度下，两者均在30h达到峰值，突变株较原菌提高了58.62%。

图 6 △CRE菌株与TP-02菌株的CMC酶活 Fig. 6 The CMC activity produced by △CRE strain and TP-02 strain

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CRE对β-葡萄糖苷酶的活力变化影响并不明显。如图 7所示，2%葡萄糖作为碳源时，突变株和原菌均在培养24h后达到酶活高峰，分别为1.62IU/ml和1.32IU/ml，较原菌提高了22.7%。3%葡萄糖为碳源时，两者均在30h达到最大值，分别为1.72IU/ml和1.34IU/ml，较原菌提高了28.35%。

图 7 △CRE菌株与TP-02菌株的β-葡萄糖苷酶酶活 Fig. 7 The β-Glucosedases activity produced by △CRE strain and TP-02 strain

图选项

利用SPSS 21.0软件对△CRE菌株和原菌TP-02在不同葡萄糖浓度下的纤维素酶酶活进行显著性分析，从而反映菌株因基因的转录调控水平的不同带来的差异，结果如表 3所示。

通过对两个菌株的CMC酶活力、β-葡萄糖苷酶活力和FPA酶活力的统计性分析，可以看出三对酶活样本的统计量对应的概率P值均小于0.05，统计学上表现为差异显著。菌株受到CRE的调控，△CRE菌株产纤维素酶量比原菌有显著性提高。

综合以上结果，CRE对纤维素酶各组分的调控存在特异性。CRE对内切葡聚糖苷酶的调控最为显著，β-葡萄糖苷酶次之。cre基因的破坏可改善菌体的碳代谢阻遏作用，提高菌体的耐糖能力。

纤维素酶的产生是一个错综复杂的过程，受到各个调控因子的影响，其表达调控的分子机制了解还不全面。cre是纤维素酶生产过程中调控碳源代谢阻遏过程的关键基因^[13]，在构巢曲霉和里氏木霉中通过共有序列结合到各自靶细胞的启动子上，进而抑制相关酶的基因转录表达^[14]。为研究碳阻遏因子CRE在匍枝根霉中的作用，本研究利用重叠PCR技术将真菌遗传转化系统中常用的hygB^[15]抗性基因插入cre，通过同源重组成功构建了△CRE突变株。相比较原始菌株，cre基因的敲除使得突变株纤维素酶基因eg、bg、cbh1和cbh2的转录水平均有所提高，分别为48.75%、26%、5.6%和38.6%。匍枝根霉利用葡萄糖产纤维素酶的过程中，三种主要酶的合成代谢与糖类物质息息相关。CRE抑制有关糖类吸收转运的蛋白质，造成碳代谢阻遏。葡萄糖是β-葡萄糖苷酶合成代谢的阻遏物，解除葡萄糖阻遏可以使纤维素酶高效迅速的合成。CRE的敲除并不影响菌体利用葡萄糖为碳源的基础生长，使得纤维素酶相关基因表达上调，具有调控特异性。培养基中糖的不同浓度会影响关键酶的产生。随着葡萄糖浓度的增加，纤维素酶系各组分受抑制明显。实验选取5种葡萄糖浓度，葡萄糖为10g/L时，仅能满足菌体的生长需要；葡萄糖浓度高于40g/L时，对菌体产生伤害，抑制纤维素酶的活性。葡萄糖浓度为30g/L时，敲除菌株分泌内切葡聚糖酶活力最为显著。

纤维素酶特异性高，反应条件温和，可以将农业中废弃物稻草、麦秸秆等木质纤维素转化成简单的糖类，但此生产周期较长，处理步骤繁琐，不易工业化生产。一般优先选择简易碳源，不仅能够节约成本，且菌体利用率高。菌体中碳阻遏因子CRE的破坏解除其对纤维素酶转录调控的抑制，削弱了纤维素酶生产中的碳代谢阻遏效应，从而达到对生长过程中碳源的选择利用，使得纤维素酶基因高效表达，分泌量增加，为产业化生产应用提供了有利保障。