2016, Vol. 36文章信息
- 陈利娜, 滕牧洲, 卢严方, 郑文岭, 马文丽
- CHEN Li-na, TENG Mu-zhou, LU Yan-fang, ZHENG Wen-ling, MA Wen-li
- miR-335在肿瘤组织中的表达及其预测靶基因的生物信息学分析
- miR-335 Expression in Tumor Tissues and Bioinformatic Analysis of Predicted Target Genes
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(3): 23-30
- China Biotechnology, 2016, 36(3): 23-30
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20160304
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文章历史
- 收稿日期: 2015-10-27
- 修回日期: 2015-12-01
miRNA是含有约22个碱基的单链非编码RNA，可以结合mRNA的3′非编码区 (3′UTR)从而调节其转录水平或降解该mRNA[1]。miRNA表达谱芯片分析是高通量评估特定肿瘤样本miRNA表达水平的最常用技术，海量的肿瘤组织及细胞系miRNA表达谱芯片数据表明，miRNA的异常表达对肿瘤细胞功能影响强烈，是众多肿瘤发生发展的关键因素之一[2]。
miR-335位于人染色体7q32上，研究表明，其异常表达与卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤相关。miR-335可以抑制Bcl-w蛋白水平的表达从而抑制MMP-2表达，在卵巢癌侵袭转移中发挥抑癌基因作用[3]。在乳腺癌易转移性细胞系中，miR-335通过靶标调控SOX4和 TNC，减少这两种转移相关蛋白表达从而抑制恶性肿瘤细胞的入侵[4]。Hafez等[5]的研究也发现miR-335、miR-206在乳腺癌组织中的低表达现象，并推断低丰度表达的miR-335、miR-206促进细胞转移机制是促进基质金属蛋白酶MMP2、MMP9和血管内皮生长因子VEGF的表达上调，以及抑制金属蛋白酶组织抑制因子TIMP1、TIMP3和凋亡相关抗体基因PDCD4的表达下调。Gong等[6]发现，在小细胞肺癌SBC-5细胞中，高表达的miR-335显著抑制了细胞迁移、侵袭、增殖、克隆形成及破骨细胞诱导。小鼠实验也证实miR-335的表达下调可抑制骨转移关键通路IGF-IR 和 RANKL通路，因而促进了骨转移和溶骨。miR-335还参与调控细胞的生长凋亡机制[7]，并可抑制细胞的迁移和侵袭[8]。但其在肿瘤中的具体调控机制，特别是相关信号转导通路及靶基因蛋白相互作用等方面的研究还需进一步深入探索。
miRNA可以调控多个基因的表达[9]，文献报道也证实miR-335靶基因并不唯一，但实验验证往往只能验证一个或几个靶基因及相关通路，而利用生物信息学方法，从现有大数据中查询并分析数据，可快速高效预测miRNA多个靶基因，并可进行深入的生物信息学分析，从而预测其功能和信号转导通路，为后期miRNA研究提供方向。
本文采用生物信息学手段，分析多个肿瘤的miRNA表达谱芯片数据确定miR-335在肿瘤组织中的表达情况，并在线预测其靶基因，结合已经验证的靶基因，对其靶基因集合进行功能富集分析(GO-analysis)、信号转导通路富集分析(KEGG pathway analysis)。为后期深入研究miR-335在肿瘤中的调控机制奠定理论、实验基础。
1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 数据库
在miRNA分子数据库miRBase(http://www.mirbase.org/)中查询miRNA信息； GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载基因芯片数据； miRNA靶基因预测在线网站DIANA-microT(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)、miRDB(http://www.mirdb.org/miRDB/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.
nctu.edu.tw/)查询已经实验验证的靶基因。
Qlucore Omics Explorer (QOE) 3.0 (http://www.qlucore.com/)用于分析基因芯片数据中基因的表达水平。QOE3.0是新型生物信息学分析软件，由瑞典隆德大学开发，用于处理表达谱芯片数据。通过该软件统计计算可将大量数据转化为3D可视化图，再经PCA分析和聚类分析等便可从多个角度简便直观地识别数据中隐藏的结构和模式；DAVID(http://www.pantherdb.org/)对基因集合进行GO分析和KEGG分析。
1.1.3 数据集本研究中采用的与miR-335表达相关的肿瘤miRNA表达谱芯片数据均从NCBI数据库GEO中下载。在 GEOSeries数据库搜索框中分别以 “hepatocellular carcinoma”、“lung adenocarcinomas”、 “breast cancer”、“intrahepatic cholangiocarcinoma”、 “liposarcoma”等常见肿瘤疾病为检索词，限定Series type(s)为Non-coding RNA profiling by array，且限定Organism(s)为Homo sapiens。对检索数据集进一步筛查，选择实验组别设有肿瘤组织及其癌旁组织且检测miRNA中包含miR-335的数据集。共获得5个符合要求的数据集，数据集对应肿瘤类别及登录号分别为肝癌(GSE31383)、肺癌(GSE48414)、乳腺癌(GSE38167)、肝内胆管癌(GSE53870)、脂肪肉瘤(GSE45364)。GSE31383共有19例样本，包括10例健康肝组织样本和9例肝癌组织样本；GSE48414[10]共有174例样本，包括154例肺癌组织样本和20例正常肺组织样本；GSE38167[11]共有67例样本，包括31例三阴性乳腺癌组织样本，13例淋巴结转移组织样本及23例正常乳腺组织样本； GSE53870共有72例样本，包括63例肝内胆管癌组织样本和9例正常肝内胆管组织样本；GSE45364[12]共有115例样本，包括20例去分化脂肪肉瘤组织样本、14例脂肪肉瘤组织样本、20例黏液样脂肉瘤组织样本、17例正常脂肪组织样本、9例多形型脂肪肉瘤组织样本、10例圆细胞脂肪肉瘤组织样本、25例高分化脂肪肉瘤组织样本。
1.2 方 法 1.2.1 miR-335序列保守性分析从miRBase查找miR-335在多个物种中的序列，并进行序列比对分析。
1.2.2 miR-335在肿瘤组织中的表达分析将miRNA表达谱芯片数据集导入QOE3.0，并进行数据标准化处理(平均值=0，标准差=1)，采用两样本t检验，设定P＜0.05、q＜0.01，筛选差异表达的miRNA，并生成差异基因的主成分分析图(PCA图)，调整PCA图视图角度筛选差异基因，并从差异基因列表中查看是否含有miR-335，再进一步根据miR-335在肿瘤组织及其癌旁组织中的表达量绘制箱图比较两者表达差异。
1.2.3 miR-335靶基因预测使用DIANA-microT、PicTar、miRDB和TargetScan在线预测miR-335的靶基因，取其预测结果交集；再结合miRTarBase及文献报道中经实验验证的靶基因，取两者结果并集作为后期分析的基因集合。
1.2.4 miR-335靶基因的GO分析和KEGG通路分析将miR-335靶基因集合上传至DAVID，默认人类全基因组作为背景基因，然后选择基因功能注释工具，将分析严谨程度设为中等，注释群集降序排列，选取P﹤0.05的结果进行生物学过程、分子功能及信号转导通路聚类分析。
2 结 果 2.1 miR-335序列保守性miRBase中查找人，以及大鼠、小鼠、家犬等共12个物种的miR-335成熟序列，对比序列表明miR-335在这12个物种中高度相似，miR-335在物种间具有高度的保守性(表 1)。
| 序列号 | 名称 | 碱基序列 |
| MIMAT0000575 MIMAT0000765 MIMAT0000766 MIMAT0006624 MIMAT0008104 MIMAT0009291 MIMAT0012942 MIMAT0013955 MIMAT0035059 MIMAT0036147 MIMAT0006274 MIMAT0036618 | rno-miR-335 hsa-miR-335-5p mmu-miR-335-5p cfa-miR-335 ptr-miR-335 bta-miR-335 eca-miR-335 ssc-miR-335 efu-miR-335 chi-miR-335-5p tch-miR-335-5p mml-miR-335-5p | UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAU UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUG UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUG |
从GEO中获得的5个miRNA表达谱芯片数据集，分别为肝癌(GSE31383)、肺癌(GSE48414)、乳腺癌(GSE38167)、肝内胆管癌(GSE53870)、脂肪肉瘤(GSE45364)，使用QOE3.0分析数据集，生成基因主成分分析图(PCA图)和miR-335在肿瘤组织及其癌旁组织表达量箱图。结果显示，5个数据集导入QOE3.0后PCA图中两组基因混在一起，没有差异，设定P＜0.05、q＜0.01，两组差异表达基因分离开来(图 1)。miR-335的表达水平在5种肿瘤组织中均存在差异表达，且表达水平均为下调，差异有统计学意义(图 2、表 2)。
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| 图 1 miRNA表达谱芯片数据集两组比较过程的PCA图 Fig. 1 PCA map of miRNA expression profiling data set with the two group comparisonA: Liver cancer(GSE31383); B: Lung cancer(GSE48414); C: Breast cancer(GSE38167); D: Intrahepatic cholangiocarcinoma(GSE53870); E: Liposarcoma(GSE45364) |
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| 图 2 miR-335在不同肿瘤组织中的表达 Fig. 2 The expression of miR-335 in different tumor tissues(a) Liver cancer(GSE31383) (b) Lung cancer(GSE48414) (c) Breast cancer(GSE38167) (d) Intrahepatic cholangiocarcinoma(GSE53870) (e) Liposarcoma(GSE45364) |
| 疾病(数据集) | 差异倍数 | p值 | 表达水平 |
| 肝癌(GSE31383) | 0.32 | 0.001 6 | 下调 |
| 肺癌(GSE48414) | 0.07 | 2.7×10－4 | 下调 |
| 乳腺癌(GSE38167) | 0.19 | 4.1×10－4 | 下调 |
| 肝内胆管癌(GSE53870) | 0.93 | 0.001 0 | 下调 |
| 脂肪肉瘤(GSE45364) | 0.58 | 0.027 0 | 下调 |
用DIANA-microT、PicTar、miRDB和TargetScan在线预测miR-335靶基因，预测靶基因数目分别为166个、137个、251个和2 308个，取交集得到8个基因；在miRecords中查询经双荧光素酶报告基因实验、Western blot、q-PCR实验验证的miR-335靶基因共15个；PubMed中查阅相关文献，经证实的miR-335靶基因20个。取三者结果并集共34个基因作为后期分析的基因集合(表 3)。
| miR-335靶基因预测或查找 | 基因集合 |
| 在线网站预测的靶基因 | ZMPSTE24、HOXD8、ATP1B1、ETF1、MAP2、UBE2G1、FMR1、RSBN1 |
| 经实验验证的靶基因 | TNC、MERTK、PTPRN2、SOX4、ARPC5L、RASA1、RB1、UBE2F、RUNX2、BCL2L2、TFF2、MAPK1、LRG1、DAAM1、BIRC5 |
| 文献报道的靶基因 | GRM4、ROCK1、MET、BCL2L2、SP1、PAX6、POU5F1、FMR1、ZEB2、RBBP8、FMNL3、FMN2、DAAM2、BIRC5、MAPK1、LRG1、RB1、SOX4、PTPRN2、MERTK |
| 靶基因并集 | ZMPSTE24、HOXD8、ATP1B1、ETF1、MAP2、UBE2G1、FMR1、RSBN1、TNC、MERTK、PTPRN2、SOX4、ARPC5L、RASA1、RB1、UBE2F、RUNX2、BCL2L2、TFF2、MAPK1、LRG1、DAAM1、LOC728519、GRM4、ROCK1、MET、SP1、PAX6、POU5F1、ZEB2、RBBP8、FMNL3、FMN2、DAAM2 |
在DAVID中，对miR-335的34个靶基因进行生物学过程、分子功能的富集聚类分析，结果分成9个注释集群，主要涉及细胞分裂、迁移、凋亡和转录调控、激酶活性调控、蛋白磷酸化及蛋白质分子连接、细胞骨架组成等生物学过程和分子功能(表 4)。KEGG信号通路分析显示miR-335靶基因集合主要参与了轴突向导和黏着斑激酶信号通路、黑素瘤疾病信号通路及TGF-β信号通路(表 5)。
| 类别 | GO功能注释 | 基因数量(%) | P值 | 涉及基因 |
| MF | Enzyme binding | 8(23.5) | 5.5×10－5 | MAPK1、 FMNL3、 ROCK1、 SP1、 RB1、 DAAM1、 DAAM2、 RASA1 |
| MF | Rho GTPase binding | 4(11.8) | 5.74×10－5 | FMNL3、ROCK1、DAAM1、DAAM2 |
| MF | GTPase binding | 5(14.7) | 6.10×10－5 | FMNL3、ROCK1、DAAM1、DAAM2、RASA1 |
| MF | Ras GTPase binding | 4(11.8) | 7.71×10－5 | FMNL3、ROCK1、DAAM1、DAAM2 |
| BP | Actin cytoskeleton organization | 5(14.7) | 0.002 | FMN2、FMNL3、ROCK1、DAAM1、DAAM2 |
| BP | Cell division | 4(11.8) | 0.029 | FMN2、ROCK1、RB1、RASA1 |
| BP | Regulation of apoptosis | 6(17.6) | 0.034 | MAPK1、GRM4、ROCK1、SOX4、BCL2L2、RASA1 |
| MF | Transcription factor activity | 8(23.5) | 0.002 | HOXD8、SP1、POU5F1、PAX6、SOX4、ZEB2、RB1、RUNX2 |
| BP | Regulation of RNA metabolic process | 10(29.4) | 0.017 | HOXD8、SP1、POU5F1、PAX6、SOX4、ZEB2、RB1、RUNX2、RASA1、RBBP8 |
| BP | Positive regulation of cellular biosynthetic process | 6(17.6) | 0.019 | MAPK1、SP1、PAX6、SOX4、RB1、RUNX2 |
| BP | Regulation of transcription from RNA polymerase II promoter | 6(17.6) | 0.024 | HOXD8、SP1、PAX6、RB1、RUNX2、RBBP8 |
| BP | Regulation of transcription,DNA-dependent | 9(26.5 | 0.042 | HOXD8、SP1、POU5F1、PAX6、SOX4、ZEB2、RB1、RUNX2、RBBP8 |
| BP | Cell migration | 4(11.8) | 0.025 | ROCK1、MET、PAX6、ZEB2 |
| MF | Transcription factor activity | 8(23.5) | 0.002 | HOXD8、SP1、POU5F1、PAX6、SOX4、ZEB2、RB1、RUNX2 |
| BP | Regulation of RNA metabolic process | 10(29.4) | 0.017 | HOXD8、SP1、POU5F1、PAX6、SOX4、ZEB2、RB1、RUNX2、RASA1、RBBP8 |
| BP | Regulation of transcription from RNA polymerase II promoter | 6(17.6) | 0.024 | HOXD8、SP1、PAX6、RB1、RUNX2、RBBP8 |
| MF | Transcription regulator activity | 8(23.5) | 0.026 | HOXD8、SP1、POU5F1、PAX6、SOX4、ZEB2、RB1、RUNX2 |
| BP | Positive regulation of MAP kinase activity | 3(8.8) | 0.023 | GRM4、MET、ZEB2 |
| BP | Protein amino acid phosphorylation | 6(17.6) | 0.017 | MAPK1、GRM4、ROCK1、MET、MAP2、MERTK |
| BP | Phosphorus metabolic process | 7(20.6) | 0.021 | MAPK1、GRM4、ROCK1、PTPRN2、MET、MAP2、MERTK |
| KEGG通路 | 基因数(%) | P值 | 涉及基因 |
| Axon guidance | 4(11.8) | 0.007 | MAPK1、ROCK1、MET、RASA1 |
| Melanoma | 3(8.8) | 0.020 | MAPK1、MET、RB1 |
| Focal adhesion | 4(11.8) | 0.023 | MAPK1、ROCK1、TNC、MET |
| TGF-beta signaling pathway | 3(8.8) | 0.030 | MAPK1、ROCK1、SP1 |
本研究通过生物信息学方法发现miR-335序列在物种间具有高度保守性，提示miR-335在物种进化和调控靶基因中可能起关键作用。然后使用QOE3.0分析多种肿瘤的miRNA表达谱芯片数据，发现miR-335在肝癌、肺癌、乳腺癌、肝内胆管癌和脂肪肉瘤等肿瘤中表达异常，提示miR-335可能与肿瘤的发生发展相关。在已有的文献报道中，miR-335被普遍认为是一个抑癌基因[13]，在食道癌、胃癌、上皮性卵巢癌等肿瘤组织中低表达[14, 15, 16]，QOE3.0分析miR-335在5种肿瘤组织中的表达均为下调，提示miR-335表达量低可能是肿瘤发生发展的重要因素之一。有研究表明，miR-335在乳腺癌组织中低表达[5]；亦有研究表明，miR-335在早期乳腺癌组织中高表达[17]。而我们分析的数据集GSE38167中则包含了31例早期三阴性乳腺癌，miR-335表达水平与23例正常组织相比为低表达。提示miR-335在乳腺癌中的表达情况可能与乳腺癌亚型分类和分期有关，还需进一步的实验验证。同时，除GEO数据库中已公开的miRNA表达谱芯片数据和文献报道经实验验证的相关肿瘤外，miR-335在其他肿瘤中的表达情况，其表达水平与肿瘤分型分期的关系也需要进一步研究。
DAVID对miR-335靶基因集合的生物信息分析发现，MAPK1、ROCK1、MET等基因参与了细胞侵袭、迁移等多个细胞进程，与蛋白磷酸化过程相关，并涉及TGF-β等多个信号转导通路。已有研究表明，miR-335下调靶基因MET表达，从而降低肝细胞生长因子HGF引起的MET磷酸化作用。负向调控HGF/c-Met通路，最终抑制乳腺癌细胞迁移[18]。miR-335 靶向下调TGF-β非经典通路中的基因ROCK1和MAPK1，降低下游通路蛋白，特别是马达蛋白肌球蛋白轻链MLC磷酸化水平，从而抑制人神经母细胞瘤细胞的侵袭和迁移[19]。文献报道的miR-335与其靶基因在肿瘤中的作用机制与本研究中分析的靶基因功能、通路分析基本一致。
GO分析显示MAPK1、ROCK1、SOX4、BCL2L2等基因参与调控细胞凋亡，MAPK1和SP1都是形成肌动蛋白成核剂的家庭成员，参与细胞迁移、侵袭和转移等过程[20, 21]，也有研究表明，在胰腺癌中SOX4可在转录水平调控SEMA3/Plexin家族成员并促进肿瘤生长[22]。miR-335调控靶基因BCL2L2和SP1表达，促进卵巢癌细胞凋亡[8]。GO分析中，HOXD8、SP1、POU5F1、PAX6、SOX4、ZEB2、RB1等多个miR-335靶基因涉及转录调控。有文献报道，miR-335通过调节内胚层转录因子梯度从而促进中外层的隔离[23]。但miR-335在肿瘤中的转录水平调节作用机制还有待探索。
综上所述，miR-335在肿瘤中的作用不容忽视，现有研究报道，miR-335与其靶基因在肿瘤中的调控作用与本研究中的结果基本相符，生物信息学分析具有可靠性。同时，有众多靶基因未得到实验验证，其功能和相关信号转导通路也有待进一步研究。本研究中 miR-335靶基因GO分析和KEGG通路分析结果表明，miR-335还涉及了蛋白质分子连接、细胞骨架组成等多个生物学过程和分子功能，参与了轴突向导和黏着斑激酶信号通路、黑素瘤疾病信号通路。这些分析为后期深入研究miR-335在肿瘤中的调控机制提供了方向和思路。
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