过氧化物氧还酶(peroxiredoxin，Prdxs)家族是新近发现的一类非硒依赖性过氧化物酶，在各种生物体内分布广泛。目前，根据保守Cys不同，Prdxs家族共有6个成员，其中，Prdx1-5为同一种类型，为2-Cys类；Prdx6为1-Cys类^[1]。1990年研究人员在牛眼睫状体中首次发现了Prdx6蛋白，称为非硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶^[2]。由于该蛋白质的1-Cys酶特性，曾被称为抗氧化蛋白2、p67吞噬细胞氧化酶结合蛋白、KGF调节基因1等。

Prdx6为双功能蛋白，具有过氧化物酶及磷脂酶A2活性，在不同pH，表现出不同的活性，在pH为4时，磷脂酶A2活性最大；在pH为7时，过氧化物酶活性最高^[3]。基于Prdx6的过氧化物酶活性，有研究表明，Prdx6蛋白与机体的一些疾病相关。王燕等^[4]研究表明，抗氧化酶 Prdx6可以保护 AECⅡ抵抗H₂O₂诱导的细胞凋亡，是其作为抗氧化酶的主要功能之一。体外的细胞实验证明，Prdx6可以通过减少磷脂氢过氧化物(PL-OOH)来抵抗肺囊性纤维化病中的氧化作用^[5]。此外，Prdx6还对骨髓造血干细胞有促分化作用，并且修复由阿糖胞苷引起的骨髓造血干细胞损伤^[6]。关于Prdx6的磷脂酶A2活性，该蛋白质可以通过释放花生四烯酸及调节IL-1来调节TNF-α诱导细胞凋亡的过程^[7]。通过对转基因过表达Prdx6小鼠的观察，发现Prdx6的磷脂酶A2活性可导致β淀粉样蛋白增多，从而促进阿尔兹海默病的发生^[8]。

最新的研究表明，Prdx6不仅可以通过其过氧化物酶活性来调节细胞内活性氧含量，保护细胞免受氧化应激的损伤，同时还可以通过过氧化物酶活性和磷脂酶A2活性来促进肿瘤的生成和生长。Yun等^[9]通过向裸鼠内移植过表达Prdx6的肺癌细胞，发现肿瘤的大小和重量增加量要远大于非过表达组，证明Prdx6高表达可以促进肺癌细胞的增殖。Alexandra等^[10]在对黑色素瘤的研究中发现，在一些黑色素瘤中Prdx6出现高表达，进一步的研究表明，Prdx6可通过提高黑色素瘤中花生四烯酸依赖的脂质信号来促进黑色素瘤的生长。此外Prdx6还在Ⅱ型糖尿病发病过程中发挥着关键性的调节作用^[11]。

目前，Prdx6的其他作用正在逐渐被发现，本课题组前期利用布鲁氏菌强弱毒株感染小尾寒羊，并在不同时间段采集血样^[10]，通过组建布鲁氏菌感染羊白细胞层抑制性消减杂交 cDNA文库，发现Prdx6基因差异表达^[11]，为了更好研究该蛋白质的功能，本研究基于多克隆抗体制备技术制备了兔源抗小鼠Prdx6多克隆抗体，为之后的研究提供支持。

小鼠巨噬细胞系Raw264.7由本实验室保存，复苏培养备用。实验用家兔购于长春生物制品所，实验用动物购自长春生物制品所。

分子克隆技术使用的试剂盒购于Axygen公司，蛋白质纯化试剂购于美国GE公司，羊抗兔二抗购于博士德生物工程有限公司。

采用Triozol法提取RNA，RT-PCR方法获得cDNA，以获得的cDNA为模板PCR扩增Prdx6基因。

引物设计：分别设计Nde Ⅰ和Hind Ⅲ(以下划线所示)两个酶切位点。

上游引物：5′-CGCCATATGATGCCCGGAGGGTTGC TTCT-3′

下游引物：5′-CCCAAGCTTTTAAGGCTGGGGTGTA TAACGGAGGTA-3′

采用HIFI Hotstar高保真酶扩增，扩增条件为：95℃预变性3min，98℃变性20s，68℃退火30s，72℃延伸50s，32个循环，72℃终止反应3min。产物1%琼脂糖凝胶电泳分离回收，－20℃保存。

将纯化后的基因与PET-28a载体用NdeⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切，双酶切体系按照内切酶说明书进行，37℃水浴5h，产物1%琼脂糖凝胶电泳回收。回收产物采用solution Ⅰ进行连接，连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,挑取阳性克隆进行PCR鉴定和基因测序。载体命名为PET-28a-Prdx6。

取测序正确的菌种接种于含0.1%卡那霉素的5ml LB培养基中，180r/min，37℃培养过夜。接种过夜的菌液2~200ml至含0.1%卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当菌液OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为1mmol的IPTG诱导目的蛋白表达，继续培养6~8h，收集菌体，制样，10% SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达。鉴定为可表达的菌种重新接种进行诱导大量表达，跑12% SDS-PAGE电泳，电泳胶转移至膜转移缓冲液(39mmol/L Glycine、48mmol/L Tris、0.037% SDS、20% 甲醇)中，200mA电流中转膜2h，5%脱脂奶粉(溶于TBST)封闭1h，洗膜(TBST Buffer)3次，每次10min。抗His标签一抗稀释4 000倍(5%脱脂奶粉)，37℃孵育1h，洗膜3次同上，羊抗鼠IgG二抗稀释4 000倍，常温摇床孵育1h，洗膜4次，每次10min，ECL显色。

采用MCO(金属离子催化氧化实验)检测，该体系可以氧化超螺旋结构质粒,以此体系验证重组蛋白的过氧化物酶活性。 50μl体系：7mmol/L磷酸盐缓冲液，150mmol/L NaCl，3μmol/L FeCl₃,5mmol/L DTT，以上体系混合配制好待用。配制好的体系中加入6.25~24μg重组蛋白、BSA代替Prdx6作为对照组。 混合体系与不同浓度蛋白质混合，37℃孵育2h，加入300ng PCMV- Script质粒37℃孵育1h，0.8%琼脂糖凝胶电泳45min，检测质粒氧化程度。

实验动物采用雌性成年家兔，以重组蛋白混合弗氏佐剂进行免疫。步骤如下：一免将1mg重组蛋白与等体积的完全弗氏佐剂混合均匀，对家兔进行背部多点免疫。一免后两周将1mg重组蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂混合均匀，对家兔进行背部多点免疫进行二免。两周后以同样方法(二免)进行三免。三免后一周耳缘静脉采血，3 000r/min离心5min，收集血清，ELISA方法检测效价，达到要求后，进行心脏采血，大量收集血清。

以纯化后的Prdx6重组蛋白为底物包被酶标板，浓度为5μg/ml，每孔100μl，4℃包被过夜。以PBST洗液洗涤3次后，加入0.1mol/L NH₄Cl,每孔100μl，37℃封闭1h。PBST清洗3次，加入不同稀释倍数的多抗(分别400倍、800倍、1 600倍、3 200倍、6 400倍、12 800倍、25 600倍、51 200倍稀释)，每孔100μl，37℃孵育1h。PBST清洗3次后，羊抗兔酶标二抗稀释4 000倍，每孔100μl，37℃孵育1h。PBST清洗4次，加入底物，37℃孵育15min，加入50μl终止液终止反应，利用酶标仪在492nm处读数。

利用Western blot检测多克隆抗体与重组蛋白、天然蛋白的特异性。天然蛋白来源于小鼠巨噬细胞系RAW264.7,24孔细胞培养板中加入200μl RIPA细胞裂解液(含1mmol/L PMSF)，漩涡震荡，12 000r/min离心1min后取上清液。重组蛋白与天然蛋白分别制样，Western blot检测多克隆抗体与两者的特异性。

从小鼠巨噬细胞系RAW264.7中提取的RNA进行反转录后获得cDNA，以cDNA为模板对Prdx6基因进行PCR扩增，得到一条略小于750bp的条带，产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测(图 1)，切胶回收进行纯化。胶回收产物与PET-28a质粒同时进行双酶切，连接后构建重组表达载体，酶切进行鉴定(图 2)。重组质粒测序验证,序列正确。

图 1 鼠Prdx6基因RT-PCR扩增检测 Fig. 1 Amplification of mouse Prdx6 by RT-PC M:DNA Marker DL2000;1：Products of mouse Prdx6 by RT-PCR

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图 2 重组载体的双酶切鉴定 Fig. 2 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestionM:DNA Marker DL5000；1：Identification of recombinant plasmid PET-28a-Prdx6 by double enzyme digestion

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表达菌诱导后SDS-PAGE电泳显示，诱导6h后，可大量表达分子质量约为27kDa大小的蛋白质，菌体破碎后发现该蛋白质以可溶形式存在于超声上清液中，以超声上清液跑SDS-PAGE电泳，Western blot检测，结果该蛋白质与His单抗可以发生特异性反应(图 3)。纯化后蛋白质目的条带单一，大小正确(图 4)。

图 3 重组Prdx6蛋白诱导表达及鉴定 Fig. 3 The induction expression and identification of the recombinant protein Prdx6M1:Prestained protein ladder;1:The Western blot analysis of the recombinant protein;2:The induction expression of the plasmid PET-28a;3，4:The induction expression of the recombinant plasmid PET-28a-Prdx6;M2:Protein marker

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图 4 纯化重组蛋白SDS-PAGE电泳 Fig. 4 SDS-PAGE of the purified recombinant preoteinM:Protein marker;1:The purified protein;2:The upper liquid after bacterial cell disruption;M:Protein marker

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通过配制MCO(金属离子催化氧化实验)体系，加入不同浓度重组蛋白，37℃孵育1h，0.8%琼脂糖凝胶电泳1h分析结果，可见重组蛋白对质粒的超螺旋结构具有一定的保护作用，且在浓度为0.16mg/ml时保护作用较好(图 5)。

图 5 重组蛋白活性分析 Fig. 5 The activity analysis of recombinant protein1:The plasmid in a phosphate buffer;2:The plasmid with MCO system;3:The plasmid with BSA(0.2mg/ml) with MCO system as a control;4~6:The plasmid with recomninant Prdx6 protein(0.08mg/ml,0.16mg/ml,0.32mg/ml)with MCO system.NF:Nick form of the plasmid;SF:Supercoiled form of the plasmid

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二免、三免采集血清，ELISA方法检测血清抗体效价，抗原包被浓度为0.5μg/ml，正常兔血清作为阴性对照，结果显示二免血清在稀释25 600倍时，P/N=2.71，三免血清在稀释105时，P/N=5，可判断为阳性，表明在三免后，血清中抗体灵敏度极高。

三免后一周对家兔进行心脏采血，收集血清，0.22μm滤膜过滤后，利用蛋白质G抗体纯化柱纯化，10ml血清上柱，洗脱后获得了较高浓度纯化后的抗体。纯化获得的多抗SDS-PAGE电泳可见到清晰的抗体重链与轻链(图 6)。

图 6 多克隆抗体纯化紫外吸收图谱和纯化后抗体SDS-PAGE电泳图 Fig. 6 The UV absorption spectrum of the polyclonal antibody in purification and the SDS-PAGE of the purified polyclonal antibody1:The serum;2:The flowthrough liquids;3:The purified polyclonal antibody;4:Protein marker； The purification apparatus is KTA purifier 100

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纯化后的多抗，Western blot检测其对重组蛋白和天然蛋白的结合能力。重组蛋白为本实验表达的重组蛋白，检测时多抗稀释10 000倍使用，天然蛋白取自小鼠巨噬细胞系RAW264.7，细胞裂解液裂解细胞后，震荡，离心，取上清液制样，检测时多抗稀释5 000倍。结果表明，多抗与重组蛋白和天然蛋白均可结合，且特异性好，无非特异性条带(图 7)。此外，还对羊重组Prdx6、羊血清白蛋白、猪血清白蛋白进行了分析，结果表明，多抗对羊重组和天然蛋白均有反应，对猪天然蛋白无结合。

图 7 多抗检测重组蛋白、天然蛋白Western blot分析 Fig. 7 The Western blot analysis of the recombinant protein and native protein with polyclonal antibody M：Prestained protein ladder;1:Recombinant protein;2:Native protein

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Prdx6为双功能蛋白质，既有过氧化物酶活性，又有磷脂酶A2活性，这使得其在机体抗氧化保护及肺表面活性物质代谢过程中发挥重要作用。随着对Prdx6研究的深入，研究人员揭示了更多该蛋白质的过氧化物酶活性参与的生理活动，对Prdx6有了更全面的认识。

多数情况下，机体受到外源微生物的入侵，会启动免疫应答，抗原提呈细胞分解提取抗原后，形成MHC-抗原复合体，抗原信息提呈可以引起巨噬细胞的富集，巨噬细胞将微生物吞噬，利用细胞内的ROS，溶酶体酶等清除入侵的微生物以达到保护机体的目的。布鲁氏菌作为一种胞内寄生菌，进入巨噬细胞后，细胞也可以通过增加胞内活性氧、抗菌肽及溶酶体酶等来杀灭布鲁氏菌^[12]。但布鲁氏菌多数生物型本身含有H₂O₂酶、超氧化物歧化酶(SOD)等针对细胞内活性氧的酶^[13]，使得巨噬细胞对布鲁氏菌的清除能力降低，少量布鲁氏菌可以定位到内质网上，进行复制，达到一定的数量后，会裂解细胞，释放到细胞外，感染其它巨噬细胞，使机体受到严重的损伤。

Prdx6是一种重要的抗氧化酶，其过氧化物酶活性可以调节细胞内过氧化物含量，以达到维持细胞内活性氧平衡及清除入侵微生物的作用。在细菌感染时，细胞受到刺激产生一系列的细胞因子，如IL-4、TNF-α等，这些细胞因子可以调控Prdx6的表达，从而改变细胞内活性氧含量^[14]。有研究表明，布鲁氏菌强弱毒株感染绵羊后，绵羊体内Prdx6的表达出现一定的差异，强毒株布鲁氏菌感染后，Prdx6并未如预期一样下调，增加胞内ROS含量来清除布鲁氏菌，而是出现了明显的表达上调^[15]，这使得我们猜测：布鲁氏菌可能会调控宿主细胞内源性Prdx6的表达，为自己创造更易于存活的环境。

本实验针对细胞内源性过氧化物酶Prdx6，从小鼠巨噬细胞系RAW264.7内提取RNA,反转录得到cDNA后，扩增小鼠Prdx6基因，并连接PET-28a构建原核表达载体，获得可溶性表达、且具有良好活性的小鼠Prdx6重组蛋白，通过多克隆抗体制备技术制备了特异性好、灵敏度高的抗小鼠Prdx6多克隆抗体，为之后对细胞内的Prdx6进行检测，更好地研究Prdx6在细胞内及应对外界细菌感染所发挥的作用提供支持。