鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国最为常见的头颈部恶性肿瘤，尤其以广东省最为常见，年发病率高达54.7/10万^[1]，因此也被称为“广东瘤”。虽然近年来鼻咽癌的诊断、治疗有了很大发展，大大提高了患者的5年生存率，但是远处转移和放化疗无效已成为鼻咽癌治疗失败的主要原因^[2]。除了传统治疗方案外，鼻咽癌肿瘤干细胞研究将有可能成为突破点，因此，研究新的多靶点抗肿瘤药物对鼻咽癌的治疗具有重要临床意义。

白花地胆草(Elephantopus mollis H.B.K)属于菊科地胆草属植物，产于福建、台湾和广东沿海地区，并在各热带地区有广泛分布，白花地胆草具有清热解毒，凉血利水，以及抗菌消炎的功效，在民间可治疗癌症、骨折、腹痛、痢疾和蛇虫咬伤等^{[3, 4]}。药理学和化学成分研究表明，其所含化学成分类型比较多，而咖啡酰奎宁酸类衍生物和倍半萜内酯类是其主要活性成分^[5]。近几年，白花地胆草抗肿瘤活性研究成为热点，其有效成分可以抑制小鼠黑色素瘤细胞中黑色素原的生成^[6]，诱导肝癌HepG2细胞Caspase-3介导的细胞凋亡^[7]，提高人非小细胞肺癌细胞NCI-H23和乳腺管癌细胞T-47D抗氧化能力^[8]等。

本课题组前期采用MTT追踪白花地胆草中抗肿瘤活性成分，从白花地胆草中分离出25种单体，筛选出其中抗肿瘤效果明显的活性单体，并进一步以具有代表性分子结构的化合物EM-3作为候选化合物，见图 1。经文献检索，尚未有EM-3单体抗肿瘤作用机制的报道。本研究目的在于探究EM-3对人鼻咽癌CNE2细胞的抗肿瘤作用机制，并为EM-3进入动物和临床研究提供实验依据。

图 1 EM-3单体的化学结构 Fig. 1 The chemical structure of EM-3 monomer

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白花地胆草活性单体EM-3为本课题组库存分子。CNE2、CNE2-S18(人高侵袭、高转移鼻咽癌)细胞和L02(人正常肝脏细胞)由中山大学肿瘤防治中心提供，xIAP、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Met、p-Met、Stat3、p-Stat3、Cyclin D1、Cyclin B1、Mcl-1、Oct4、Sox2一抗均购自美国Cell Signaling Technology，MMP2和MMP2购自Santa Cruz Biotechnology，MTT购自美国Sigma公司，Hoechst33342购自Sigma-Aldrich公司，FTC购自Merck公司，Annexin V-FITC/PI双染试剂盒购自上海罗氏生物科技有限公司。

CNE2、CNE2-S18和L02细胞用RPMI-1640培养液(含有10% FBS)于37℃、含5% CO₂的恒温培养箱中常规培养。每两天更换新鲜培养液，细胞融合度达到80%时，用0.25%胰酶消化传代。

取对数生长期的细胞加入96孔板中，每孔100μl细胞悬液，细胞密度3 000个/孔，培养24h。细胞贴壁后加入不同浓度的药物100μl，每组设4个平行孔，置于培养箱培养24h、48h、72h，实验终止前4h每孔加入10μl 5g/L MTT试剂，再孵育4h，弃去上清液，每孔加入100μl DMSO，待结晶溶解后在酶联检测仪上检测570nm波长下每孔的OD值，并计算细胞增殖率。

细胞的相对增殖率(P％)：P％ = OD实验组/ OD阴性对照组×100%

分别取对数生长期的CNE2和CNE2-S18细胞，胰酶消化，用RPMI-1640培养液重悬，接种于6孔板中(600个细胞/孔)，每设置2个复孔，设DMSO对照组(与最高浓度药物等体积)和加药组，置于37℃、含5% CO₂的恒温培养箱中，培养14天后弃去上清液，用PBS小心浸洗2遍，加入75%乙醇固定30min，吸去固定液后，适量2%结晶紫染色30min后，冲洗、干燥、拍照。

克隆形成率=克隆数/接种数×100%

取对数生长期的CNE2细胞接种于12孔板(10⁵个/ml)，培养24h后，用200μl的移液器枪头在每孔中央纵轴和横轴方向各划出一条创伤区域。PBS洗去漂浮细胞后，换成无血清培养液，设DMSO对照组(与最高浓度药物等体积)和加药组，每组3个复孔，置于37℃、含5% CO₂的恒温培养箱，在0h和24h分别在倒置相差显微镜下观察并拍照。

取对数生长期的CNE2细胞接种于6孔板，24h后加入不同浓度的EM-3，对照组加入DMSO(与最高浓度药物等体积)，48h后收集细胞，1 200r/min，离心5min，弃去上清液，PBS洗1遍，弃去PBS，用残留的PBS吹匀细胞，加入900μl/孔 75%乙醇，固定过夜。1 200r/min，离心5min收集细胞，PBS洗2遍后重悬细胞加入含RNase A(终浓度50μg/ml)和PI(终浓度50μg/ml)的1ml PBS中，避光室温放置10min后，细胞筛网过滤细胞，在流式细胞仪上进行细胞周期测定。

取对数生长期的CNE2细胞接种于6孔板，24h后加入不同浓度的EM-3，并设DMSO(与最高浓度药物等体积)对照组。48h后收集细胞，1 200r/min，离心5min，弃去上清液，PBS洗1遍，加入500μl Binding Bufffer悬浮细胞，加入5μl Annexin V-FITC、5μl PI，混匀，避光，室温放置15min，在流式细胞仪上进行细胞凋亡测定。

培养足够CNE2-S18细胞，消化离心，1 000r/min离心5min，弃去上清液，PBS洗1遍，用2% FBS PBS重悬细胞，用细胞筛网过滤成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞至浓度为10⁶个/ml，取1ml单细胞悬液至15ml离心管中，加入1μl FTC Fumitremorgin(阳性对照)至终浓度5μg/ml，5min后加入Hoechest 33342 (2.5mg/ml) 2μl/ml，孵育90min，每隔10min混匀一次。将剩下的单细胞悬液分装至50ml离心管，加入Hoechst 33342 (2.5mg/ml) 2μl/ml，孵育90min，每10min混匀一次。离心，PBS重悬细胞，用细胞筛网过滤成单细胞悬液。将细胞悬液分装至无菌有盖流式管中，置冰上，避光，在流式细胞超速分选仪上进行SP细胞分选。

CNE2细胞用不同浓度的EM-3作用24h后，冷PBS洗2遍，加入细胞裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)冰上裂解15min，12 000r/min，4℃离心15min，吸取上清液至新的EP管，BCA法测定蛋白质浓度。取适量蛋白质上样至常规胶电泳，转膜，封闭。一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3遍，10min/遍，二抗室温孵育2h，TBST洗膜3遍，10min/遍。化学发光显色，曝光，显影洗片，扫描仪扫描。

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，数据均以均数±标准差(x± s)表示，结果采用三次独立实验，P ＜0.05为统计学有显著性差异。

MTT细胞活性实验表明，EM-3对CNE2细胞增殖抑制作用呈现浓度和时间依赖性，即在相同作用浓度下，细胞活力随着药物浓度的增加而逐渐降低；在相同作用时间下，细胞活力随着作用时间的增加而逐渐降低，见图 2(a)。同时，EM-3作用CNE2-S18细胞48h也出现显著抑制并呈浓度依赖性，在15μmol/L和30μmol/L作用显著，而且对人正常肝脏细胞活力无显著抑制效果，见图 2(b)。

图 2 EM-3对鼻咽癌CNE2和CNE2-S18细胞增殖抑制效果 Fig. 2 Inhibitory effect of EM-3 on the proliferation of CNE2 cells(a)CNE2 cells were treated with EM-3 at the indicated concentration for 24h and 48h and 72h (b)Cell viability was presented in L02,CNE2 and CNE2-S18 cells

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EM-3作用于CNE2和CNE2-S18细胞14天，与DMSO对照组相比，随着药物浓度增加，细胞克隆数显著减少，并且克隆体积显著变小(^* P＜0.05)。当药物浓度为2μmol/L时，CNE2细胞克隆几乎完全被抑制，而对于高侵袭、高转移CNE2-S18细胞克隆也有显著抑制作用(^*P＜0.01)，见图 3。

图 3 EM-3对CNE2和CNE2-S18细胞克隆形成能力的影响 Fig. 3 Effect of EM-3 on CNE2 and CNE2-S18 colony formation ability

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与DMSO对照组比较，不同浓度EM-3(4μmol/L、8μmol/L)处理CNE2细胞24h，细胞迁移能力减弱，并呈现浓度依赖性。如图 4所示，8μmol/L处理细胞24h后细胞迁移能力显著被抑制。

图 4 EM-3对CNE2细胞迁移能力的影响 Fig. 4 The effect of cell migration ability after EM-3 treatment in CNE2 cells

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运用AnnexinV-FITC/PI双染法检测凋亡细胞，将CNE2细胞暴露于不同浓度的EM-3(2.5μmol/L、5μmol/L、30μmol/L)24h，EM-3在5μmol/L处理时，CNE2细胞中早晚期细胞凋亡率从对照组的1.3%增加至10.7%，而在30μmol/L处理后，CNE2细胞中早晚期凋亡率增加至72.1%。结果显示，随着药物浓度增加，凋亡细胞数逐渐增加，见图 5。

图 5 流式细胞术检测EM-3诱导CNE2细胞凋亡 Fig. 5 Apoptosis was analyzed with treatment EM-3 using flow cytometry in CNE2 cells

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流式细胞仪PI单染色显示，不同浓度的EM-3作用于CNE2细胞后，随浓度增加，G₁期细胞比例逐渐减少，S期细胞比例变化不大，G₂/M 期比例逐渐增加。G₂期细胞比例从对照组的7.64%增加至56.35%，提示EM-3诱导G₂/M期阻滞，见图 6。

图 6 流式细胞术检测EM-3对细胞周期影响 Fig. 6 Cell cycle was analyzed with treatment EM-3 using flow cytometry in CNE2 cells

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EM-3作用于CNE2-S18细胞24h后，流式细胞术检测其中肿瘤干细胞样SP细胞的比例。结果显示，与对照组(79.9%)比较，EM-3在15μmol/L浓度时能显著降低CNE2-S18肿瘤干细胞样SP细胞比例(34.9%)，见图 7。也就是说，EM-3能有效降低CNE2-S18肿瘤干细胞样SP细胞干性。

图 7 EM-3对CNE2-S18干细胞样SP细胞的抑制作用 Fig. 7 Inhibitory effect of EM-3 on CNE2-S18 stem-like SP cells

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细胞凋亡是基因控制的细胞自主的有序的死亡，包括外源性细胞凋亡(TNFR介导)、内源性细胞凋亡(Bcl家族、ROS、DNA 损伤等介导的线粒体凋亡)和内质网压力(ER stress)介导细胞凋亡。其中，内源性细胞凋亡会引起Caspase-9和Caspase-3切割活化，并导致下游多聚ADP核糖聚合酶PARP蛋白酶切失活，最终使细胞死亡。本研究发现，不同浓度EM-3处理CNE2细胞48h，Caspase-9切割活化，Caspase-3总量表达减少，PARP出现酶切条带，证明EM-3诱导CNE2细胞发生了内源性凋亡。

我们检测了Bcl-2蛋白家族：抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax。Western blotting结果表明，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax表达增加，二者比值显著降低，同时，我们发现凋亡抑制蛋白xIAP表达减少，进一步证明了EM-3诱导活化内源性细胞凋亡。以上蛋白质表达变化均具有EM-3浓度依赖性。

为确定细胞凋亡上游通路的调控机制，我们检测了与此相关的重要信号通路，发现EM-3处理CNE2细胞24h，Stat3信号通路被抑制，随着药物浓度的增加，p-Stat3表达水平下降，并且Stat3通路下游蛋白Mcl-1、Cyclin D1、Bcl-2表达均下降，表明EM-3通过抑制Stat3信号通路而诱导内源性细胞凋亡，见图 8和图 9。

图 8 Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白表达变化 Fig. 8 The expression of apotosis-related proteins of CNE2 cell detected by the Western blotting

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图 9 Western blotting检测Stat3信号通路蛋白表达变化 Fig. 9 The expressing of Stat3 signaling pathway of CNE2 cell detected by Western blotting

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流式细胞周期分析发现，EM-3处理细胞可提高G₂期细胞比例，提示CNE2细胞发生G₂期阻滞，为了进一步验证EM-3使得CNE2细胞发生G₂周期阻滞，我们检测了G₂/M期转化调控点促进因子Cyclin B1、G₁/S期转化调控点促进因子Cyclin D1。结果显示，Cyclin B1表达增加而Cyclin D1表达下降，见图 10。结果证明，EM-3导致CNE2细胞阻滞在G₂期。

图 10 Western blotting检测Cyclin D1、Cyclin B1蛋白表达变化 Fig. 10 The expressing of Cyclin D1,Cyclin B1 of CNE2 cell detected by Western blotting

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基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)可以降解细胞外基质的所有成分，打破细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)和基底膜所形成的屏障，进而促进肿瘤细胞向周围组织侵袭和转移。而MMP2和MMP9是公认的与肿瘤侵袭和转移关系最紧密的IV胶原酶，我们用不同浓度的EM-3处理CNE2细胞24h，Western blotting结果显示，MMP9表达显著下降，MMP2在EM-3相对低浓度时表达出现应急性上升，高浓度时表达下降。同时，我们发现p-Met表达水平也显著降低，提示EM-3降低了ECM和基底膜的降解及p-Met的表达，导致CNE2细胞的迁移力和侵袭力降低。

图 11 Western blotting检测Met、p-Met、MMP2、MMP9蛋白表达变化 Fig. 11 The expression of Met,p-Met,MMP2 and MMP9 of CNE2 cell detected by Western blotting

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Oct4和Sox2对维持干细胞，诱导成体多能干细胞的形成有重要作用。为了进一步探究EM-3降低CNE2-S18细胞中干细胞样SP细胞比例，我们检测了Oct4和Sox2在EM-3处理24h后的蛋白质表达变化。结果表明，EM-3能显著抑制Sox2蛋白的表达，但Oct4在EM-3相对低浓度(2μmol/L)时出现应急性表达增高，随着浓度增大，Oct4表达水平出现降低趋势。结果提示，EM-3更加倾向于降低Sox2干细胞样蛋白的表达。

图 12 Western blotting检测Oct4、Sox2蛋白表达变化 Fig. 12 The expression of Oct4 and Sox2 of CNE2 cell detected by Western blotting

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白花地胆草(Elephantopus mollis H.B.K.)为菊科地胆草属植物，又名牛舌草，主要分布于华南和西南等热带地区，如福建、广东等地，目前，临床上主要用于治疗扁桃体炎、感冒、肝炎、毒疮等疾病。实验研究表明，白花地胆草的提取物对肺癌、神经细胞瘤、黑色素瘤等细胞增殖和迁移均有一定抑制效果，但其作用机制尚不明确^{[9, 10]}。

EM-3是本课题组从白花地胆草乙醇提取物中提取的一种单体成分，本实验结果表明EM-3能够显著抑制鼻咽癌细胞增殖和迁移，并导致癌CNE2细胞凋亡和G₂/M期阻滞。同时，超速流式分选细胞仪结果表明，EM-3可以显著降低CNE2-S18肿瘤干细胞样SP细胞的比例，有效降低CNE2-S18肿瘤干细胞样SP细胞干性。

细胞周期G₂检验点可在DNA损伤条件下阻止细胞进入M期，给损伤细胞以充分的修复时间，因此来维持细胞基因组稳定性^[11]。然而，这个过程需要细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent protein knase，CDK)来调控。Cyclin B1是G₂期的周期蛋白，与CDK1可形成复合物，促使细胞G₂/M期转变^[12]。本研究发现，EM-3可以显著提高鼻咽癌细胞G₂期比例，并发现Cyclin B1蛋白累积，说明细胞被阻滞于G₂/M期。

细胞凋亡是基因控制的细胞自主的有序的死亡，包括外源性细胞凋亡(TNFR介导)、内源性细胞凋亡(Bcl家族、ROS、DNA 损伤等介导线粒体凋亡)和内质网压力介导细胞凋亡。其中，内源性细胞凋亡主要通过Bcl-2家族蛋白调节，引起Caspase-9和Caspase-3切割活化，并导致下游多聚ADP核糖聚合酶PARP蛋白酶切失活，最终细胞死亡^{[13, 14, 15]}，而凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein，IAP) 是细胞凋亡过程中的重要调控因子，通过负向调节 Caspase家族的活性来达到抑制细胞凋亡的效果^[16]。

Stat3是信号转导与转录激活因子家族的重要组成部分，p-Stat3是其活化形式，近年来成为备受关注的肿瘤治疗靶标^[17]。研究表明，Stat3是肿瘤细胞发生、发展的重要蛋白质，作为转录因子家族的一员，其下游转录产物在肿瘤细胞增殖、生存、侵袭、转移和血管生成方面发挥重要调控作用^[18]。Stat3的持续活化被证实是肿瘤耐药的重要原因，也成为临床抗肿瘤治疗的新靶点^[19]。本研究发现，EM-3诱导CNE2细胞发生内源性凋亡的原因是抑制了Stat3的活性，因此，Stat3的下游转录产物Bcl-2、Mcl-1等表达降低，这样Bcl-2与Bax形成二聚体能力下降，进而解除Bcl-2抑制Bax的作用。当Bax形成同源二聚体后，使得线粒体Cytochrome C释放，进而引起下游Caspase家族级联活化反应，诱导细胞凋亡^[20]。本研究结果表明EM-3通过抑制Stat3通路诱导内源性细胞凋亡。

基质金属蛋白酶可以降解细胞外基质的所有成分，打破ECM和基底膜所形成的屏障，进而促进肿瘤细胞向周围组织侵袭和转移^[21]。而MMP2和MMP9是公认的与肿瘤侵袭和转移关系最紧密的IV胶原酶，研究发现鼻咽癌、直肠癌、肝癌和乳腺癌的侵袭转移能力与MMP2和MMP9的活性密切相关^{[22, 23, 24]}。c-Met与肿瘤细胞移动性、浸润力能力关系紧密^[25]，本研究发现EM-3降低了ECM和基底膜的降解及p-Met表达，导致CNE2细胞的迁移力和侵袭力降低，其中，MMP2在EM-3相对低浓度时表达出现应急性上升，高浓度时表达下降，由EM-3所造成的这种低浓度应急性表达上调的机制仍需进一步研究。

肿瘤干样细胞(cancer stem-like cell，CSLC)是指具有干细胞特征的一群细胞，即SP细胞(side population cell)，也被称为“侧群细胞”，并对传统放化疗耐受，导致肿瘤侵袭和转移^[26]。本研究采用Hoechst染料外排实验经超速流式分选出SP细胞，并发现EM-3可以显著降低CNE2-S18中肿瘤干细胞样SP细胞的比例，并通过Western blotting验证EM-3可以降低Sox2表达，而对于EM-3在低浓度时所造成的Oct4表达上调，可能是由于细胞在受到药物刺激后所造成的应急性表达，其上游调控机制仍需要进一步研究。

本文通过多种方法证实EM-3能抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移能力，并且对抑制的分子机制做了初步探讨。发现EM-3能促进鼻咽癌细胞CEN2凋亡，细胞内抗凋亡蛋白水平降低而促凋亡蛋白表达水平增加，同时EM-3能影响Stat信号通路导致其下游蛋白质表达水平发生改变。此外，EM-3阻滞细胞周期，并能显著降低CNE2-S18肿瘤干细胞样SP细胞比例，而且相关的蛋白质表达水平在EM-3处理后都发生了改变。本文实验设计合理，研究工作有助于EM-3作为抗鼻咽癌药物的研究和开发。

致谢 本研究受到暨南大学科研培育与创新基金跃升计划(11615424)资助。