抗菌肽是一类生物体产生的具有抗菌作用的小肽类物质，是宿主第二防线的重要组成成分。在真核生物的天然免疫系统中扮演重要角色，是哺乳动物进化过程中被保留的有效的免疫成分^{[1, 2]}。通常作用于细菌，随着研究的深入，其对真菌、病毒乃至癌细胞均表现出了较强的抑制作用，甚至可以有效作用于那些对常规药物表现出抗药性的病原微生物，因此得到了广泛的关注^[3]。近年来，抗菌肽在畜牧业^[4]、食品业^[5]及医疗领域^[6]也逐渐得到了应用，有望成为抗生素的理想替代品。鉴于此，科研工作者大力从事其研究开发。迄今，已有多种抗菌肽从原核生物到有机生物体中得以成功分离并分类^{[7, 8]}。尽管如此，抗菌肽在生产实践中还是面临诸多问题，最重要的是安全性问题，许多天然抗菌肽具有较高的溶血活性和细胞毒性，限制了其在生产实践中的应用。因此，基于抗菌肽的结构和功能，对其进行定向的设计和改造从而得到安全的新型改良型抗菌肽，是亟待解决的关键问题^[9]。Yang等^[10]通过用Leu来替代疏水性较小的氨基酸，用Lys逐步取代α螺旋结构表面的中性和酸性氨基酸残基来增加或减少疏水性，得到的新型抗菌肽基因表现出更高的生物学活性。而杂合肽P18具有cecropin A的阳离子N端及magainin-2的两亲性C端，表达产物除具有抗菌活性外还表现出抗黑色素瘤功能^[11]。由于毕赤酵母(Pichia pastoris)在异源蛋白表达时可实现蛋白翻译后加工及修饰、产物可分泌、适于高密度发酵等诸多特点而备受青睐，其中pGAPZαA载体，可实现产物的分泌表达，而GAP启动子因其具有安全性高、转录率高和简便的操作从而得到了越来越多的关注与应用^[12]，尤其在表达抗菌肽时，利用该启动子可避免甲醇的引入，更为后续抗菌肽产品的安全应用提供了保证。

本研究以家蝇抗菌肽CecMd和中国林蛙抗菌肽Chensirin作为母体肽，以选择毕赤酵母偏爱密码子为原则，设计6条杂合肽，采用重叠延伸PCR法合成实验所需的基因，通过基因工程手段，来完成杂合抗菌肽基因在毕赤酵母SMD1168中的高效表达，并对其抑菌活性和溶血活性进行了测定，以期得到具有抗菌活性高，溶血活性低的表达产物，为新型杂合抗菌肽的研发和应用提供思路及理论基础。

表达载体pGAPZαA与宿主菌SMD1168由黑龙江八一农垦大学食品学院保存，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌和卷曲乳杆菌由本实验室保存。

AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒和AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒均购于美国Axygen公司，2×Taq MasterMix购于北京康为世纪生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker与感受态制备试剂盒购于TaKaRa公司；T4 DNA连接酶、AvrII购于美国NEB公司；标准蛋白Marker购自美国Thermo公司；博莱霉素(Zeocin)购自美国Invitrogen公司；胰蛋白胨、酵母培养物购自OXOID公司；丙烯酰胺和 N,N′-亚甲双丙烯酰胺购自Amresco公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris-base、N，N，N′，N-四甲基乙二胺(TEMED)、尿素等均购自Sigma公司，其余试剂为分析纯。

本研究以选择毕赤酵母偏爱密码子为原则，并在序列两端添加XhoI和XbaI限制性内切酶位点和保护性碱基。XhoI和序列前端之间添加Kex2酶切位点，序列末端和XbaI位点之间添加终止密码子，用来除去后续的标签，保证杂合抗菌肽的天然活性。每个基因两对引物，分别为F1R1、F2R2…F12R12，并采用SOE-PCR的方法(两次PCR)合成所需要的目的基因。反应体系：2×Taq MasterMix 25μl，上游引物F12μl，下游引物R1 2μl，双蒸水 21μl，体积共计50μl。反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环之后72℃终延伸2min。产物回收后连接至pUC57载体。引物(未列出)委托北京六合华大基因科技有限公司合成。

将合成的目的基因片段和表达载体pGAPZαA分别经Xba I和Xho I进行双酶切，利用DNA凝胶回收试剂盒回收相应目的片段，并用T4 DNA Ligase处理，4℃过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃振荡培养1h后，涂布于低盐LB培养基(含有25μg/ml Zeocin)，37℃恒温培养至形成单菌落。阳性菌落分别经PCR鉴定及测序鉴定正确后用于下一步实验。

将上一步验证正确的重组表达质粒经AvrII线性化处理后与80μl的SMD1168感受态细胞混匀，并采用电击转化的方式使其整合到酵母基因组中，将电击转化液涂布于YPD抗性平板(含100μg/ml的zeocin)30℃恒温培养2~4天，将长出的阳性单菌落挑取到含有500μg/ml Zeocin的YPD平板上筛选高抗性转化株，空载体作相同处理。采用酵母基因组提取试剂盒提取其高抗性转化株的基因组，并以其为模板，根据Invitrogen公司提供的5′AOX1 和3′AOX1 为引物，检测目的基因在毕赤酵母基因组中的整合情况。将验证正确的重组菌株用于下一步的表达实验。

将上一步验证正确的重组菌株接种到5ml YPD液体培养基中，30℃ 230r/min振荡，过夜培养。按1%接种到50ml YPD液体培养基中培养，72h后12 000r/min离心10min，收集培养上清液，进行Tricine-SDS-PAGE检测^[13]。

将杂合工程菌的表达上清液通过Mini超滤系统50kDa膜分离，分离液过G50层析柱后进行液相分离。取3μl分析级HPLC分析粗品，流动相是水和乙腈，进行30min的梯度洗脱。首先将HPLC用含95%的水和5%乙腈的起始梯度平衡10min。然后注入准备好的样品，反应时间为40min，收集从检测器中出来的样品。最后用25%的水和75%的乙腈混合液清洗30min。收集的样品送上海淘普生物科技有限公司进行质谱检测。

采用琼脂孔穴扩散法来初步检测表达产物的抗菌活性及抗菌谱。供试菌株包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌。使用平板稀释法将上述各处于对数生长期的菌株悬浮液稀释为10⁸个/μl，将其按1%接种到适宜的固体培养基中，混匀后倒置平板。待平板冷凝后，用高压灭菌处理的打孔器打孔，向每孔中分别滴加20μl液体。37℃恒温培养过夜后，观察杂合抗菌肽的抑菌情况。以空载体上清作为阴性对照。

将上述各测试菌株及短乳杆菌、德氏乳杆菌和卷曲乳杆菌3种有益菌的单菌落接于各自适宜的培养基中，37 ℃、200 r/min空气震荡培养过夜，并分别稀释至2×10⁵~7×10⁵ CFU/ml。将6条杂合抗菌肽分级稀释为：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.5625 mg/ml共计8个梯度。将稀释好的测试菌液分别滴加到96孔培养板中，每行的1~12孔，每孔50 μl，并滴加50 μl的杂合抗菌肽。每个样品设3个重复，于37 ℃，100 r/min恒温培养过夜，490 nm下用酶标仪测定其吸光度。

采用Nomura等^[14]的方法通过测定血红素的释放量来探索抗菌肽的溶血活性。将浓度为2%的新鲜绵羊血红细胞悬浮液与0.1ml测试杂合抗菌肽混合均匀，使抗菌肽的浓度为100、50、25、12.5μg/ml，于37℃温育1h，2000r/min离心10min。将上清液转移至96孔板，在570nm下测定吸光值。使用无菌的生理盐水和0.1%(v/v)的Triton-100作为溶血百分比0%和100%的标准。每个样品设定3个平行，取其平均值。溶血率(%)=(试验管吸光度－阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度)×100%。

通过SOEing PCR法以4条引物合成杂合抗菌肽目的基因。第一次PCR后得到相应的延伸液，经1% Agarose gel电泳检测如图 1、图 2所示，分别在56bp、58bp、64bp、68bp、71bp、67bp、68bp、70bp、74bp、76bp、82bp、68bp处出现清晰的条带。第二次PCR后得到相应的目的基因，经1%Agarose gel电泳检测如图 3、图 4所示，分别在94bp、112bp、115bp、118bp、130bp、130bp处出现清晰的条带，与目的基因大小一致，即为所需的杂合抗菌肽基因。产物回收后与pUC57载体连接，连接产物送至北京六合华大基因科技有限公司测序，测序结果表明连接正确。

图 1 第一次PCR产物电泳 Fig. 1 The electrophoresis chart of the first PCR 1:DNA marker; 2: F1R1 56bp; 3: F2R2 58bp; 4: F3R3 64bp; 5: F6R6 67 bp; 6: F4R4 68 bp; 7: F7R7 68 bp; 8: F8R8 70 bp; 9: F5R5 71 bp; 10: F9R9 74 bp; 11: F10R10 76 bp

图选项

图 2 第一次PCR产物电泳(续) Fig. 2 The electrophoresis chart of the first PCR 1: DNA marker; 2: F11R11 82bp; 3: F12R12 68bp

图选项

图 3 全基因扩增后的琼脂糖凝胶电泳 Fig. 3 The electrophoresis chart of full sequence 1: DNA marker; 2: Hybrid antimicrobial peptide CC22 94bp; 3: Hybrid antimicrobial peptide CC28 112 bp; 4: hybrid antimicrobial peptide CC29 115 bp

图选项

图 4 全基因扩增后的琼脂糖凝胶电泳 Fig. 4 The electrophoresis chart of full sequence 1: DNA marker; 2: Hybrid antimicrobial peptide CC30 118 bp; 3: Hybrid antimicrobial peptide CC34(1)130 bp; 4: Hybrid antimicrobial peptide CC34 130 bp

图选项

6条重组表达载体构建好后分别以5′AOX1 和3′AOX1 为引物，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测可知，分别在相应位置出现单一的目的条带，与理论值相一致，如图 5所示。进一步经测序验证，结果正确。

图 5 重组表达载体质粒的PCR鉴定 Fig. 5 The identification of recombinant expression vector with PCR 1: DNA marker; 2: pGAPZαA; 3: pGAPZαA/ CC22 598 bp; 4: pGAPZαA/ CC28 616 bp; 5: pGAPZαA/CC29 619 bp; 6: pGAPZαA/ CC30 621 bp; 7: pGAPZαA/CC34(1) 634 bp; 8: pGAPZαA/CC34 634 bp

图选项

经验证正确的重组转化菌株在YPD培养基中经摇瓶培养72h，离心收集培养上清液进行Tricine-SDS-PAGE分析，见图 6。由图 6可知，6株重组菌株在毕赤酵母SMD1168中均获得表达，目的蛋白分别位于2.3kDa、3.1kDa、3.2kDa、3.0kDa、3.4kDa和3.7kDa处，与预期结果相符。

图 6 6条杂合抗菌肽的Tricine-SDS-PAGE分析 Fig. 6 Tricine-SDS-PAGE analysis of six hybrid antimicrobial peptides 1: Supernatant of CC22 2.3kDa; 2: Supernatant of CC28 3.1 kDa; 3: Supernatant of CC29 3.2 kDa; 4: Supernatant of CC30 3.0 kDa; 5: Supernatant of CC34(1)3.4 kDa; 6: Supernatant of CC34 3.7 kDa; 7: Protein marker

图选项

6条杂合抗菌肽的分泌蛋白过高效液相色谱仪纯化分离目的蛋白的氨基酸序列，其结果如图 7所示。CC22和CC29的出峰时间低于10min，纯度分别高达95.61%和93.55%，CC28、CC30和CC34的出峰时间在10~11min之间，纯度分别高达93.67%、92.17%和95.96%，CC34(1)的出峰时间略高于11min，纯度高达96.13%。由此可知，蛋白的纯化程度均达到85%以上，可进一步进行质谱分析，分析结果表明分子量大小与理论值一致。

图 7 上清液高效液相色谱分析结果 Fig. 7 Hybrid antimicrobial peptides expression supernatant

图选项

抑菌圈法可从定性的方面来初步检测抗菌肽是否具有抗菌活性，6条杂合抗菌肽对致病菌的抑菌结果如图 8所示，由此可知，6条杂合抗菌肽中CC29对大肠杆菌和鸡沙门氏菌表现出较明显的抑制作用，CC34则对3种供试菌表现出较微弱的抑制作用，而空载体上清和其余抗菌肽则没有表现出抑菌作用。可通过最小抑菌试验进一步验证。

图 8 杂合抗菌肽对致病菌的抑菌效应 Fig. 8 The antibacterial activity of hybrid antibacterial peptide against pathogenic bacteria A: Escherichia coli B: Salmonella gallinarum C: Staphylococcus aureus 1: Supernatant of pGAPZαA/SMD1168; 2: Water; 3: CC22; 4: CC28; 5: CC29; 6: CC30; 7: CC34(1); 8: CC34

图选项

最小抑菌浓度是从定量的角度来分析抗菌肽对待供试菌株的抑菌能力，结果见表 1，由表可知，CC29对大肠杆菌和鸡沙门氏菌的MIC均为25μg/ml，CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为50μg/ml，CC34(1)对大肠杆菌体现出较弱的抑菌活性，其MIC值为100μg/ml。这一数据也对2.5节中的结果做了更直观的补充说明。此外，还检测了抗菌肽对3种有益菌的抑菌效应，由结果可知，各条抗菌肽对供试的3种有益菌均没有表现出抑菌作用。

由表 2可知，6条杂合抗菌肽对绵羊红细胞均有较弱的溶血活性，且随着浓度的升高溶血活性有所提高。当浓度为12.5μg/ml时，杂合抗菌肽即表现出较低的溶血活性，其中CC22、CC28和CC30的溶血活性最低，显著低于其它抗菌肽(P<0.05)，CC29、CC34(1)居中，两者均显著低于CC34(P<0.05)；当浓度为25μg/ml时，CC22、CC30的溶血活性最低，显著低于其它抗菌肽 (P<0.05)，CC29与CC34(1)次之，显著低于CC28(P<0.05)和CC34(P<0.05)，CC34杂合抗菌肽的溶血活性显著高于其它抗菌肽(P<0.05)；浓度为50μg/ml时，杂合抗菌肽CC30和CC22的溶血活性均较低，显著低于其它抗菌肽(P<0.05)，CC28、CC29、CC34(1)间无显著差异(P>0.05)，均显著低于CC34(P<0.05)；当浓度为100μg/ml时，依然是杂合抗菌肽CC34的溶血活性最高，达到3.56%，显著高于其他杂合抗菌肽(P<0.05)，其次为CC28，与CC34(1)无显著差异，但显著高于其它抗菌肽(P<0.05)，CC29与CC22、CC34(1)无显著差异，但显著高于CC30(P<0.05)，溶血活性最低的是CC30，仅为0.70%。

抗菌肽因其独特的作用机制及抗菌效应，备受科研工作者的关注。家蝇抗菌肽是自身免疫体系的重要组成成分，在一定程度上对原虫、细菌、病毒、肿瘤等均有抑杀作用，且作用机理独特^[15]。中国林蛙皮肤的分泌液中含有大量的生物活性物质，对原核生物、真菌及病毒等均有抑杀作用，而对真核生物的作用较小^{[16, 17, 18]}。然而天然抗菌肽常常因其自身存在的溶血活性与细胞毒性，在生产实践中受到了严重限制，因此，以天然抗菌肽为基础，对其进行适当的改造设计，是获得新型抗菌肽的重要途径之一^[19]。更值得关注的是，在保留这些天然抗菌肽活性片段的同时对其重新设计后获得的新型抗菌肽往往具有更高的杀菌活性及选择性^[20]。Silva等^[21]将Lactoferrampin和Lactoferricin利用该技术拼接得到的Lfchimer，其产物对利士曼原虫有杀伤作用。Zhang等^[22]将抗菌肽Maginin 2的N-端和Cecropin A进行拼接，得到了新的杂合肽，其产物没有表现出溶血活性同时对细菌起到了抑制作用。本研究以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为参照，保留其重要活性功能序列，调整个别氨基酸残基，同时兼顾毕赤酵母偏爱密码子的原则，设计出了新型杂合肽。新型抗菌肽序列因缺乏模板因此不能利用常规PCR进行扩增，而重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术通过采用具有互补末端的引物，使其PCR产物形成重叠链，并以此为模板进行后续的延伸，从而将来源不同的扩增片段重叠拼接起来得到所需的目的基因，该方法在获得新型抗菌肽目的基因方面也多次得到了成功应用。

由于抗菌肽本身具有抗菌作用，若直接采用原核表达系统，表达产物常常对宿主细胞产生反馈抑制作用，进而影响其进一步表达。毕赤酵母作为真核表达体系，不会产生内毒素，更适合于抗菌肽的表达。Hsu等^[23]构建了pGAPZαA-HD5，成功表达了抗菌肽alpha-defensin 5。本研究将合成好的基因连接至毕赤酵母表达载体pGAPZαA，成功实现了6条杂合抗菌肽的表达，并且GAP启动子的应用，避免了甲醇的添加，为后续杂合抗菌肽规模化的安全生产及应用提供了保证。

本研究设计合成的6条杂合抗菌肽中，CC29对大肠杆菌和鸡沙门氏菌具有较强的抑菌作用，CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑制效应，CC34(1)对大肠杆菌也表现出较弱的抑制作用，而其余杂合肽在供试菌范围内没有表现出相应的抑菌活性。尽管每条杂合抗菌肽在前期设计时经过软件预测都有抑菌的潜力，但可能是在大量的设计过程中母体肽链的结构受到影响，导致理论预测与实验真实结果之间存在一定差距，由此也可看出抗菌肽抑菌试验的必要性。本研究除了探讨杂合抗菌肽对致病菌的抑菌作用外，还研究了其对有益菌的影响，结果显示，各条杂合肽对供试的3种有益菌均没有表现出抑菌作用。原因可能是构建好的杂合抗菌肽的线性功能区域形成了靶向体，而靶向体则起着识别特定微生物的作用，当环境中存在多种微生物时，抗菌肽与致病性微生物的靶向体相连接，则进一步形成多目标特异性靶向抗菌肽，此时，该类抗菌肽便可特异性地同时作用于多种有害微生物，而对有益菌却不产生影响^{[24, 25]}，从而提高抗菌肽的特异性，如链球菌、金黄色葡萄球菌等介导的抗菌肽具有特定靶功能域^[9]，这对维持动物胃肠道菌群平衡及健康方面具有重要的意义。

本研究将设计好的6条杂合抗菌肽基因通过SOE-PCR技术经两次扩增合成所需要的基因，成功连接到毕赤酵母表达载体pGAPZαA，将其线性化处理后电转入SMD1168中，构建好的杂合抗菌肽基因工程菌均得以成功表达，表达产物均呈现出较低的溶血活性，其中具有抗菌活性的CC34、CC34(1)和CC29这3条杂合肽的溶血活性以CC29最低，而CC29、CC34对致病菌的抑菌效果相对较强，且对有益菌没有表现出抑菌作用，可作为新型杂合抗菌肽进一步深入研究和规模化生产应用。