月桂酰基赖氨酸，商品名Amihope-LL，被称为天然润滑剂。它属于生物表面活性剂中的氨基酸型表面活性剂，是适合化妆品应用的新型功能性粉体，具有生物降解性和极高的安全性、稳定性^[1]。该类表面活性剂的合成可采用化学合成法、生物催化法及两者结合的方法^[2]，目前，工业生产Nε-月桂酰基-L-赖氨酸主要以化学合成法为基础^[3]。其制备方法有酐盐酰化工艺、酰胺羰基化工艺、酰氯缩合工艺及酸盐缩合工艺等。应用最多的是脂肪酰氯与氨基酸缩合反应工艺^{[4, 5, 6, 7]} 。然而化学方法合成工艺复杂，并且使用有机溶剂，增加了环境的负担^[8]。相比之下采用酶催化合成法反应条件温和，副产物少，减轻了环境压力^[9]。2005年，Kｏｒｅｉｓｈｉ等^[10]、Wａｄａ等^[11]采用来源于Streptomyces mobaraensis的赖氨酸酰化酶(Sm-ELA)在水溶液中以赖氨酸盐酸盐和月桂酸为底物催化合成ε-月桂酰-L-赖氨酸，这是一种非常简单和节能的合成方法，不需要使用任何有机溶剂，并且产物在水中溶解性极低，易分离。因此，采用Sm-ELA酶催化法合成Nε-月桂酰基-L-赖氨酸，是一种很有应用前景的替代方法^{[10, 11]}。

本研究以来源于链霉菌的赖氨酸酰化酶Sm-ELA为研究对象，优化并合成该酶基因，采用大肠杆菌为表达宿主，分别将其表达在胞内和展示在细胞外膜，并对其表达效果及其催化合成月桂酰赖氨酸的效率进行比较，可为采用大肠杆菌表达赖氨酸酰化酶及其在水相中催化合成月桂酰赖氨酸的深入研究提供借鉴。

实验所用引物由南京金斯瑞公司合成； CloneEZ PCR Cloning Kit购自南京金斯瑞公司；限制性内切酶购于NEB公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶和2000、15000DNA Marker购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒、DNA片段纯化与胶回收试剂盒购于上海申能博彩有限公司；月桂酸和赖氨酸购自南京晚晴化玻仪器有限公司；月桂酰赖氨酸购自湖北鑫源顺医药化工有限公司。

高效液相色谱；紫外分光光度计；高速低温离心机；PCR仪。

大肠杆菌菌株E. coli BL21(DE3)为本实验室保藏，质粒pET-28a(+)和pTrc99a为本实验室保藏，重组质粒pET28a-SmELA和pTrcOmpXK₁₂₂SmELA为赖氨酸酰化酶基因的表达质粒。

大肠杆菌LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉与氯化钠均为5 g/L；TB自诱导培养基：蛋白胨15 g/L，酵母粉25 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖2 g/L，乳糖3 g/L。

在数据库National Center for Biotechnology Information(NCBI)上检索到Sm-ELA的氨基酸序列 (BAH59036)。 密码子优化后的Sm-ELA基因片段由南京金斯瑞公司合成，直接克隆到pET-28a(+)的Nde I和Xho I酶切位点间，得到重组质粒pET28a-SmELA。

P1：5′-GGAATTCATGAAAAAAATTGCATGTCTTTCA-3′

P2：5′-GCTCTAGATTTGTAGGTCGGGTATTCAGTGGT-3′

其中P1带有EcoR I酶切位点，P2带有Xba I酶切位点。

根据SmELA基因序列和CloneEZ PCR Cloning Kit的引物设计原理合成引物如下：

P3：5′-TACCCGACCTACAAATCTAGAATGTCCGAACGTCCGCGCACGAC-3′

P4：5′-TGCCTGCAGGTCGACTCTAGATTATGCGGCATACACGGTAC-3′

P3和P4均带有Xba I酶切位点。

以W3110基因组为模板，用引物P1和P2 PCR扩增基因片段OmpXK₁₂₂。PCR反应在50 μl体系中进行，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，54.5℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。将获得的OmpXK₁₂₂片段及表达质粒pTrc99a用EcoR I和Xba I 限制性内切酶进行双酶切反应，酶切产物回收纯化后进行连接，连接液转化到E. coli Trans1-T1感受态细胞，经酶切鉴定得到的阳性克隆送南京金斯瑞公司测序确认，获得质粒pTrcOmpXK₁₂₂。

以pET28a-SmELA质粒为模板，用引物P3和P4进行PCR扩增，得到Sm-ELA基因片段。采用CloneEZ 试剂盒将Sm-ELA基因亚克隆到质粒pTrcOmpXK₁₂₂，将其转化到E.coli Trans1-T1中，经酶切鉴定的阳性克隆送南京金斯瑞公司测序确认，进而得到重组质粒pTrcOmpXK₁₂₂SmELA。

将分别带有重组质粒pET28a-SmELA和pTrcOmpXK₁₂₂SmELA的E. coli BL21(DE3)菌株分别在含有kan和Amp抗性的LB平板上划线，37℃培养约12 h，挑取单菌落到LB培养液中，37℃ 振荡培养。种子液按1%的接种量转接于100 ml带有相应抗性的新鲜LB培养液中，37℃、200 r/min培养，当菌体OD₆₀₀为0.6时加入1 mmol/L IPTG，在30℃进行诱导。分别在诱导3、5、7h取样，室温6 000 r/min离心10 min收集菌体，用10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)悬浮洗涤后备用。

将带有重组质粒pET28a-SmELA的E. coli BL21(DE3)菌株诱导表达，并将菌体洗涤后重悬于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，冰浴超声破碎细胞，4℃、12 000 r/min离心20 min，得到上清即为粗酶液，将粗酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳实验和酶催化实验。

赖氨酸酰化酶Sm-ELA的活性检测以4 mmol/L N-乙酰赖氨酸为底物，在50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行反应，温度为37℃。以1 h内生成赖氨酸的微摩尔数作为一个酶活单位。生成的赖氨酸含量用茚三酮显色法检测^[7]。

反应在100 mmol/L Tris-HCl缓冲液中进行，总体系为100 ml(50 mmol/L赖氨酸、10 mmol/L月桂酸、40 mg粗酶蛋白)，磁力搅拌，反应温度为37℃。分别在反应1、2、5、9、24 h取样，反应液用高效液相色谱(HPLC)进行分析。

将带有pTrcOmpXK₁₂₂SmELA质粒的E. coli BL21(DE3)菌株诱导表达，收集菌体，重悬于50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中。全细胞催化反应在10 ml体系(100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)中进行，加入终浓度为50 mmol/L赖氨酸、10 mmol/L月桂酸以及约相当于2.4 g菌体干重的菌液，反应温度为37℃，反应24 h取样，样品－20 ℃保存待TLC及质谱分析。

薄层色谱TLC^[12]: 以V(正丁醇)∶V(水)∶V(冰醋酸)= 4∶1∶1的混合溶剂为展开剂,采用薄层色谱对反应液各成分进行分离分析,按照V(反应液)∶V(展开剂)=1∶1处理样品，样品混合后12 000 r/min离心5 min，将各层物质分别点样；用展开剂配制0.5 g/L月桂酰赖氨酸标品。

液相色谱HPLC^[10]:色谱柱：YMC-Pack C8 A-202 column (4.6mm i.d.×150mm,YMC,Kyoto,Japan)；流动相A为100%甲醇，流动相B为含有0.1%甲酸的水溶液，用80%的A相洗脱；流速为0.5 ml/min；柱温：40℃；检测波长：210 nm。

用Nde I和Xho I双酶切pET28a-SmELA质粒，分别在1.6 kb和5.3 kb处有两条清晰的条带，如图 1所示，与预期结果一致，并经测序确认pET28a-SmELA质粒构建无误。

图 1 酶切pET28a-SmELA鉴定 Fig. 1 Enzyme digestion of pET28a-SmELA 1: Plasmid pET28a-SmELA; 2: Enzyme digestion of pET28a-SmELA ; 3: DNA Marker KB ladder

图选项

OmpX是大肠杆菌外膜蛋白，该蛋白通过β-折叠在大肠杆菌外膜形成四个环状结构，这些环状结构可用来融合外源蛋白，使其锚定在大肠杆菌外膜^[13]。本文选择以C端融合的方式，在OmpX蛋白第122位氨基酸的位置融合SmELA蛋白(图 2)。

图 2 pTrcOmpXK122SmELA构建示意图 Fig. 2 Construction of recombinant plasmid pTrcOmpXK122SmELA

图选项

以W3110基因组为模板，经PCR反应扩增得到片段OmpXK₁₂₂。纯化后的PCR片段用EcoR I和Xba I 双酶切，回收该片段，与同样酶切处理的质粒pTrc99a连接。连接液转化到E. coli Trans1-T1感受态细胞，提取质粒用EcoR I和Xba I进行双酶切验证，酶切结果如图 3所示，重组质粒经酶切后在0.4 kb和4.2 kb的位置有清晰条带，与预期结果一致，表明pTrcOmpXK₁₂₂构建正确。

图 3 pTrcOmpXK122的酶切验证 Fig. 3 Enzyme digestion of pTrcOmpXK122 1: Plasmid pTrcOmpXK122; 2: Enzyme digestion of pTrcOmpXK122; 3: DNA Marker λ-EcoT14

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以pET28a-SmELA质粒为模板，经PCR反应扩增得到SmELA片段，再使用Xba I单酶切pTrcOmpXK₁₂₂质粒，用CloneEZ试剂盒将酶切后的线性质粒pTrcOmpXK₁₂₂与PCR产物进行重组，并转化到E. coli Trans1-T1感受态细胞，提取质粒用BamH I、Nde I对所提的重组克隆菌进行双酶切验证，结果在2.7 kb和3.4 kb位置出现清晰条带，如图 4所示，与预期结果一致，经测序后鉴定为阳性克隆。

图 4 pTrcOmpXK122SmELA的酶切验证 Fig. 4 Enzyme digestion of pTrcOmpXK122SmELA 1: Plasmid pTrcOmpXK122SmELA; 2: Enzyme digestion of pTrcOmpXK122SmELA ; 3: DNA Marker λ-EcoT14

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由重组菌BL21(DE3)/pET28a-SmELA的蛋白电泳图得出(图 5)，泳道1和2均在大约55 kDa处有外源蛋白表达条带，与SmELA分子量一致，说明胞内表达体系中目标蛋白正常表达。

图 5 重组酶SDS-PAGE凝胶电泳图 Fig. 5 SDS-PAGE of recombinant enzymes 1, 2: Recombinant strain of BL21(DE3)/pET28a-SmELA; 3: Protein Marker; 4: Recombinant strain of BL21(DE3)/ pET-28a(+)

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由重组菌BL21(DE3)/pTrcOmpXK₁₂₂SmELA细胞破碎液的SDS-PAGE凝胶电泳图(图 6)可知，泳道2、3、4均在大约70.4 kDa处有外源蛋白表达条带，与OmpXK₁₂₂SmELA分子量一致，说明Sm-ELA已在重组菌BL21(DE3)/pTrcOmpXK₁₂₂SmELA中成功表达；而泳道5作为不含外源基因Sm-ELA的对照，不含有外源蛋白。通过对比泳道2、3、4可知在重组菌处于对数期(培养5 h)时，目标蛋白Sm-ELA表达量最高，并且目标蛋白表达量随培养时间延长而降低。

图 6 重组菌BL21(DE3)/pTrcOmpXK122SmELA SDS-PAGE凝胶电泳图 Fig. 6 SDS-PAGE of recombinant strain of BL21(DE3)/pTrcOmpXK122 1: Protein Marker; 2～4: Recombinant strain BL21(DE3)/pTrcOmpXK122SmELA which cultivate for 5, 9 and 21 h, respectively; 5: Recombinant strain BL21(DE3)/pTrcOmpXK122 which cultivate for 21 h

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对带有重组质粒pET28a-SmELA和pTrcOmpXK₁₂₂SmELA的E. coli BL21(DE3)菌株按1.4.4 节方法进行诱导表达，在不同诱导时间取样。将胞内表达体系重组细胞冰浴破碎得到粗酶液后，测定其催化活性；将表面展示体系菌体重悬于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中后测定菌体的催化活性。

二者对比结果显示，胞内表达体系在诱导3 h时比活力为最高16.01 U/mg，随诱导时间的延长，酶活有所降低(图 7)；表面展示体系在诱导5 h时比活力为最高1.88 mU/OD₆₀₀(相当于9.4 mU/mg)，5 h以后比活力有所降低(图 8)，表面展示体系与胞内表达体系酶活相差较大，可能是由于胞内表达体系所采用的T7启动子较强，所以目的蛋白表达量较高，且表面展示体系中目的蛋白未能全部展示在菌体外膜，从而影响到催化活性。

图 7 胞内表达体系诱导时间对酶活的影响 Fig. 7 Effect of induction time on enzyme activity for intracellular expression system

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图 8 胞外表达体系诱导时间对酶活的影响 Fig. 8 Effect of induction time on enzyme activity for cell surface display system

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由催化反应结果(图 9)可知：带有重组质粒pET28a-SmELA的大肠杆菌胞内表达体系经过1 mmol/L IPTG诱导3 h，收集菌体并经过细胞破碎得到粗酶液，利用该粗酶液进行的催化反应中，赖氨酸浓度为50 mmol/L，月桂酸浓度为10 mmol/L，月桂酸转化率在一定时间范围内随反应时间的延长呈上升趋势，并在催化24 h时转化率达到最高为31.1%。

图 9 不同反应时间月桂酸转化率 Fig. 9 The percent conversions of lauric acid by reaction time

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由全细胞催化结果(图 10)得出：本研究中构建的赖氨酸酰基转移酶表面展示体系经过诱导表达，采用菌体进行转化实验，由反应液薄层色谱图看出，反应液中存在与月桂酰赖氨酸标品位置一致的物质，将薄板对应物质取下进一步做MS分析，分析结果与标品一致，由此说明该催化反应中产生了目标产物月桂酰赖氨酸。

图 10 全细胞催化反应液薄层色谱图 Fig. 10 TLC of whole cell transformation 1～3: The upper, lower and mixture of 24 h reaction liquid; 4~6: The upper, lower and mixture of 48 h reaction liquid; 7: Nε-lauroyl-L-lysine

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本研究成功实现了链霉菌来源的赖氨酸酰基转移酶Sm-ELA在大肠杆菌中的重组表达，并采用重组酶以月桂酸和赖氨酸为底物在水相中催化合成月桂酰赖氨酸。胞内表达重组菌在1 mmol/L IPTG诱导下培养3 h，粗酶液比活达到最高，为16.01 U/mg。在100 ml催化反应体系中，赖氨酸浓度为50 mmol/L，月桂酸浓度为10 mmol/L，粗酶液为0.4 mg/ml，在反应24 h时转化率达到最高为31.1%。

本研究尝试将赖氨酸酰基转移酶SmELA展示到大肠杆菌细胞外。与其他展示系统相比，大肠杆菌DNA转化效率高，所以它能提供更大的展示库，是研究较为成熟的展示体系^[14]。尽管本研究中采用表达展示系统获得的比酶活比胞内表达的情况低，但无需破碎菌体即可进行催化反应，之后也可通过简单离心收集菌体，使生物催化剂可被重复使用。在后续研究中可考虑提高该体系的表达水平，使重组菌外源蛋白的表达水平与菌体生长相协同，进一步提高重组菌全细胞催化合成月桂酰赖氨酸的能力。另外，对该酶的固定化方法进行优选也是有意义的研究方向。