文章信息
- 张英敏, 赵娜, 李勇芳, 孟凡秀, 张琪, 高然朋, 张悦红, 于保锋, 郭睿, 王海龙, 解军, 徐钧
- ZHANG Ying-min, ZHAO Na, LI Yong-fang, MENG Fan-xiu, ZHANG Qi, GAO Ran-peng, ZHANG Yue-hong, YU Bao-feng, GUO Rui, WANG Hai-long, XIE Jun, XU Jun
- PBI-SUR-TK载体靶向介导HSV-TK自杀基因诱导肝癌细胞凋亡
- Targeted Treatment of Hepatoma Using HSV-TK Suicide Gene with The PBI-SUR-TK Vector
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(2): 16-21
- China Biotechnology, 2016, 36(2): 16-21
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160203
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文章历史
- 收稿日期: 2015-08-13
- 修回日期: 2015-08-19
2. 山西医科大学附属山西省肿瘤医院 太原 030013
2. Affiliated Tumor Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030013, China
肝癌是一种我国常见的恶性肿瘤,发生率和死亡率均位于前列。它的治疗手段分为手术治疗,化学药物治疗,放射治疗和生物治疗等[1]。因其他治疗方法存在着或多或少的缺陷,生物治疗近年来日益成为研究的热点[2]。基因治疗因其独特的靶向性在生物治疗中发挥着重要作用。自杀基因治疗作为其中一个研究相对成熟的方向,仍被广泛应用。常用的如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷系统[3]。
肿瘤分子标记物作为特异性物质存在于各种类型的肿瘤中。Survivin基因存在于多种肿瘤组织细胞中,比如乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌等[4],在正常组织中鲜有表达。它的基因表达产物凋亡抑制蛋白,能够抑制细胞凋亡,促进细胞癌化[5]。
本研究初步将Survivin启动子和HSV-TK/GCV系统结合,构建了一种肝癌靶向治疗系统,含Survivin启动子驱动启动的PBI-SUR-TK质粒,它仅在肝癌细胞中特异性表达。前体药物GCV加入后能被特异性表达的胸苷激酶TK磷酸化成毒性物质GCV-TP,它是dGTP的抑制剂[6,7],从而阻断DNA合成,诱导细胞凋亡[8] 。
1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 细胞、质粒及菌株肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海生物化学研究所;正常肝细胞HL-7702由山西医科大学生化实验室保存;PBI-SUR-TK质粒由中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心构建合成;大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物有限公司。
1.1.2 试 剂DMEM培养基,IMDM 培养基和Opti-MEM培养基购自Hyclone公司;进口血清购自GIBCO公司;脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;Trizol试剂购自TaKaRa公司;逆转录试剂盒,PCR所用试剂及200bp DNA ladder购自北京康为世纪生物科技有限公司;TK一抗购自Santa Cruz公司;生物素化兔抗山羊二抗IgG购自北京中杉金桥有限公司;内参一抗和二抗购自北京中杉金桥有限公司;ECL化学发光底物购自武汉博士德生物技术有限公司;CCK8购自日本Dojindo公司;丙氧鸟苷GCV购自湖北科益药业有限公司;流式凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方 法 1.2.1 细胞培养用含10%血清的DMEM培养基和IMDM培养基分别培养HepG2肝癌细胞和HL-7702细胞,每3d换液1次,0.25%胰蛋白酶消化传代,倒置显微镜下观察。
1.2.2 细胞转染将HepG2肝癌细胞和HL-7702细胞分别接种于6孔板中培养,待细胞长到70%~80%汇合时,参照Lipofectanfine 2000说明书进行转染。把培养基更换为无血清的培养基,把脂质体和质粒复合物均匀打入各个孔中,6h后换液更换为含10%血清的培养基继续培养。
1.2.3 提取RNA 检测TK基因表达情况两天后分别取未转染的和转染PBI-SUR-TK质粒的肝癌细胞及肝细胞,用Trizol试剂收集总RNA。然后按照康为反转录试剂盒,反转录为cDNA,以cDNA为模板进行PCR。HSV-TK产物长度330bp,引物序列为: AGCAAGAAGCCACGGAAGT(上游) 、CGATATGAGGAGCCAGAACG(下游) 。内参actin产物长度205bp,引物序列为:TGACGTGGACATCCGCAAAG(上 游) 、CTGGAAGGTGGACAGCGAGG(下游) 。 PCR反应体系:模板1μl,上下游引物各0.5μl,Taqmastermix 10μl,灭菌双蒸水8μl。PCR反应条件:94℃预变性5min ,94℃变性30s,56℃退火30s ,72 ℃延60s,30个循环后,72℃终延伸10min。取10μl产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4 提取蛋白质检测表达情况转染两天后提取细胞总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳,每孔蛋白80μg,然后将蛋白转移到PVDF膜上。膜用含5%脱脂奶粉的PBST封闭2 h,加入TK一抗多克隆抗体(1∶500稀释),4度过夜,PBST洗3次,每次10 min。加入HRP标记的兔抗山羊二抗(1∶5 000 稀释)室温孵育1 h,PBST洗3次,每次5 min。加入化学发光试剂A和B各200μl,Bio-Rad 凝胶成像仪曝光。
1.2.5 CCK8检测细胞抑制率转染HepG2肝癌细胞和肝细胞2d后,用胰蛋白酶消化然后接种于96孔板,每孔接种5 000个细胞,放入37℃,5%CO2 的培养箱培养。待细胞贴壁后,次日分别加入含GCV 0μg,1μg,5μg,10μg,20μg,40μg,60μg,80μg的培养基。培养3天后,观察细胞形态,显微镜拍照。每孔加入10μl CCK8溶液,放入培养箱继续培养3h后,检测450 nm波长处各孔的吸光度值。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡转染肝癌细胞和肝细胞2d后,换用含药物GCV 150μg/ml的培养基,同时设立未转染的肝癌细胞和肝细胞作为阴性对照。培养2d后,PBS洗涤,用胰蛋白酶将细胞消化下来,稀释细胞使其密度为106个/ml。加入Annexin V 和PI,在室温下孵育细胞15min。经过孵育期尽快通过流式细胞仪分析检测细胞凋亡情况。
1.2.7 统计学处理所有数据均经SPSSl6.0进行t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 目的基因在肝癌细胞中的表达构建好的重组质粒转染肝癌细胞HepG2和HL-7702细胞,RT-PCR结果表明目的基因HSV-TK 在HepG2肝癌细胞转染组中成功表达,在330bp处有条带;而未转染组HepG2肝癌细胞和两组HL-7702细胞组RT-PCR未能检测到HSV-TK基因的表达。内参基因在所有组中均有表达,在205bp处均有条带(图 1)。
2.2 TK蛋白的表达TK蛋白表达情况见图 2所示。
2.3 显微镜下观察加药后96孔板细胞形态图 3为加药后96孔板的细胞形态。
2.4 CCK8检测HSV-TK/GCV对肝癌细胞的毒性作用不同浓度的GCV作用于HepG2细胞后,HepG2有明显的凋亡,呈现明显的剂量和时间依赖关系:随着GCV浓度的增高,作用时间的延长,细胞存活率逐渐下降。同时不同浓度的GCV作用于HL7702细胞后,细胞有微弱的凋亡,但总体生长平缓。图 4为加入不同浓度GCV后,CCK8法所测450nm处的吸光度值。
2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪检测细胞凋亡的情况参见1.2.6 节,结果见图 5。
3 讨 论常见的自杀基因系统有两大类,分别为CD/5-FC系统和HSV-TK/GCV系统。前者是因为存在于某些细菌和真菌中的胞嘧啶脱氨酶基因(CD)的产物CD酶能催化胞嘧啶转化为尿嘧啶,使无毒性的5氟胞嘧啶转化为细胞毒性5氟尿嘧啶,从而使细胞死亡;后者是存在于单纯疱疹病毒体内的胸苷激酶基因(HSV-TK)表达的产物能够使无毒性的前药GCV磷酸化为有毒物质,抑制细胞合成,促进细胞死亡。将这些哺乳动物体内没有的基因导入肿瘤细胞加入诱导前药能够诱导细胞死亡。但因为自杀基因没有特异性,可能伤害正常细胞,造成细胞损伤,从而也降低了自杀基因系统的杀伤效率[9, 10]。
针对以上情况,国内外学者进行了许多相关方面的研究,主要有以下几方面措施。第一:将CD和HSV-TK双自杀基因导入来提高基因治疗的效率[11];第二:和其他影响因子相结合协同治疗,比如和生物因子结合或创造缺氧环境,使肿瘤细胞不利于生存[12],来研究肿瘤细胞的生长情况;第三,提高基因治疗的靶向
性,寻求一些在肿瘤细胞中特异性表达的分子标记物,创建一个由相关启动子驱动的载体,将自杀基因导入肿瘤细胞,从而高效地导入靶细胞内,同时避免对正常细胞的误伤[13]。相关的标记物如甲胎蛋白(AFP),人端粒酶催化亚单位(HTERT),血管内皮生长因子(VEGF)等[14, 15, 16]。
凋亡抑制蛋白也是一种肿瘤分子标记物,它由Survivin基因编码。该基因由3个内含子和4个外显子构成,能够编码142个氨基酸,在肿瘤发生发展中有重要作用,能够抑制细胞凋亡,使G2/M期细胞减少,促进细胞有丝分裂,从而促进细胞癌化[17]。通过特异性构建只在肿瘤细胞中高表达的Survivin启动子驱动的表达载体,将其导入人体后能实现只在癌组织细胞的高效表达。一方面,它避免了对正常细胞的杀伤作用,另一方面能实现TK基因在肿瘤组织中的靶向富集,特异高效率地发挥作用。此外自杀基因系统本身具有旁观者效应,对未转染的肝癌细胞也有一定的杀伤作用,能够对这种作用进一步放大。
转染的载体分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然转染效率高,但存在有免疫性,滴度低等缺陷,非病毒载体相对而言无负载限制而且无传染性[18]。作为一种非病毒载体的阳性脂质体Lipofectanfine 2000,能够高效地和带负电荷的DNA分子结合,把目的基因导入到靶细胞[19, 20]。结果表明,随着脂质体转染,将HSV-TK基因特异性导入肝癌细胞,在细胞中基因和蛋白均有显著增加。加入GCV后,伴随着GCV含量的增加,细胞逐渐增殖减弱,凋亡增加。研究说明Survivin启动子介导的载体联合外源药物在体外对肝癌细胞有一定的杀伤作用。
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