2016, Vol. 36文章信息
- 牛纯青, 高香, 罗金华, 李伟, 刘秋萍, 陈韵, 刘堰
- NIU Chun-qing, GAO Xiang, LUO Jin-hua, LI Wei, LIU Qiu-ping, CHEN Yun, LIU Yan
- 重组人死亡受体6胞外结构域的制备及与淀粉样前体蛋白N端片段相互作用鉴定
- Preparation of Recombinant Human Death Receptor 6 Ectodomain and Its Interaction with a Cleaved Amino-terminal Fragment of Human Amyloid Precursor Protein
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(2): 1-6
- China Biotechnology, 2016, 36(2): 1-6
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160201
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文章历史
- 收稿日期: 2015-09-18
- 修回日期: 2015-10-09
2. 重庆市生物技术研究所有限责任公司 重庆 401121
2. Chongqing Research Institute of Biotechnology Co., Ltd, Chongqing 401121, China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。AD在世界范围内已成为继肿瘤、心血管疾病之后居第三位的致死性疾病，目前，AD的发病机制仍不清楚，因而成为研究焦点。淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)与AD的发病机制相关，已经对其进行了广泛的研究[1]。APP在成人大脑中表达并且在受损的轴突中表达上调[2]。死亡受体6(DR6)是由Pan等[3]发现并阐明的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)中的新成员，DR6又称肿瘤坏死因子受体家族21号成员(TNFRSF21)，在成人大脑中高表达，并且在受损的神经元细胞中表达也上调[4]。在研究所有肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员的表达时[5]，作为八名成员之一的DR6拥有胞内死亡结构域，DR6是一个“孤儿”受体[6]，在转染细胞中，它会依赖c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N terminal kinase，JNK)，又称为应激活化蛋白激酶(stress- activated protein kinase，SAPK)触发细胞死亡[3]。在体内它调节淋巴细胞发育[7, 8] ，但其在神经系统发育的作用还未知。
近来有研究报道，在阿尔茨海默氏症中，DR6与神经变性退化密切相关，DR6在神经元分化过程0中大量表达，并使其处于预凋亡状态；在营养因子缺乏的条件下，DR6可调节神经元细胞和神经轴索的退化变性[9]。研究证实，APP和DR6在神经细胞自我毁灭的途径中发挥了作用。在神经营养因子被剥夺的条件下，触发胞外APP的N端部分片段被一种未知分泌酶切割脱落产生APP的N端片段(1-286 AA)(amino-terminal fragment of APP,N-APP)，N-APP可以作为DR6的配体，与DR6结合作用，激活依赖于半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)和半胱氨酸蛋白酶6(caspase-6)的信号通路使神经元胞体凋亡和神经元轴突退化。虽然有研究证明DR6过表达可诱导细胞凋亡[3]，然而，其中具体的机制并不清楚。DR6之所以不同于其它死亡受体，原因之一为其诱导的细胞凋亡不依赖于借助Fas偶联死亡结构域蛋白(FADD)[10]，FADD是大多数死亡受体激活细胞凋亡信号的关键。目前发现，DR6过表达可使B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)转移至线粒体中，这对DR6诱导细胞凋亡至关重要，同时，Bax蛋白表达水平的降低可阻断DR6诱发的细胞凋亡，如聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)裂解产物的生成，caspase的激活，细胞色素C的释放及截短的Bcl-2作用促死亡蛋白(Bcl-2-interacting death agonist，Bid)-tBid的生成[11]。而Bid也并非DR6诱导细胞凋亡过程中的必须环节，tBid的生成仅仅是此生物过程中的产物，证实了DR6诱导的细胞凋亡既非一型细胞程序性死亡，也非二型细胞程序性死亡，DR6过表达的前提下，其与Bax的相互作用可能产生不同于一型或二型的细胞信号传导途径。因此，研究APP如何与DR6作用以及DR6如何传导细胞凋亡信号，也应是突破阿尔茨海默氏症致病机制的关键之一。
关于APP与DR6的相互作用域及相互作用关键残基还完全不了解，这大大阻碍了以N-APP或是以DR6为靶标预防与开发治疗AD新药的进行。前期已从毕赤酵母表达系统获得N-APP片段并观察NAPP对神经母细胞瘤细胞(SHEP)的凋亡作用[12]，本研究应用PCR扩增DR6(42-349aa)目的片段，构建不同的表达载体，表达纯化DR6胞外片段，旨在证明NAPP与DR6的相互作用，为探索AD治疗药物靶标、开发新的治疗药物奠定基础。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒Pichia pastoris整合型分泌表达质粒pPIC9K购自Invitrogen公司；P. pastoris GS115(his4-)甲醇表达宿主菌、克隆宿主菌Escherichia coli Top10，E.coli BL21，质粒 pGEX-6p-1由本实验室保存。pMD-DR6质粒(含DR6全长cDNA,Genebank Ref. ID: NM_014452.3)购于Sino Biological Inc 公司。
1.2 试 剂PrimerSTAR HS DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa 公司，RNAse购自上海生工公司；引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成；质粒小提试剂盒购自天根公司，凝胶回收试剂盒购自BioFlux公司； GST-Tag多克隆抗体(鼠抗)，DR6多克隆抗体(鼠抗)，APP多克隆抗体，羊抗鼠IgG-HRP购自Proteintech公司；PVDF膜购自Milipore公司，X射线胶片购自Kodak公司；Ni-Sepharose FF、Q Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 High Resolution均购自GE Healthcare公司，GST-Sepharose 4B gel购自金斯瑞生物科技公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1.3 重组质粒DR6(42-349)/pPIC9K的构建引物设计及目的基因的扩增：根据DR6全长cDNA序列(Genebank Accession No. NM_014452.3)，选出编码DR6氨基端42-349的序列，经Oligo7.0软件分析，设计引物，上游引物为GGAATTCCAGCCAGAACAGAAGGCCTC(下划线为EcoRI酶切位点),下游引物为DR6(aa42-349)：ATAAGAATGCGGCCGCTTATTAATGATGATGATGATGATGGGATCCTCTTGGAACCAAAATGCTCATTGATGTCAAAAT(下划线为NotI酶切位点)；以pMD-DR6质粒(含DR6全长cDNA)为模板，用上游引物和下游引物进行PCR。
重组载体的构建：将高保真酶扩增的目的基因加A尾后连接19-T载体并转入大肠杆菌保存。用天根质粒小量制备试剂盒从pPIC9K/Top10克隆菌株中提取质粒pPIC9K并浓缩。连接在19-T载体上的目的基因与pPIC9K载体利用NotI、EcoRI分别双酶切，将双酶切回收后的目的基因片段与pPIC9K载体片段以摩尔浓度比3/1加入到PCR管中，加入T4 DNA Ligase后16 ℃连接过夜。将连接物转入E.coli Top10感受态细胞中，利用含有相应抗生素(Amp+Kan)的LB固体培养基进行筛选，经菌落PCR、酶切鉴定的正确DR6(42-349)/pPIC9K大肠杆菌克隆菌株，送至上海英潍捷基贸易有限公司测序，做进一步确认。
DR6(42-349)毕赤酵母表达菌株的构建：将提取的质粒DR6(aa42-349)/pPIC9K，用SalI酶切线性化后，电击法转化GS115感受态细胞。电转完成后涂布RDB平板，RDB平板培养48 h左右，观察到酵母重组转化子的乳白色菌落出现。为了减少假阳性的重组酵母，并能筛选高拷贝转化子，我们将RDB平板上的酵母单菌落进行抗G418筛选，最终通过转化子对G418的抗性水平高低快速筛选出高拷贝转化子。菌落PCR鉴定阳性重组子，获得DR6(aa42-349)毕赤酵母表达菌株。
1.4 酵母工程菌诱导表达与纯化重组蛋白的大量表达 划板活化筛选出的DR6(aa42-349)酵母工程菌菌种，取4ml接种于400ml BMGY培养基中，30℃，290r/min振荡培养约24 h至对数生长期(OD600达2～6)。在超净工作台中静置沉淀酵母细胞4～6 h，弃上清，将酵母细胞以4∶1的比例重悬于100ml BMMY培养基中，30℃,290r/min振荡培养，进行诱导表达。每12 h补加一次无水甲醇至终浓度为0.5%诱导其表达。甲醇诱导60 h后，4 ℃、如12 000r/min离心10min，收集发酵上清。
重组蛋白的纯化 将样品用0.45μm滤膜过滤除去杂质并使用HiTrap desalting column置换缓冲液，使蛋白处于上样缓冲液环境中。使用pH8.0的PBS缓冲液平衡Q-Sepharose FF柱，上样，当样品挂柱后，用含1mol/L NaCl的洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱下来的目的蛋白，进行SDS-PAGE分析检测。收集含有目的蛋白峰的洗脱液，超滤离心管离心，将剩余的浓缩液溶解上样Sephacryl S-200 High Resolution凝胶过滤柱进行层析，用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳分析、Western blot验证。
1.5 pull-down验证DR6与NAPP相互作用 1.5.1 重组pGST-DR6(42-349)载体的构建用天根质粒小量制备试剂盒从pGEX-6p-1/Top10克隆菌株中提取质粒pGEX-6p-1并浓缩。连接在19-T载体上的目的基因与pGEX-6p-1载体利用NotI、EcoRI分别双酶切，将双酶切回收后的目的基因片段与pGEX-6p-1载体片段加入到PCR管中，加入T4 DNA Ligase后16 ℃连接过夜。将连接物转入E.coli BL21感受态细胞中，利用含有相应抗生素(Amp)的LB固体培养基进行筛选，经菌落PCR、酶切鉴定正确的大肠杆菌菌株pGST-DR6(42-349)/BL21，送至上海英潍捷基贸易有限公司测序，做进一步确认。同时将一组空载体pGEX-6p-1导入E.coli BL21感受态细胞作为阳性对照。 1.5.2 GST 融合蛋白诱导表达、SDS-PAGE分析及Western blot检测将转入空载体和表达载体的BL21菌株分别接种于含100μg/ml Amp的LB培养基在37℃摇床培养，然后加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),28℃继续培养2～5h，诱导表达目的蛋白。取少量菌液，4℃ 5 000 r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬菌体，加入20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂后超声破壁裂解。将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃ 12 000 r/min离心10 min，吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮5min。SDS-PAGE电泳分析，并应用GST抗体检测表达情况。
1.5.3 GST-pull down获得pGST-DR6(42-349)/BL21 和pGEX-6p-1/BL21后，分别用IPTG诱导表达收集菌体，菌体经超声破碎分离出上清，按1ml超声破碎上清中加入10μl柱床体积谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(GST-Sepharose 4B gel )的比例，于4℃孵育30～60 min后，将混合液500g 离心5min，预冷PBS 洗涤3次，每次5 min，分别洗去未与球珠结合的GST- DR6(42-349)蛋白或GST蛋白。往纯化的NAPP蛋白溶液中加入干净的GST-Sepharose 4B gel 于4℃孵育30～60 min，去除非特异性，收集上清。结合有GST- DR6(42-349)或GST 蛋白的GST-Sepharose 4B gel 中加入经预处理过的NAPP，于4℃孵育30～60min，取样SDS-PAGE分析、Western blotting 检测，用APP特异性抗体检测DR6-NAPP蛋白结合情况。
2 结 果 2.1 DR6(aa42-349)毕赤酵母表达重组质粒的构建pPIC9K- DR6(42-349)重组质粒的构建图谱如图 1所示。目的基因经PCR扩增，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见约1 000bp的片段，与DR6(42-349)基因预期大小986bp一致(图 2a)。连接在19-T载体上的目的基因与pPIC9K载体利用NotI、EcoRI分别双酶切，胶回收目的片段，与pPIC9K载体连接、转化，从转化连接产物的细菌平板上挑取若干个单克隆，提取质粒，进行NotI、EcoRI双酶切鉴定，结果显示在1 000bp处出现特异条带(图 2b)，与目的片段大小相符。经进一步测序，确定插入片段阅读框和方向正确。
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| 图 1 pPIC9K-DR6(42-349)重组质粒的构建 Fig. 1 Construction of pPIC9K-DR6(42-349)recombinant plasmid |
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| 图 2 DR-6 PCR产物凝胶电泳及重组质粒酶切鉴定 Fig. 2 Gel electrophoresis of DR-6 gene PCR products and identification of recombinant colonies by enzyme digestion (a)1: PCR products of the genes for DR6(42-349) (b)1:Digested recombinant colonies by NotI and EcoRI |
挑取在含3mg/ml G418的RDB平板上生长良好的重组菌株进行PCR鉴定，结果显示P,2,4,6,8,9,11,12,13泳道在1 000bp左右均出现目的条带(图 3)，表明外源基因和酵母染色体发生同源重组，获得了重组酵母菌株。
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| 图 3 阳性重组毕赤酵母菌株PCR鉴定 Fig. 3 Identification of positive recombinants by PCR Marker:DNA Marker; P: Plasmid positive control; N: Negative control; 2,4,6,8,9,11,12,13 positive recombinants |
参照Invitrogen Multi-Copy Pichia Expression Kit，筛选的最适诱导时间为60 h,最适甲醇初始浓度为0.5%，最佳甲醇诱导浓度为1.0%。高拷贝转化子表达条件经初步优化后扩大培养，收集培养基高速离心后收集上清，经0.45μm滤膜过滤，上样Q-Sepharose FF离子交换柱。将收集的目的峰用截留分子量为5kDa的超滤膜进行超滤浓缩，上样Sephacryl S-200 High Resolution凝胶过滤进一步纯化，收集洗脱峰，经SDS-PAGE电泳分析,Western blotting验证，证实该43kDa的蛋白条带为目的蛋白(图 4)。利用bandscan5.0分析目的蛋白纯度,DR6(42-349)的纯度可以达到97%。BCA试剂盒测定目的蛋白浓度DR6(42-349)的蛋白浓度可以达到90 mg/L(表 1)。
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| 图 4 重组蛋白的表达、纯化和鉴定 Fig. 4 Expression,purification and identification of recombinant proteins (a) SDS-PAGE analysis of purified recombinant DR6 Marker: Molecular weight marker; 1:Supernantant of recombinant DR6(aa42-349); 2:Purified protein after Q Sepharose fast flow chromatography; 3:Purified protein after gel filtration of Sephacryl S-200 (b) Analysis of the recombinant protein by Western blot of anit-His 1: Purified protein with his tag preserved in our laboratory as positive control; 2: Recombinant protein DR6(aa42-349) |
| 纯化步骤 | 总体积 (ml) | 总蛋白(mg) | 纯度(%) | 回收率 (%) |
| 培养基上清 Q-Sepharose FF 超滤 Sephacryl S-200 | 200 20 6 12 | 132 38.3 26.2 18 | 29 77 87 97 | 100 29 68.4 68.7 |
表达目的蛋白GST-DR6(42-349) 的大肠杆菌菌株pGST-DR6(42-349)/BL21与表达GST蛋白的菌株pGEX-6p-1/BL21在0.5mmol/L IPTG诱导下表达，结果如图 5a所示。SDS-PAGE结果显示与空质粒相比，含重组质粒的大肠杆菌培养物的超声沉淀中出现75kDa左右的蛋白条带，bandscan5.0分析目的蛋白纯度占总蛋白的15%左右。应用GST抗体检测蛋白表达结果，验证蛋白为目的蛋白(图 5b)。
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| 图 5 GST-DR6重组蛋白的表达检测 Fig. 5 Expression and detection of fusion recombinant proteinGST-DR6 (a) SDS-PAGE analysis of the recombinant protein Marker:Molecular weight marker;1: GST celllysate supernatant; 2: GST-DR6( 42-349)celllysate supernatant (b) Analysis of recombinant protein by Western blot of anti-GST |
结合了GST或者GST-DR6(42-349)蛋白的GST-sepharose 4B gel与NAPP蛋白溶液孵育后，蛋白经SDS-PAGE分离，GST蛋白作为阴性对照，NAPP作为阳性对照，应用APP特异性抗体检测pull-down结果，免疫印迹检测结果证明DR6能够与NAPP相互结合(图 6)。
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| 图 6 免疫印迹分析 GST-pull down Fig. 6 Analysis of pull-down by Western blot of anti-APP |
由于世界范围人口老龄化,AD发病率日益上升,AD的致病机理研究与安全有效的治疗方案的研制与开发面临着巨大的挑战。具有代表性的淀粉样级联假说(即Aβ沉淀理论)，Tau蛋白异常磷酸化以及胆碱能机制假说等研究方向均未能取得突破性进展，并陷入一定程度的研究瓶颈。而“NAPP-DR6”相互作用机制的提出提供了AD致病机制研究的一个新的方向。
毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点，又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能，因此我们首先设计了应用毕赤酵母表达系统表达人DR6重组蛋白以及利用pull down技术验证得到的重组DR6与NAPP相互作用关系的实验。成功构建了毕赤酵母pPIC9K-DR6真核表达载体，将构建好的表达载体电击导入毕赤酵母，得到了DR6的表达菌株，并实现了目的蛋白DR6的高效分泌表达。遗憾的是，使用镍柱纯化时，由于目的蛋白后期折叠过程中可能将his标签掩埋，经过一定手段的处理后蛋白的挂柱效果仍不理想，因此无法利用pull down技术验证DR6与NAPP的体外相互关系。
为了验证DR6与NAPP的体外相互关系，构建了pGST-DR6(42-349)原核表达载体，并导入E.coli BL21菌株，同时将一组空载体pGEX-6p-1导入E.coli BL21感受态细胞作为阳性对照。得到了DR6的表达菌株，成功诱导表达目的蛋白GST-DR6。通过GST-Sepharose 4B gel纯化目的蛋白GST-DR6，同时，应用实验室已经构建好的表达NAPP蛋白的重组菌株，表达并纯化，得到具有活性的NAPP，进行pull down实验。结合了GST或者GST-DR6(42-349)蛋白的GST-sepharose 4B gel与NAPP蛋白溶液孵育后，蛋白经SDS-PAGE分离、Western blot检测，结果证明DR6能够与NAPP相互结合。
成功构建pPIC9K-DR6和pGST-DR6两种表达质粒，酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在GS115工程菌中表达并纯化大量重组蛋白，重组蛋白浓度达90 mg/L，为接下来的实验打下了坚实的基础。在BL21工程菌中成功表达了GST和重组蛋白GST-DR6，通过GST pull down的方法为DR6与NAPP蛋白的相互结合提供体外实验证据，为探究DR6与NAPP的结合位点奠定了基础。
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